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成年与新生儿VAP病人下呼吸道分泌物病原菌比较
目的 比较重症监护室(ICU)中成年与新生儿呼吸机相关性肺炎(VAP)病人下呼吸道分泌物病原菌的特点.方法 分别于我院综合ICU和新生儿ICU病房中选取确诊VAP病人85例和37例,采集其下呼吸道分泌物.采用分离培养及多重PCR检测的方法,确定不同病人病原菌的分布特点.结果 成年VAP病人标本常规分离培养21例检出致病菌,阳性率为24.7％;VAP新生儿标本常规分离培养7例检出致病菌,阳性率为18.9％,两者比较差异无统计学意义(P＞0.05).成年VAP病人培养出的G菌占85.7％(18/21),新生儿培养出的均为G-菌.成年VAP病人多重PCR检出致病菌69例,阳性率为81.2％;VAP新生儿多重PCR检出致病菌12例,阳性率为32.4％,两者比较差异有统计学意义(x 2=27.45,P＜0.05).成年VAP病人多重PCR检出的G-菌占89.9％(62/69),其中占首位的是大肠杆菌(23.5％,20/85),其次为鲍氏不动杆菌(17.6％,15/85)、肺炎克雷白杆菌(17.6％,15/85)、铜绿假单胞菌(14.1％,12/85);新生儿多重PCR检出的G-菌占91.7％(11/12),其中占首位的是大肠杆菌(24.3％,9/37),其次为鲍氏不动杆菌(2.7％,1/37)、肺炎克雷白杆菌(2.7％,1/37).结论 成年VAP病人下呼吸道分泌物病原菌检出阳性率较VAP新生儿高,前者存在混合感染的现象,后者则以大肠杆菌感染为主.两组VAP病人下呼吸道分泌物检测结果均以G-菌为主,多重PCR检测阳性率高于分离培养,可以作为分离培养的有利补充.
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多重PCR快速检测5种重要致病性弧菌
目的 建立一种快速检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌5种重要致病性弧菌的多重PCR方法.方法 以霍乱弧菌ompW基因、副溶血性弧菌toxR基因、创伤弧菌vvhA基因、拟态弧菌VMH基因和溶藻弧菌gyrB基因为靶基因设计特异性引物,优化建立多重PCR反应体系,系统评价其特异性和检测下限值.结果 成功构建致病性弧菌多重PCR检测方法.评价结果显示其特异性为100％,霍乱弧菌、副溶血性弧菌和拟态弧菌的检测下限值为100 CFU/ml,创伤弧菌和溶藻弧菌的检测下限值为1 000 CFU/ml;多重PCR的弧菌检出率明显高于传统分离培养方法(56％ vs 17％).结论 该多重PCR方法快速、灵敏、特异性好,可用于海环境和水产品中致病性弧菌的监测.
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一起由宋内志贺菌引起食物中毒的病原菌检测分析
目的 通过实验室检测分析一起食物中毒的病原菌.方法 按GB/T 4789.36-2008、GB 4789.4-2010、GB4789.10-2010、GB 4789.5-2012《食品安全国家标准食品微生物学检验》中的方法,对24份患者吃剩的食物、12份患者大便进行肠出血性大肠埃希菌O157:H7、沙门菌、金黄色葡萄球菌、志贺菌的分离培养及生化鉴定;同时采用多重PCR检测技术对24份患者吃剩的食物进行以上项目的检测.并对检出的志贺菌菌株进行血清凝集试验、药敏试验和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型.结果 24份患者吃剩的食物中检出宋内志贺菌1株,12份患者大便中检出宋内志贺菌8株,9株宋内志贺菌PFGE基因图谱相似性系数≥0.98.结论 由宋内志贺菌Ⅰ相导致了这起食物中毒的发生.建议各级卫生监督部门要加大监督检查力度,从而减少食物中毒的发生,切实保障儿童身体健康.
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2014年邢台市流行性感冒后期发热呼吸道症候群的病原学研究
目的 了解2014年邢台市流感流行后期发热呼吸道症候群的病原谱构成情况,为临床诊断治疗和预防提供依据.方法 采用多重PCR方法检测发热呼吸道症候群患者咽拭子标本中的12种病毒和6种细菌,并进行统计学分析.结果 148例发热呼吸道感染患者中相关病原体检测阳性65例(43.92％),包括病毒感染53例(35.81％),细菌感染26例(17.57％),混合感染14例(9.46％).鼻病毒、呼吸道合胞病毒A和甲型流感病毒居病毒感染的前3位.流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和肺炎支原体居细菌感染的前3位.病毒混合感染5例,病毒、细菌混合感染8例,细菌混合感染1例.0～岁组感染的病原种类多,感染率也高.结论 2014年邢台市流感流行后期发热呼吸道症候群感染以鼻病毒和呼吸道合胞病毒A、甲型流感病毒和流感嗜血杆菌为主,并伴有混合感染.
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水产品中常见5种致病菌的多重PCR-DHPLC快速检测方法的建立
目的 建立水产品中5种常见致病菌的快速高分辨检测手段,提高检测的效率和准确性.方法 筛选沙门菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌的特异基因,通过参阅文献和自行设计,分别确定invA、nuc 、pfA、tlh、owpW为检测基因,优化引物浓度和引物组合,进行多重PCR扩增,产物经DHPLC进行快速检测.优化确定的方法通过重现性试验,特异性试验,灵敏度试验,以及人工污染水产品样品的检测.结果 DHPLC检测出峰顺序依次为invA、nuc、prfA、tlh、owpW,扩增片段大小为284 bp、329 bp、388 bp、450 bp、588 bp,此方法具有良好的重现性和特异性,灵敏度分别可达188 CFU/ml、670 CFU/ml、280 CFU/ml、240 CFU/ml、580 CFU/ml,不同水产品的状态、成分以及增菌液类型对后续检测不存在影响.结论 本方法可以很好的满足实际食品微生物检测的要求.
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Y染色体短串联重复序列基因座荧光复合扩增体系的法医学应用
目的 探讨Y染色体DYS456、DYS464、DYS527、DYS531、DYS709、DYS448和DYS522共7个短串联重复序列(STR)基因座(相当于11个位点)荧光复合扩增体系在法医学中的应用价值.方法 提取法医学应用中生物检材的基因组DNA,复合扩增7个Y-STR基因座,然后采用毛细管电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测扩增产物.结果 盲测试验结果正确;可作为"人"与"非人"的种属特异性检测工具;用同一个体不同组织所获得的分型结果一致;调查同一父系家庭的男性成员样品,未观察到变异;对强奸案混合斑的分析,可直接检出7个Y-STR基因型,协助确定嫌疑人.结论 荧光复合扩增Y染色体7个STR基因座方法可靠,对混合斑和微量检材中男性DNA的分析具有较高的应用价值.
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检测PCV2、PPV、PRV疫苗株与野毒株的多重PCR方法
本文建立了一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、细小病毒(PPV)、及伪狂犬病毒(PRV)疫苗株与野毒株的多重PCR方法.根据GenBank上发表的PCV2、PPV和PRV gB、gE基因序列,针对各自保守区各设计一对特异性引物,用这四对引物对同一样品中的PCV2、PPV和PRV gB、gE进行检测,结果可同时扩增出269bp(PCV2)、581bp(PPV)、372bP(PRV gB)及147bp(PRV gE)四条特异性片段.对JEV、PRRSRV、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR能检出10pg PCV2、PPV和PRV gB、gE检测敏感度分别为10-6.2、10-3.8、10-5.8TCID50的模板.该方法的建立对临床上进行这三种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测具有重要意义.
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多重聚合酶链反应在α-珠蛋白生成障碍性贫血诊断中的应用
目的探讨应用多重聚合酶链反应（PCR）技术在缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血（HbH）患者基因类型快速诊断中的价值。方法选择沈阳医学院奉天医院2006年1月至2012年1月收治入院，采用多重PCR进行HbH检测的疑似HbH患者202例的临床资料进行回顾性分析，并对样本进行基因类型测序及血液实验学参数分析。结果本研究中疑似为HbH的202份临床标本，基因检测证实其中136例为HbH。与PCR检测相比，一管法红细胞脆性、平均红细胞容积、平均红细胞血红蛋白含量与红细胞分布宽度变异系数检测的灵敏度分别为85．29％、99．44％、73．53％和61．03％，特异性分别为69．70％、66．67％、62．12％和60．61％。在136例HbH患者中--SEA/αα104例、-α3．7/αα14例、-α4．2/αα4例、-α3．7/--SEA11例和-α4．2/--SEA3例，分别占76．47％、10．29％、2．94％、8．09％和2．21％。结论多重PCR方法能快速检测HbH基因型，尤其是HbH的双重HbH基因型，操作简便，结果准确，可应用于临床HbH的基因型检测，尤其适用于大规模人群的HbH基因型筛查。
关键词： 多重聚合酶链式反应 α-珠蛋白生成障碍性贫血 基因类型 诊断 -
多重PCR筛选广西壮族人群稀有血型Fy(a-)、s-、k-、Di(b-)、Js(b-)
目的 通过分子生物学方法,筛选广西壮族随机献血者样本中的Fy(a-)、s-、k-、Di(b-)、Js(b-)表型,获得壮族稀有血型资料,丰富中国稀有血型库.方法 基于血型抗原Fyb、s等位基因单核苷酸多态性位点,设计序列特异性引物,优化PCR条件,建立多重PCR体系Ⅰ;并使用筛选稀有血型等位基因Dib、k、Jsb1910、Jsb2019多重PCR体系Ⅱ共同对4490份广西壮族随机献血者样本进行筛选.结果 成功构建检测血型抗原Fyb、s的多重PCR体系Ⅰ,经验证多重PCR体系Ⅰ具有良好的准确度和稳定性.使用多重PCR体系Ⅰ和Ⅱ在4490份广西壮族随机献血者样本中共检出5例Fy(a-),3例s(-)及2例Di(b-).结论 多重PCR能够用于稀有血型的大规模筛选,获得的广西壮族人群稀有血型样本丰富了稀有血型数据库,为临床输注配合性血液提供了宝贵资料.
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6种常见脑炎病毒多重PCR检测体系的建立和应用
目的 建立单纯疱疹病毒1(HSVⅠ),2型(HSVⅡ)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、肠道病毒71型(EV71)及巨细胞病毒(CMV)的多重聚合酶链式反应(mPCR)体系.方法 对 HSVⅠ,HSVⅡ,VZV,EBV,EV71及CMV设计特异引物,建立mPCR检测方法,并进行敏感性验证.收集2014~2015年在苏州大学附属第一医院收治的15例临床疑似病毒性脑炎(VE)患者脑脊液(CSF)标本,采用 mPCR体系进行核酸检测.结果 6对引物特异性扩增六种病毒,构建的mPCR体系敏感度超过103copies/μl;该 mPCR 体系对15例临床脑脊液标本进行检测,共6例阳性标本(6/15, 40%),其中 HSVⅠ5例,CMV 1例.结论 初步建立了一种能够同时筛查6种常见脑炎病毒的mPCR方法.
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环介导等温扩增法检测人乳头瘤病毒16、18的应用研究
目的：环介导等温扩增技术检测人乳头瘤病毒 HPV16、18的应用研究。方法：收集宫颈癌行HC‐Ⅱ‐HPV检测标本高危型的47例，低危型34例。阴性对照20例，分别利用环介导等温扩增（LAM P）方法和PCR方法进行检测，并对检测结果进行比对分析。结果：HC‐Ⅱ‐HPV筛查的高危组标本中，LAMP检出HPV16和HPV18的阳性率分别是37％和6％，均高于PCR的31％和4％，在HC‐Ⅱ‐HPV筛查的低危组标本中，LAMP法和PCR法均有高危型别的检出。LAMP法略优于PCR法，二者比较无统计学差异（P＞0．05）。结论：LAMP法在HPV高危型16、18的筛查中与PCR法无差异，然而LAMP法是更经济、便捷的HPV16、18亚型筛查方法。
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快速鉴定B群链球菌及检测其耐药性方法的建立和初步应用
目的 建立快速鉴定B群链球菌(group BStreptococcus,GBS)的同时检测其对克林霉素、红霉素耐药基因的多重PCR方法,并初步应用.方法 建立多重PCR方法,同时扩增以下4个基因位点:GBS编码CAMP因子的基因cfd、大环类脂类耐药基因ermB和mefA/E、克林霉素耐药基因linB.对该方法的引物质量浓度、Taq酶量和退火温度进行优化,确定多重PCR适反应体系及低检测限;将该方法用于91株GBS临床菌株的鉴定及其耐药性的检测,并评价其与常规PCR方法结果的一致性.结果多重PCR的适反应体系,总量25 μL:多重PCR mix212.5 μL、多重PCR mix1 Taq酶0.23 μL、linB-F和linB-R引物0.4μmol/L、mefA/E-F和mefA/E-R引物0.2μmol/L、ermB-F和ermB-R引物0.12 μmol/L、cfd-F和cfb-R引物0.08 μmol/L、DNA 10 ～100 ng、不足量补入无菌去离子水.扩增程序为:94℃预变性60 s;94℃变性30 s、53℃退火90 s、72℃延伸30 s,共30个循环;72℃延伸10 min.低检测限为20 pg/μL.多重PCR方法与常规PCR方法检测91株GBS临床菌株,cfd基因结果一致率为100％,ermB、mefA/E和linB基因的Kappa值分别为0.938、0.956和0.935.结论 建立的以GBScfb、ermB、mefA/E和linB基因为检测位点的多重PCR方法,可在鉴定GBS的同时检测其对克林霉素、红霉素的耐药性.
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多重PCR-毛细管电泳法检测Y染色体微缺失
目的:对多重PCR-毛细管电泳法检测Y染色体微缺失进行评价.方法:选择Y染色体无精子因子(AZF)区域的15个序列标签位点(STS),设计特异性的引物,分成4个不同的多重PCR体系.首先提取临床外周全血样本的基因组DNA.将样本的DNA分别加入到4个不同的PCR体系中进行扩增.将获得的目的DNA片段进行毛细管电泳,并根据预设的AZF marker计算出各检测位点的碱基长度,然后分析临床样本的Y染色体微缺失情况.结果:该方法能够准确检测出临床样本的Y染色体AZF a区域缺失、AZF b区域缺失和AZF c区域缺失等缺失;检测限约为3 ng·反应-1;正常男性临床样本的检测结果是均未发生Y染色体微缺失;在210例无精子症和少精子症患者中,该方法能够准确检测出19例AZF区域微缺失,包括AZF a区域缺失1例,AZF b区域缺失2例,AZF c区域缺失13例,AZF bc区域缺失1例和AZF abc区域缺失2例.结论:多重PCR-毛细管电泳法具有很好的临床适用性,在临床上可以用于Y染色体微缺失检测,为临床遗传咨询提供建议.
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隐匿管状线虫分子鉴定和国内实验动物感染调查
目的:对无特定病原体(specific pathogen-free,SPF)和清洁级实验动物隐匿管状线虫进行分子鉴定和感染调查,为实验动物国家标准的修订提供参考依据.方法:4 649只SPF实验动物(包括小型猪25只,猴5只,兔40只,地鼠296只,豚鼠186只,大鼠438只,小鼠3 629只,鸡25只,鸭5只)和1304只清洁级实验动物(包括兔3只,地鼠26只,豚鼠147只,大鼠229只,小鼠897只)来自全国不同的厂家.应用直接镜检实时动态显微视屏摄录技术,对实验动物的隐匿管状线虫进行筛查.应用多重聚合酶链式反应(PCR)和测序技术,鉴定分离自实验动物的隐匿管状线虫cox 1(细胞色素C过氧化物酶亚基1)、cyt b(细胞色素b)、nad 1(NADH脱氢酶亚单位1)、nad 5(NADH脱氢酶亚单位5)、rrnL(核糖体RNA大亚基)和28S rRNA(28S核糖体RNA)基因,从分子水平上确证隐匿管状线虫感染.结果:应用直接镜检实时动态显微视屏摄录技术,从实验动物中检出数量众多隐匿管状线虫的虫卵、幼虫和成虫.根据隐匿管状线虫的卵细胞、幼虫、雌雄成虫的大小和形态来鉴定虫种.应用多重PCR测序技术,能从分离自实验动物的单个隐匿管状线虫的虫卵、幼虫和成虫中鉴定出cox1、cyt b、nad 1、nad 5、rm L和28S rRNA基因,与其他不同种属的寄生虫无交叉反应.在研究中,通过对确定的阳性样本测序保证了引物的特异性,探究了隐匿管状线虫分离株间核苷酸的可变性,排除了可能由于鼠管状线虫和四翼无刺线虫造成的假阳性结果.应用直接镜检实时动态显微视屏摄录技术,从4 649份SPF实验动物和1304份清洁级实验动物样本中分别检出隐匿管状线虫阳性样本96份和35份.应用多重PCR和测序技术,鉴定证明这些阳性样本中确实含有隐匿管状线虫特异性的DNA.测序结果显示,自不同SPF实验动物和清洁级实验动物分离获得的隐匿管状线虫的cox 1、cyt b、nad 1、nad 5、rm L和28srRNA部分基因序列核苷酸相似性达100％.SPF实验动物和清洁级实验动物的隐匿管状线虫感染率分别为2.1％和2.7％.结论:应用直接镜检实时动态显微视屏摄录技术联合多重PCR测序技术能够快速精准检测鉴定出隐匿管状线虫.实验动物常会感染一些人兽共患寄生虫,隐匿管状线虫的人兽共患本质可以视作为公共卫生的一个预警.本研究首次对中国SPF和清洁级的实验动物隐匿管状线虫进行了分子鉴定和感染调查.
