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含密码子优化型HPV16 L1基因重组腺病毒的构建及其免疫效果的研究
目的 构建含密码子优化型HPV16L1基因的重组腺病毒,对其经不同接种途径所诱导的系统性及黏膜免疫效果进行研究.方法 使用Admax系统包装重组腺病毒,纯化的腺病毒以不同方式免疫C57BL/6小鼠,间接ELISA及体外中和实验检测免疫小鼠血清及阴道分泌物中的特异性抗体.结果 重组腺病毒滴鼻接种可同时诱导特异性的系统性及黏膜免疫反应,重组腺病毒肌注免疫仅能诱导系统性免疫反应,而阴道黏膜接种不能有效诱导系统性及黏膜免疫反应.结论 成功构建了含密码子优化型HPV 16 L1基因的重组腺病毒,重组腺病毒肌注可诱导高滴度的血清中和抗体,滴鼻接种可同时诱导特异性的系统性及黏膜免疫反应.
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人类乳头状瘤病毒分型检测在宫颈癌筛查中的临床研究
目的 探讨人类乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)基因分型检测在宫颈病变诊断中的临床应用价值.方法 选取2010年1月至2012年12月在北京大学第一医院妇产科就诊的1715例患者作为研究对象,所有患者均行宫颈脱落细胞学检查、HPV分型检测及阴道镜检查下行多点活检,并终经组织病理学检查诊断为宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN).分析HPV分型检查在宫颈癌筛查诊断中临床应用价值.结果 1715例CIN患者HPV检出率排名前五位的依次是HPV16、58、52、33、31;CIN2+(包括CIN2/CIN3/原位腺癌/宫颈癌,以下简称CIN2+)患者中前五位依次是HPVI6、58、33、52、31;其中CIN2+中细胞学未见上皮内病变细胞和恶性细胞(negative for intraepithelial lesion or malignancy,NILM)患者中,Logistic回归分析结果显示HPV16、33和18型阳性致CIN2+风险性较大,回归系数OR分别为5.031(P=0.000)、2.375 (P=0.000)和1.598(P =0.027).宫颈脱落细胞学为非典型鳞状上皮细胞(atypical squamous cells of undetermined significance,ASCUS),伴随HPV16、58型阳性,发生CIN2+风险性较大,回归系数OR分别为5.139(P=0.000)和2.096(P=0.025).宫颈脱落细胞学为低度鳞状上皮内病变(low squamous intraepithelial lesion,LSIL),伴随HPV16、33、52型CIN2+风险性较大,回归系数OR分别为5.774(P =0.000)、3.368(P =0.000)和1.747(P=0.034).结论 HPV分型检测在宫颈癌筛查中具有重要作用,是指导细胞学阴性、ASCUS和LSIL患者临床处理时的重要参考指标,尤其是当HPV16型阳性时.
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红色诺卡菌细胞壁骨架对宫颈癌细胞株-HeLa细胞生长的影响
目的 探讨红色诺卡菌细胞壁骨架(nocardia rubra cell wall skeleton,Nr-CWS)对人乳头状瘤病毒阳性的宫颈癌细胞株-HeLa生长的影响.方法 体外培养HeLa细胞,并将细胞分为研究组和对照组两组.其中研究组加入Nr-CWS的终浓度值至30μg/ml,对照组加入等量PBS,利用MTT法分别于24 h～120 h(1～5 d)检测细胞活力,绘制细胞生长曲线,比较两组细胞生长差异.加药7 d后用流式细胞仪测定细胞处于周期各时相的比例,比较两组细胞DNA合成差异.同时进行Scid鼠体内抑瘤实验,将HeLa细胞接种Scid小鼠皮下,待呈现肉眼可见肿块后,按临床剂量在研究组肿瘤部位注射Nr-CWS,对照组注入等量PBS,比较Nr-CWS对HeLa细胞移植瘤生长的影响.结果 MTT结果比较显示:两组在不同时间点A490吸光度值差异有统计学意义,研究组明显抑制HeLa细胞生长.流式细胞仪测定细胞周期各时相中,研究组中处于静止期(G0～G1)细胞明显多于对照组,而增殖期(S+G2～M)细胞明显少于对照组.动物体内实验表明:研究组肿块体积和重量均低于对照组.结论 红色诺卡菌细胞壁骨架对人乳头状瘤病毒阳性的宫颈癌细胞株-HeLa有抑制作用.
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cyclin E、p16ink4、ki67在宫颈脱落细胞中的表达及其与HPV16/18感染的相关性
目的研究cyclin E、p16ink4、ki67在宫颈脱落细胞中的表达水平及其与HPV16/18感染的相关性,探讨其对宫颈癌高危人群筛查的意义.方法采用免疫组织化学方法对78例官颈脱落细胞标本进行cyclin E、p16ink4、ki67检测,同时应用多重引物PCR技术检测HPV16/18.结果cyclin E、p16ink4、ki67在宫颈癌细胞中的表达水平均较鳞状上皮非典型增生(ASCUS)差异有统计学意义(P＜0.005);各级宫颈癌细胞中HPV16的阳性率均较ASCUS差异有统计学意义(x2=25.27,P＜0.005),且随着宫颈上皮细胞损伤程度加重阳性率升高,差异也有统计学意义(P＜0.01).p16ink4和ki67在宫颈癌细胞中的表达水平与HPV16高度相关(rs=1.0,P＜0.05);而cyclin E的表达与HPV16相关性较小(rs=0.4,P＜0.05).HPV18阳性例数较少,在各项分析中差异均无统计学意义(x2=3.68,P＞0.05).结论官颈癌细胞中cyclin E、p16ink4及ki67的高度表达与HPV16感染有关;它们均可能作为有价值的诊断指标应用于宫颈癌高危人群筛查,且cyclin E对宫颈癌的早期诊断意义更大.
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人乳头状瘤病毒16型与促癌物TPA协同作用诱发人胚口腔细胞恶性转化研究
目的研究人乳头状瘤病毒16型(HPVl6)与TPA(12-O-tetradecanog 1 phorbol-13-acetate)协同作用在scid小鼠体内诱发人胚口腔细胞的恶性转化.方法制备包装含有HPV 16 E6/E7基因的逆转录病毒,用此病毒感染人胚口腔粘膜,将组织块接种于scid小鼠右侧肩部皮下,共分为4组:实验组为感染病毒的口腔粘膜和TPA,共接种8只小鼠;病毒组为感染病毒的口腔粘膜,共接种6只小鼠;促癌组为正常口腔粘膜和TPA,共接种6只小鼠;对照组为正常口腔粘膜,共接种5只小鼠.于接种第3日起在左侧肩部皮下注射TPA,每周一次.观察16周后处死动物,对瘤组织进行病理诊断,并作聚合酶链反应(PCR)检测HPV 16 E6/E7基因.结果实验组成瘤率为7/8,其他3组成瘤率皆为0/6、0/6、0/5.实验组肿瘤组织的病理学检查结果证实为生长活跃的纤维组织细胞瘤,在肿瘤组织中用PCR检测到HPV 16 E6/E7基因.结论口腔细胞在感染含有HPV 16 E6/E7基因的逆转录病毒后,在TPA作用下可以发生恶性转化.
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乳腺癌患者中HPV和MMTV的基因检测
目的 在乳腺癌中检测人乳头瘤病毒和小鼠乳腺肿瘤病毒的存在,期望能为乳腺癌的基因治疗提供可能的靶点.方法 取76例乳腺癌石蜡组织,应用PCR和巢式PCR方法检测组织中HPV L1、HPV16E6、HPV16E7、HPV18E6和HPV18E7,MMTV的env基因序列,并进行了测序分析.结果 在76份样本中,HPV L1阳性7例(9.21％),且测序后均为HPV18基因型;HPV16 E6和HPV16E7无阳性;HPV18 E6阳性5例(6.58％);HPV18 E7阳性7例(9.21％);MMTV的env基因阳性23例(30.26％).结论 HPV18型相关基因与MMTV的env基因在乳腺癌中有存在,结果提示乳腺癌与HPV的相关性不是很高,但乳腺癌和MMTV或许有一定的相关性,也为乳腺癌的基因治疗提供了可能的靶点.
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保定地区食管癌患者癌组织中人乳头瘤病毒感染的检测
目的 探讨人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)与我国河北省保定地区食管癌发生的相关性.方法 应用HPV LI通用引物GP5+,6+、HPV16 E6和HPV18 E6型特异性引物多聚酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR),检测保定地区食管癌组织中HPV存在状况.结果 42例食管癌组织中,37例检测到HPV阳性,阳性率为88.1%;其中19例检测到HPV16 E6基因,阳性率为45.2%,8例为HPV18 E6基因阳性,阳性率为19.0%,5例HPV16 E6和18 E6基因均阳性,为混合感染.结论 我国河北省保定地区食管癌组织中有HPV存在,并且HPV感染可能是食管癌发生的重要影响因子.
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HPV11型L2E7融合蛋白的原核表达及其免疫效果观察
目的 构建人乳头瘤病毒11型L2E7原核表达系统pET9aHPV11L2E7,并纯化蛋白进行小鼠免疫效果研究.方法 从尖锐湿疣组织中扩增人乳头瘤病毒11型L2、E7基因片段,构建pET9aHPV11L2E7原核表达重组质粒并测序,在大肠埃希菌宿主菌BL21(DE3+)中经IPTG诱导表达融合蛋白L2E7(553个氨基酸),经SDS-PAGE电泳和Western Blot进行鉴定.CM离子交换介质纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,进行细胞免疫水平和体液免疫水平的检测.结果 成功构建了pET9aHPV11L2E7原核表达系统,纯化获得的HPV11 L2E7蛋白免疫BALB/c小鼠后能检测到针对HPV11E7特异性的细胞免疫,血清中能检测到高效价抗HPV11 L2E7抗体.结论 纯化的HPV11L2E7融合蛋白能够引发特异性细胞和体液免疫反应,能作为尖锐湿疣免疫治疗候选疫苗.
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含HPV16L1基因重组腺病毒和1型重组AAV载体联合免疫效果的研究
目的 对表达HPV16L1抗原的重组腺病毒及1型重组AAV载体联合免疫效果进行研究.方法 分别构建含密码子优化型HPVl6LI基因重组腺病毒rAd-mod.HPV16L1及1型重组从V载体rAAV1-mod-HPV 16L1,将纯化的重组AAV病毒载体以肌注及滴鼻途径单独及联合免疫C57BL/6小鼠,使用体外中和实验检测各组小鼠血清中特异性中和抗体.结果 rAAV1-med-HPV16L1单独及与rAd-mod-HPV16L1联合肌注可诱导高滴度的血清中和抗体,在初免后第16周抗体滴度显著高于其他免疫组,联合肌注组诱导的抗体滴度高于单独肌注组;重组病毒联合滴鼻虽能产生一定的免疫加强作用,但抗体滴度仍显著低于rAAV1-mod-HPV16L1单独及联合肌注组.结论 型重组从V载体联合重组腺病毒以初免.加强模式肌注可诱导更高滴度的血清中和抗体.
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北京地区人乳头瘤病毒16型感染及其E6/E7基因变异与宫颈病变的相关性研究
目的 探讨HPV16感染及其E6/E7基因变异与宫颈病变的相关性.方法 采用导流杂交技术进行HPV感染分型检测,PCR扩增出80份HPV16阳性宫颈病变的E6/E7基因、克隆入pMD18-T载体,双向测序分析基因变异与宫颈病变相关性.结果 HPV16在宫颈病变患者中的检出率高为33.3%(154/463),与病变程度相关(P＜0.05).E6/E7基因72份测序成功,DNA序列变异发生率为88.9%(64/72).氨基酸序列E6-D32E(T96G)和E7-N29S(A86G)位点突变同时伴随存在,D32E/N29S的检出率为38.9%(28/72),与宫颈病变程度相关(P＜0.05).结论 HPV16是北京地区来源的宫颈病变中常见的致病型,其D32E/N29S变异与病变程度相关.
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人乳头状瘤病毒混合感染对高度鳞状上皮内病变和宫颈癌的风险研究
目的 研究HPV混合感染对宫颈高度鳞状上皮内病变和宫颈癌发生的影响.方法 随机选取近五年在我院进行了宫颈病理学检查且没有经过任何治疗的女性患者,提取样本的DNA,PCR检测HPV的基因分型.结果 在收集的1325例患者中共有755例患者(56.98％)感染HPV,其中非宫颈癌或者癌前病变的患者中有154例(37.84％),低级别上皮内瘤样病变的患者中有152例(47.64％),高级别上皮内瘤样病变的患者中有270例(64.28％),宫颈癌患者全部感染(100％);在所有感染HPV的患者中,HPV16型为常见,之后依次是18型,68型和58型;其中有423例患者为混合感染,约占总感染人数的56.03％,其中HPV16型和HPV68型混合感染具有协同作用,可以显著的提高高级别上皮内瘤样病变和宫颈癌发病率.结论 HPV的混合感染与宫颈癌的发生紧密相关,其中HPV16型和HPV68型可以显著的增加宫颈高级别上皮内瘤样病变和宫颈癌的发病风险.
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人乳头瘤病毒16型E6和E7基因突变体表达蛋白的稳定性和抗原性分析
目的筛选适合于宫颈癌治疗性疫苗研制的人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6和E7突变基因.方法采用定点诱变技术对E6和E7基因进行改造,得到几种E6和E7基因的突变体;构建成表达野生型和突变型E6与E7的重组痘苗病毒,对这些重组痘苗病毒表达的E6和E7蛋白的稳定性及其免疫原性进行了比较研究.结果 E6蛋白第50位氨基酸的突变、E7蛋白第24和26位氨基酸的突变都不影响蛋白的稳定性和抗原性,但E7蛋白第91位氨基酸的突变使E7蛋白的稳定性和抗原性大大减弱.结论证实了E7蛋白C-末端的锌指结构对E7蛋白结构的完整性和稳定性是非常重要的.
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细胞图像DNA倍体分析结合高危型HPV、支原体和衣原体检查与宫颈上皮内瘤变相关性研究
目的 探讨宫颈细胞DNA倍体、高危型HPV、支原体和衣原体检测结果与宫颈上皮内瘤变的相关性,以期结合宫颈感染情况,预测宫颈筛查结果阳性妇女真正罹患宫颈癌前病变的风险,避免宫颈过度治疗.方法 将参加筛查的285名育龄妇女分别采用宫颈细胞图像DNA倍体分析(DNA-ICM)、高危型HPV检查(PCR法)、支原体(UU/Mh)以及衣原体(CT)检查.以阴道镜下宫颈活检的病理学诊断为金标准,分别计算了各种检查方式,对宫颈病变诊断的敏感性、特异性、预测值等.结果 在285个病例的活检结果中,共有慢性炎症179例,CIN Ⅰ级60例,CIN Ⅱ级20例,CINⅢ级25例;癌1例.Logistic回归分析显示,细胞DNA倍体异常与宫颈癌及癌前病变相关性为显著,其次为高危型HPV感染.UU/Mh和CT感染均无明显相关性.所有存在微生物感染患者中,CINⅠ罹患者中32.43％为双因素感染,而CIN Ⅲ患者为56％.而在CIN Ⅱ中单独出现HR HPV感染的占50.00％,而CIN Ⅲ中占40％.结论 宫颈细胞DNA倍体阳性合并高危型HPV感染者应高度警惕为癌变高危人群,若同时出现UU/Mh感染,将有助于提高诊断的准确性.
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用甲醇酵母表达经基因优化的HPV 6型L1蛋白
目的利用甲醇酵母系统Pichia pastoris高效表达HPV 6型L1蛋白.方法按照Pichia pastoris偏爱密码子合成L1全长基因,构建pPIC3.5K- HPV6- L1表达载体,转化KM71,经组氨酸缺陷的MD培养基和G418筛选,PCR 确认L1基因整合,使用BMGY/BMMY培养/诱导目的基因的表达.结果筛选到3株阳性表达克隆,Western blot显示表达产物有部分糖基化现象,使用能识别完整VLP的单抗进行间接免疫荧光检测提示L1蛋白在Pichia细胞内以空间构象形式存在.通过离子交换和亲和层析两步纯化从1L发酵液中得到125 μg纯的L1蛋白.结论通过基因优化在甲醇酵母中表达HPV6- L1蛋白,这将为结构与功能研究以及疫苗开发提供条件.
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不同年龄高危 HPV E6／E7 mRNA 检测在 ASC-US 分流中的应用
目的：分析HR-HPV E6／E7mRNA检测在不同年龄段无明确诊断意义的不典型鳞状细胞（ ASC-US）患者中的分流价值。方法对320例ASC-US患者同时检测HR-HPV E6／E7mRNA和HR-HPV DNA，并行阴道镜检查和宫颈活检，按年龄段分成＜30岁组和≥30岁组，进行统计学分析。结果＜30岁组和≥30岁组的HR-HPV E6／E7mRNA阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）；＜30岁组的HR-HPV DNA阳性率明显高于≥30岁组，差异有统计学意义（ P＜0.05）；＜30岁组的CINⅡ＋级检出率明显低于≥30岁组，差异有统计学意义（ P＜0.05）。＜30岁组的HR-HPV E6／E7mRNA检测CINⅡ＋级的特异度分别为68.0％，显著高于HR-HPV DNA检测的38.7％，差异有统计学意义（ P＜0.05）；≥30岁组的HR-HPV E6／E7mRNA检测CINⅡ＋级的特异度为76.5％，高于HR-HPV DNA检测的69.4％，差异有统计学意义（P＜0.05）；＜30岁组和≥30岁组两种HPV检测方法诊断CINⅡ＋级的灵敏度、阳性预测值（ PPV）和阴性预测值（ NPV）均无统计学差异（均P＞0.05）。结论 HR-HPV E6／E7mRNA检测比HR-HPV DNA检测更适合用于包括＜30岁ASC-US女性是否需要阴道镜转诊的分流管理。
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人乳头状瘤病毒 L1壳蛋白表达与宫颈病变程度相关性研究
目的：探讨人乳头瘤病毒（ human papillomavirus，HPV）感染宫颈上皮细胞L1壳蛋白表达对宫颈病变的进展及宫颈癌的发生的临床意义。方法病例组共259例，根据液基薄层细胞检测（TCT）结果不同分为未见上皮内病变细胞或恶性细胞（NILM）103例、非典型鳞状细胞（ASCUS）91例、低度鳞状上皮内病变（LSIL）36例、高度鳞状上皮内病变（HSIL）23例和鳞状细胞癌（SCC）6例。同时选择50例健康体检者作为对照组。分别用PCR-反向点杂交法检测HPV 23种亚型和免疫细胞化学法检测L1壳蛋白表达。结果对照组PCR和L1壳蛋白表达结果均呈阴性。病例组NILM、ASC、LSIL、HSIL和SCC患者HPV感染率分别为23.3％、69.2％、83.3％、87.0％和100％，HPV-PCR阳性上述患者高危型 HPV （ HR-HPV ）的构成比分别为79.2％、92.1％、96.7％、100％和100％。NILM、ASC、LSIL、HSIL 和 SCC 患者 HPV L1壳蛋白表达阳性率分别为25.2％、31.9％、63.8％、17.4％和0％。结论随宫颈病变的进展HPV感染率和HR-HPV构成比升高，提示本地区HPV感染率和HR-HPV构成比与宫颈上皮内瘤变程度密切相关。 L1壳蛋白检测阳性率随病变早期表达呈上升趋势，晚期呈明显下降，HPV L1壳蛋白的表达与宫颈病变程度有关，可以作为宫颈癌癌前病变的随访指标。
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应用聚合酶链反应检测食管癌组织中人乳头瘤病毒
目的 探讨人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)与我国河南地区食管癌发生的相关性.方法 应用HPV L1通用引物GP5+/6+、HPV16E6和HPV18E6型特异性引物多聚酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR),检测林州市食管癌组织中HPV存在状况.结果 31例食管癌组织中,29例检测到HPV阳性,阳性率为93.5%;其中19例检测到HPV16 E6基因,阳性率为61.3%,8例为HPV18 E6基因阳性,阳性率为25.8%,5例HPV16E6和18E6基因均阳性,为混合感染.HPV16和18型阳性率为71.0%.结论 我国河南省林州市食管癌组织中有HPV存在,并且HPV感染可能是食管癌发生的重要病因.
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尖锐湿疣患者皮损中 TLR7／9相关信号通路蛋白的表达
目的：探讨TLR7／9及其信号通路在尖锐湿疣（ condyloma acuminatum，CA）免疫发病机制中的可能作用。方法采用免疫组织化学SP法检测23例 CA患者皮损TLR7／TLR9、IRF7和IRAK1的表达和分布情况，以13例边缘带正常皮肤的CA患者为对照，分别比较分析23例CA皮损与其中13例CA皮损边缘正常皮肤，以及13例CA皮损与其边缘正常皮肤中TLR7／TLR9、IRF7和IRAK1表达密度和阳性率的差异。结果 TLR9在表皮角质形成细胞和真皮乳头层部分单核样细胞胞浆内表达；TLR7、IRF7、IRAK1表达阳性细胞主要位于真皮乳头层，均为胞浆表达。尖锐湿疣患者皮损真皮乳头层TLR9表达阳性细胞密度和阳性率均比边缘正常皮肤明显增高（ P＜0.05）；TLR7、IRF7、IRAK1表达阳性细胞密度和阳性率与边缘正常皮肤无显著性差异（ P＞0.05）。结论尖锐湿疣患者皮损中TLR9的表达水平上调，而TLR7、IRF7、IRAK1的表达水平未见明显改变。推测：尽管尖锐湿疣皮损TLR9的表达上调，但TLR7／9下游通路未被有效激活，故而未能激活抗HPV免疫反应，进而HPV病毒清除困难，并可能与临床上尖锐湿疣的易复发或迁延不愈有关。
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温热对HPV感染皮肤LC成熟功能的影响
目的 探讨不同局部温热条件对人乳头瘤病毒(HPV)感染皮损朗格汉斯细胞(LCs)CD1a/CD83表达变化的影响,为病毒疣的治疗提供理论依据.方法 采用共聚焦显微镜检测正常皮肤组织和尖锐湿疣皮损内LC CD1a/CD83的表达变化;利用37℃,42℃,45℃不同温热条件处理正常皮肤组织和尖锐湿疣皮损,采用流式分析技术检测游走至培养液中CD1a~+/CD83~+LC的数量变化.结果 正常皮肤组织和尖锐湿疣皮损内只见CD1a~+LC,无CD83~+LC;正常皮肤组织和尖锐湿疣组织游走细胞中CD1a~+/CD83~+LC的百分比均随局部温度升高而逐渐增多.温热对尖锐湿疣组织游走LC中CD1a'CD83表达影响显著高于正常皮肤组织.结论 局部温热可能通过促进LC的迁移和成熟,在局部细胞免疫应答中发挥作用.
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亚硝基吡啶对人乳头状瘤病毒诱导的食管上皮永生化细胞的促癌作用
目的观察亚硝基吡啶在细胞恶性转化过程中的促癌作用.方法用HPV18E6E7诱导食管上皮细胞永生化细胞系SHEE,第17代细胞培养在50 ml培养瓶.加入亚硝基吡啶(Nnitrosopiperidine,NPIP)0,2,4,8 mmol/L作用3周.用相差显微镜检查细胞形态,流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡;染色体常规制样,检查染色体众数;细胞软琼脂集落形成及接种裸小鼠检查成瘤性;用Western blot检测HPV18表达.结果当细胞暴露在8 mmol/L NPIP时细胞死亡增加,只剩少量活细胞.换正常培基代替NPIP,经4周后细胞进入增殖状态,细胞出现增生和异型增生.第8周末细胞软琼脂培养有大集落形成,接种裸小鼠成瘤.2,4 mmol/L组细胞倍增时间延长,细胞未能成瘤.8 mmol/L NPIP组染色体众数61～65,对照组56～61.实验组和对照组HPV阳性.结论NPIP促进人乳头状瘤病毒诱导人胚食管永生化上皮恶性转化,HPV18E6E7和NPIP能协同作用加速食管上皮恶性转化.
