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缺氧对星形胶质细胞表达P450 2c11表达mRNA的影响
应用细胞培养、免疫组化、逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术,观察缺氧和/或谷氨酸对体外培养的星形胶质细胞表达细胞色素P450 2c11mRNA的影响,探讨大脑星形胶质细胞在缺氧性脑血管扩张反应中的作用.实验用新生2-3 d Wistar大鼠,取双侧大脑皮层组织进行星形胶质细胞原代培养.细胞长成单层后,传代,将第二代细胞经抗GFAP免疫组化鉴定后,随机分为4组:①对照组;②谷氨酸组;③缺氧组;④缺氧+谷氨酸组.每一组包括5个时相点:0h、3h、6h、12h、24h(以缺氧后开始记时).于②和④组加入100μmol/L的L-谷氨酸.③和④组用95%N2/5%CO2进行缺氧.到规定时间后,提取细胞总RNA,进行TR-PCR扩增,电泳,凝胶扫描,测定产物积分光密度.结果:1.对照组和缺氧组各时相点星形胶质细胞P450 2c11 mRNA的表达量无显著差异.2.谷氨酸组P450 2c11 mRNA 6h开始显著增高,以后更为显著(24h内).3.缺氧+谷氨酸组P450 2c11 3h开始显著增高,以后更为显著(24h内).4.缺氧+谷氨酸组增高的幅度显著高于谷氨酸组.结论:谷氨酸可促使体外培养的星形胶质细胞P450 2c11 mRNA表达增多.单纯缺氧对体外培养的星形胶质细胞P450 2c11 mRNA表达无显著影响,但可使谷氨酸对星形胶质细胞P450 2c11 mRNA表达的上调作用增强.这一结果提示,缺氧和谷氨酸协同作用,使P450 2c11 mRNA表达增强,后者催化化生四烯酸生成环氧二十三烯酸,这可能是缺氧性脑血管扩张的重要机制之一.
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人乳头瘤病毒感染基因亚型分析
目的 分析HPV各基因亚型感染情况,探讨HPV亚型感染与宫颈病变的关系.方法 应用美国Digene公司杂交捕获法(Hybrid Capture Ⅱ,HC Ⅱ)对我院宫颈疾病专科门诊病例进行高危型HPV筛查,从中随机抽取213例阳性标本应用PCR结合反向寡核苷酸探针斑点杂交技术(reverse dot blot,RDB)进行HPV基因亚型分析.结果 213例HC Ⅱ法检测为高危型HPV阳性的标本中被PCR/RDB法检测出具体HPV高危型别的有195例.共检测出17种HPV型别(包括高危型13种和低危型4种).具体HPV亚型检出率分别是16型(32.3%)、52型(23.1%)、58型(18.0%)、31型(11.8%)、68型(10.3%)、33型(9.7%)、53型(8.2%)、18型(8.2%)、66型(6.2%)、CP8 304型(4.6%)、6型(3.6%)、59型(3.1%)、4 5型(2.1%)、39型(2.1%)、11型(2.1%)、56型(1.5%)、51型(1.0%).单一HPV亚型感染及2种、3种和4种HPV亚型混合感染检出率分别为59.5%、30.8%、8.6%和1.1%.结论 高危型HPV感染检出率高的HPV亚型为HPV16型(32.3%),其次为HPV52型(23.1%),检出率低的两种亚型分别是HPV56型(1.5%)和HPV51型(1.0%).HPV58型这种世界范围内少见的一种高危型HPV在中国高危型HPV感染的患者中检出率(18.0%)却并不低.单一高危型HPV亚型感染是引起宫颈病变的主要原因,而多种HPV亚型混合感染在宫颈病变中的作用也不可忽视.
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nm23参与α粒子辐射致大鼠气管上皮细胞恶性转化的原发过程
目的:克隆α粒子辐射致细胞恶性转化相关基因.方法:采用mRNA差异显示技术识别原代大鼠气管上皮细胞同由α粒子辐射诱发恶转的大鼠气管上皮细胞之间的差别表达基因.结果:共克隆到15个可能同α粒子辐射致细胞恶性转化相关的差异表达基因片段(ESTs),共向GenBank登录7条新基因序列.其中克隆ZC66同肿瘤转移抑制基因nm23高度同源,经Northerm杂交证实其在恶转的大鼠气管上皮细胞中高表达,序列分析提示nm23在此恶转细胞中存在突变.结论:上述结果为进一步深入研究辐射致癌提供了线索,并提示nm23基因可能参与α粒子辐射致大鼠气管上皮细胞恶性转化的原发过程.
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编码霍乱肠毒素B亚单位基因植物表达载体的构建
目的构建含霍乱肠毒素B亚单位(CTB)基因的植物双元表达载体.方法采用高保真PCR方法调出CTB基因,定向克隆到中间载体pRTL2,经测序证实核酸序列正确后,再亚克隆到含植物双元表达载体pBI121上;采用电击法,将含CTB的植物表达载体转入根癌农杆菌中,并进行酶切证实.结果PCR扩增的CTB片断亚克隆到中间载体,得到pRCTB和pRCTBK,测序证实CTB核酸序列正确;再与根癌农杆菌双元载体pBI121连接,获得含CTB基因的植物双元表达载体pBI-CTB和pBI-CTBK,转入根癌农杆菌的载体,酶切证实正确.结论采用正确技术路线,构建了含CTB基因的植物表达载体,为下一步的转基因植物表达研究打下了坚实的基础.
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新生儿成熟度对免疫球蛋白重链可变区基因重排多样性的影响
目的:分析不同胎龄新生儿免疫球蛋白重链可变区(IgH)基因序列特征,探讨新生儿成熟度对其多样性的影响.方法:10例极不成熟儿、12例不成熟儿和11例成熟儿的脐血淋巴细胞DNA被抽提,IgH基因被扩增、克隆和测序.结果:极不成熟儿和不成熟儿优先使用VH1和VH3,成熟儿的VH3使用率下降;所有新生儿中,JH3和JH6使用率较高.极不成熟儿、不成熟儿和成熟儿的NDN长度分别为(13.5±7.2)、(16.8±6.5)和(22.3±7.2)bp,体突变率分别为15.8%、23.6%和29.5%,均为点突变.极不成熟儿、不成熟儿和成熟儿中,分别78.3%、84.7%和92.4%的克隆有开放性阅读框.结论:新生儿的VH-D-JH重排机制已处于活化状态但多样性有限,不同成熟度新生儿的IgH基因存在异型性,表明体液免疫系统的发育是一个渐进的过程.
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早孕期阴道镜图像对人乳头瘤病毒感染的研究
目的 研究早期妊娠对阴道镜图像和人乳头瘤病毒(HPV)感染的影响与关系.方法 对宫颈糜烂组宫颈细胞学检查正常的130例早孕妇女行阴道镜检查.宫颈组织HPV、DNA采用多聚酶链式反应检测,询问病史及有关问题;并将90例非孕期妇女作对照.结果 早孕组阴道镜图像正常者占84.6%,非孕组占50.0%,x2=3.95,P＜0.05,差异有统计学意义.早孕组宫颈糜烂的正常阴道镜图像由柱状上皮细胞所致者与非孕组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).早孕组HPV感染10例(7.7%),非孕组15例(16.7%),x2=0.27,P＜0.05,差异无统计学意义.HPV阳性患者阴道镜图像多有异常.结论 本组早孕期宫颈糜烂者的正常阴道镜图像由柱状上皮细胞所致者较非孕组多,未发现早孕期HPV感染增多,阴道镜图像异常出现率与产次及HPV感染呈正相关.
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人角化上皮生长因子基因(hKGF)达载体对大鼠肺泡Ⅱ型细胞增殖的影响
目的:构建人角化上皮生长因子基因真核表达载体pEGFP-C2-hKGF,为以后的hKGF基因功能和基因治疗研究提供实验材料.方法:提取人胚肺成纤维细胞(HLF)总RNA,逆转录酶-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增hKGF基因全长cDNA序列,经与pMD18-T载体连接、筛选、克隆、抽提质粒和双酶切后,将纯化的hKGF基因cDNA全长序列插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C2中,筛选、克隆、抽提质粒,从而构建hKGF基因真核表达载体pEGFP-C2-hKGF.载体转染后大鼠肺泡Ⅱ型细胞进行免疫细胞化学及荧光显微镜鉴定,并进行细胞记数,绘制生长曲线.结果:经RT-PCR获得609bp含限制性内切酶位点的DNA片段,T载体克隆后经双酶切、测序,确定该片段为hKGF基因cDNA,进而构建hKGF真核表达载体pEGFP-C2-hKGF,经双酶切,测序确证.转染载体后,有hKGF的阳性表达并随时间逐渐增加,大鼠肺泡Ⅱ型细胞也随时间出现明显分裂增殖.结论:成功构建hKGF基因真核表达载体pEGFP-C2-hKGF,为进一步应用于基因治疗研究提供工具.
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定量PCR技术研究进展
80年代中期,美国Cetus公司首创一种DNA扩增技术--多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)[1],用于人类遗传病的研究,这一技术能使pg水平的核酸在短时间内达到ng水平量而被检出.近年来还发展了其他体外核酸扩增技术,如连接酶链式反应(ligase chainreaction,LCR)、转录依赖的扩增系统(transcription-based amplification system,TSA)、核酸序列复制系统(nucleic acid sequence based amplification,NASBA)和核酸序列自主复制系统(self-sustained sequence replication,3SR)等[2,3],其中以PCR为简便易行,已被广泛应用于传染病病原学的诊断.
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PCR结合地高辛标记探针杂交检验乙型肝炎病毒C基因启动子
应用聚合酶链式反应结合地高辛标记探针杂交方法检测乙型肝炎病毒C基因启动(HBV.CP).对聚合酶链反应(PCR)法扩增的HBV DNA直接测序进行DNA同源性分析.并运用探针杂交对结果进行进一步鉴定:应用PCR法扩增20份患者血清,阳性率达95%(19/20),同时运用探针杂交进行进一步检验,与PCR结果符合率达90%以上,并选择中度、重度乙肝患者血清和pGEM.7Z -HBV质粒扩增的HBV.CP各一份分别进行测序,与报告基因的同源性分别为72%、66.5%、90 %.建立了特异敏感的检测乙型肝炎病毒C基因启动子(HBV.CP)的PCR方法,可用于HBV基因变异规律的研究.同时初步的研究结果表明,肝炎病人的HBV.CP区存在较多的变异,可能与病情轻重有一定的相关性.
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免疫酶斑点法检测HIV-1 DNA
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)在艾滋病毒感染的诊断、检测中起着重要的作用[1].为了确认PCR扩增的片段,常采用放射性标记的核酸探针对扩增产物进行Sorthern杂交.近年来采用生物素、地高辛等非放射性标记物的技术得到了广泛应用[2].本文介绍了用生物素标记HIV-1 DNA的扩增产物,然后用免疫酶斑点法(immuno enzyme dot assay, IEDA)直接检测扩增产物的方法.
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从鼻咽癌患者咽拭子中扩增EB病毒DNA
EB病毒(Epstein - Barr Virus )是由Epstein和Barr发现的一种人类疱疹病毒，近年来的研究表明EB病毒与低分化鼻咽癌、Burkitt's淋巴瘤、Hodgkin's病、胃癌等恶性肿瘤的发生有较密切的关系〔1〕，EB病毒与肿瘤的相关性研究已经成为当前肿瘤病因学研究中的热点。本文采用多聚酶链反应(PCR)从5例鼻咽癌患者咽拭子中扩增出EB病毒DNA，现报告如下。1 材料与方法1．1 材料鼻咽癌患者咽拭子由昆明医学院附属第二医院提供。DNA提取试剂盒为QIAGEN公司的QIAamp Tissue Kit。EB病毒DNA，PCR检测试剂盒为上海复星高科技公司产品。其它试剂均为分析纯；所有溶液用双蒸水配制
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用PCR技术检测鄂温克族3种基因的多态性
克族仅有近20 000人,主要聚居于我国东北地区,少数居住于黑龙江省.近几年随着分子生物学的快速发展,对人类健康群体的研究不断深入.国内外有报道关于不同人种、不同区域、不同民族的多种基因位点多态性分布,但关于鄂温克族却未见报道.我们采用PCR-RFLP和PCR-SSP法研究了鄂温克族3个基因位点:红细胞CR1(CD35)基因、血管紧张素转换酶(ACE)基因和HLA-DQA1基因的多态性分布,并与汉族、蒙古族做了比较分析.
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miR-144-3p分子在胶质瘤中的表达
目的 本文研究了小分子核糖核酸-144-3p (miR-144-3p)分子与胶质瘤发生发展的相关性.方法 本实验所需胶质瘤组织均来自于西京医院神经外科胶质瘤患者,共50例;利用人源神经元细胞系HCN-2(human cortical neuron-2,HCN-2)、U251胶质瘤细胞系、U87MG胶质瘤细胞系等.通过细胞培养及miRNA转染,细胞及组织RNA提取,反转录多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),实时定量PCR对miR-144-3p分子在胶质瘤中的表达进行检测.结果 miR-144-3p分子在人和小鼠染色质定位高度保守;miR-144-3p分子在胶质瘤患者不同组织中的表达差异;miR-144-3p分子在不同病理学分级胶质瘤中的表达差异;miR-144-3p分子在不同人源胶质瘤细胞系中的表达差异,其表达量与患者预后相关性.结论 miR-144-3p分子在哺乳动物中高度保守,与患者的预后有关.
关键词： 胶质瘤 小分子核糖核酸-144-3p 多聚酶链式反应 -
宫颈癌组织表皮生长因子受体对TKI敏感性相关的基因突变研究
目的 研究宫颈癌组织表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因中是否存在与EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)药物敏感性相关的18、19及21外显子突变,为本地区宫颈癌的靶向治疗提供依据.方法 收集70例宫颈癌患者的新鲜癌组织标本,提取DNA,以特异性引物PCR扩增EGFR基因外显子18、19及21,进行DNA测序并分析序列相似性.结果 70例宫颈癌组织提取质量良好的DNA中,均未检测到EGFR基因18、19及21外显子突变.结论 宫颈癌组织EGFR基因外显子18、19及21突变罕见.
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性发育异常患者SRY基因的检测与分析
性别发育异常直接影响患者的身心健康,长期以来一直是医学遗传学、优生学研究的重点,而人类Y染色体上性别决定基因(sex-determining region gene on Y,SRY)的发现则使性发育异常的病因学研究取得了重大突破.我们对3例典型患者进行了SRY基因序列的检测,结合染色体核型分析、组织病理学检查,明确其性分化异常类型,并分析可能的性发育异常病因,为临床的诊断与治疗提供参考.
