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膀胱移行细胞癌患者RASSF1A蛋白表达和启动子区甲基化的研究
目的:探讨RASSFlA(RAS association domain family1A)蛋白表达水平与启动子甲基化的关系.方法:应用免疫印迹技术(western-blot)检测10例正常膀胱组织和23例膀胱移行细胞癌(Badder transitional cell carcinoma,BTCC)组织中RASSFlA蛋白表达水平;用甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR,MSP)方法检测正常膀胱组织,BTCC组织中RASSF1A基因启动子CPG岛甲基化状态.结果:RASSF1A蛋白在正常膀胱组织中全部表达,在BTCC组织中表达率为30.4%(7/23),二组间表达差异有统计学意义(P＜0.05),但各肿瘤分期、病理分级间的表达差异无统计学意义(P＞0.05).在正常膀胱组织中,RASSF1A基因启动子未发生甲基化;在BTCC组织中,RASSF1A基因启动子甲基化频率为60.9%(14/23),二组间表达差异有统计学意义(P＜0.05).在14份启动子异常甲基化的BTCC标本中,13份同时伴有RASSFIA蛋白表达缺失或下调,两者存在明显相关性(P＜0.05).结论:RASSFlA基因启动子在BTCC组织中发生异常甲基化,使RASSF1A蛋白表达缺失,推测RASSFIA基因启动子CPG岛异常甲基化导致RASSF1A基因失活从而引起肿瘤的发生,而与肿瘤的进展可能无关.
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散发性肝外胆管癌中RASSF1A基因启动子甲基化状态的研究
目的检测肝外胆管癌组织中RASSF1A基因启动子甲基化及各CpG位点甲基化发生率.方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)和半巢式PCR对RASSF1A基因启动子区域进行扩增,并对扩增产物克隆测序.结果在全部48例肝外胆管癌组织中,RASSF1A基因启动子区域存在CpG位点甲基化现象的共28例,16个CpG位点甲基化平均发生率为42.45%,明显高于对照组(χ2=11.77,P<0.01).结论 RASSF1A基因启动子区域CpG岛甲基化是RASSF1A失活的主要机制,在肝外胆管癌的发生过程中发挥重要作用.
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曲古抑菌素A对人胃癌SGC-7901细胞凋亡及其RASSF1A基因表达的影响
目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对人胃癌SGC-7901细胞凋亡及其RASSF1A基因表达调控的影响.方法 用 0.1、0.3、1.0μmol/L TSA分别处理人胃癌SGC-7901细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率,RT-PCR、Western blot分别检测RASSF1A mRNA和蛋白表达水平.结果 流式细胞仪分析表明,不同浓度TSA可诱导SGC-7901细胞凋亡,并呈浓度及时间依赖性(P<0.05).TSA干预前SGC-7901细胞无RASSF1A mRNA及蛋白表达,而不同浓度TSA处理SGC-7901细胞后,RASSF1AmRNA及蛋白表达分别上调,呈浓度及时间依赖性(P<0.05).结论 TSA诱导SGC-7901细胞凋亡可能与RASSF1A基因异常乙酰化状态恢复导致基因重新表达有关.
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贲门腺癌中RASSF1 A基因的甲基化状态及表达
目的 研究贲门腺癌(gastric cardiac adenocarcinoma,GCA)中RASSF1A基因的甲基化状态及其蛋白表达情况.方法 分别应用甲基化特异性PCR(MSP)、RT-PCR及免疫组织化学SP法检测贲门癌组织及相应癌旁组织的RASSF1A甲基化情况和mRNA水平及蛋白表达情况.结果 92例贲门癌组织中有54例发生了甲基化,甲基化率为58.7%,显著高于癌旁正常组织(P<0.01).Ⅲ期和Ⅳ期贲门癌患者中RASSFlA基因发生甲基化的比率显著高于I期和Ⅱ期患者(P
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妇科恶性肿瘤细胞系中RASSF1A基因启动子区的甲基化及其表达
目的 研究Ras相关结构域家族1A基因(RASSF1A)启动子区域在妇科恶性肿瘤细胞中的甲基化状态及其与RASSF1A基因表达的关系.方法 采用RT PCR及甲基化特异性PCR检测9种妇科恶性肿瘤细胞系中RASSF1A基因mRNA表达水平及其启动子区域的DNA甲基化状态.结果 A2780、Anglne、CaOV3、SKOV3、HEC-1B和Ishikawa细胞系中RASSF1A基因启动子区域DNA呈现高甲基化,而相应的mRNA表达缺失或低表达,COC1、Hela和Siha细胞系中RASSF1A启动子区域DNA仅部分甲基化,可检测到这些细胞系RASSF1A基因的表达.结论 妇科恶性肿瘤细胞系普遍存在RASSF1A基因启动子区域DNA的高甲基化,这可能在妇科恶性肿瘤的发生发展中起作用.
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诱导痰RASSF1A, p16和DAPK基因启动子区甲基化在肺癌诊断中的价值
目的:探讨诱导痰中RASSF1A, p16和DAPK基因启动子区异常甲基化及其联合检测在肺癌诊断中的价值.方法:采用甲基化特异性PCR(MSP)技术,检测82例肺癌患者诱导痰和对应肿瘤组织以及25例肺部良性病变组织中RASSF1A, p16和DAPK 3种基因启动子区甲基化改变,并分析三者与临床病理资料的关系.结果:肺癌病理组织中RASSF1A, p16和DAPK基因启动子区甲基化检出率分别为63.4%,59.8%和58.5%, 对应的诱导痰三者甲基化检出率分别为54.9%,48.8%和51.2%;肺部良性病变组织中甲基化检出率均为零,两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).RASSF1A基因甲基化检出率在中高分化和无淋巴结转移的肺癌中明显低于低分化和未分化及有淋巴结转移者(P＜0.05),与年龄、性别、吸烟指数、临床分期及病理类型无关,而p16和DAPK基因甲基化检出率与上述因素均无明显相关性(P＞0.05);联合检测3种基因甲基化的检出率为73.2%.结论:联合检测诱导痰中RASSF1A, p16和DAPK基因启动子区高甲基化有可能作为诊断肺癌及评估预后的简便有效的指标,并能提高检出率.
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上皮性卵巢癌RASSF1A基因甲基化与新辅助化疗疗效的相关性
目的:比较Ras相关区域家族1A (Ras association domain family 1A,RASSF1A)基因表达以及甲基化程度在晚期上皮性卵巢癌中是否存在差异,以及该差异与采用TP方案进行的新辅助化疗模式的关系.方法:选取在我院住院上皮性卵巢癌患者40例,采用甲基化特异性PCR技术(MSP)针对RASSF1A启动子区域的甲基化程度进行分析.同时分析不同RASSF1A表达患者的TP方案新辅助化疗临床疗效.结果:40例患者中,15例患者RASSF1A启动子区域发生甲基化,25例患者RASSF1A未发生甲基化.15例发生甲基化患者新辅助化疗有效率为26.6%,未发生甲基化患者有效率为48.0%,2组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论:RASSF1A基因启动子区域甲基化程度的差异与晚期上皮性卵巢癌患者新辅助化疗疗效关系密切.
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5-Aza-CdR对人肝癌细胞RASSF1 A甲基化的影响
目的：探讨5-氮杂-2ˊ-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人肝癌细胞RASSF1A基因启动子甲基化以及mRNA表达的影响。方法体外培养人肝癌细胞株SMMC-7721,分别用0.5、5.0、30.0、50.0μmol/L的5-Aza-CdR与之孵育72 h,甲基化PCR检测处理前后启动子甲基化水平,RT-PCR检测RASSF1A mRNA表达。结果随着药物浓度的增加,甲基化RASSF1A含量逐渐降低,而未甲基化产物逐渐增高；5-Aza-CdR处理后,RASSF1A mRNA的含量随之增高。结论5-Aza-CdR可逆转SMMC-7721细胞株细胞中基因甲基化修饰状态。
关键词： 5-氮杂-2ˊ-脱氧胞苷 肝癌细胞 RASSF1A基因 启动子甲基化 -
TSA对人胃癌MKN-28细胞生物学行为及其RASSF1A基因表达的影响
目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对人胃癌MKN-28细胞生物学行为及其RASSFIA基因表达调控的影响.方法 0.1、0.3、1.0μmol/L不同浓度的TSA分别处理人胃癌MKN-28细胞,MTT比色法检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,RT-PCR、Western blot分别检测RASSFIA mRNA和蛋白表达水平.结果 不同浓度的TSA处理MKN-28细胞后,细胞增殖受到明显抑制,细胞周期发生改变,使细胞阻滞于G1期,与阴性对照组比较差异有显著性(P<0.05),并呈浓度及时间依赖性(P<0.05),细胞凋亡率无明显变化,差异无显著性(P>0.05).RT-PCR、Western blot显示MKN-28细胞无RASSF1A mRNA及蛋白表达,TSA处理后,KASSF1A mKNA及蛋白表达分别上调,呈浓度及时间依赖性(P<0.05).结论 TSA抑制人胃癌MKN-28细胞增殖,使细胞阻滞于G1期,可能与KASSF1A基因异常乙酰化状态恢复导致基因重新表达有关.
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非侵袭性产前胎儿RHD基因型检定平台的建立
目的 探讨Ras相关区域家族1A(RASSF1A)基因作为通用胎儿DNA标记的可行性,建立Real-time PCR为基础的非侵袭性产前胎儿RHD基因型定型平台.方法 抽取未孕自愿者7名(男2名,女5名)和43例RhD阴性孕妇的EDTA抗凝血5 ml,分离血浆抽提其中的游离细胞DNA.联合使用5种甲基化敏感性限制性内切酶对未/低甲基化的母源性RASSF1A基因进行酶切以保留高度甲基化的胎源性RASSF1A基因;同时酶切未甲基化的β-actin基因作为对照,以检测酶切的彻底性;通过Real-time PCR扩增酶切前的RASSF1A基因和β-actin基因、酶切后的RASSF1A基因,分别检测血浆总游离细胞DNA和胎儿游离细胞DNA;对确认存在胎儿DNA的标本,扩增RHD基因的外显子5和7,以检定胎儿的RHD基因型.结果 7例未孕自愿者和43例孕妇酶切处理前的RASSF1A基因和β-actin基因扩增均阳性.酶切处理后,7例未孕自愿者和2例孕妇未检测到RASSF1A基因和β-actin基因,41例孕妇检测到RASSF1A基因、未检出β-actin基因,其中39例检出RHD基因外显子5和7.结论 RASSF1A基因可作为通用的胎儿DNA标记,荧光定量PCR扩增RHD基因外显子5和7的平台可用于非侵袭性胎儿RHD基因型别检定.
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肾细胞癌RASSF1A基因启动子区甲基化状况与表达水平研究
目的 检测19例肾细胞癌患者癌组织及癌旁组织Ras相关区域家族蛋白1A(RASSF1A)基因启动子区甲基化情况并检测其mRNA表达水平,探索两者之间的联系.方法 收集肾细胞癌患者癌组织及相应癌旁组织19份,分别提取其基因组DNA,以甲基化特异性PCR(Methylation special PCR, MSP)法检测RASSF1A基因启动子区甲基化情况,并以QPCR法检测了RASSF1A基因的mRNA表达水平.结果 19例中有10例肾细胞癌患者癌组织存在高甲基化, mRNA表达水平表达降低,二者之间存在显著负相关性(r=-0.8734, P<0.01).结论 肾细胞癌中RASSF1A基因启动子区存在高甲基化,并抑制该基因的表达.
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RASSF1A基因与结直肠癌关系的研究进展
结直肠癌是我国常见的胃肠道恶性肿瘤,其发生发展是多阶段、多步骤的病理过程,与多个癌基因的激活及抑癌基因的失活有关.
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5-氮杂-2’-脱氧胞苷调控RASSF1A基因表达对子宫内膜癌HEC-1-B细胞增殖及凋亡的影响
目的:探讨甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)对人子宫内膜癌(Human endometrial cancer,HEC)-1-B细胞增殖和凋亡的作用及其可能机制.方法:应用不同浓度的5-Aza-CdR处理HEC-1-B细胞,甲基化特异PCR(Methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)法检测处理前后RAS相关域家族1A(RAS association domain family 1A,RASSF1A)基因甲基化状态,应用RT-PCR方法检测RASSF1A基因mRNA表达,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡率.结果:HEC-1-B细胞RASSFIA基因启动子区呈高甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,RASSF1A基因启动子区呈去甲基化状态,其mRNA重新表达,细胞生长受到抑制,细胞凋亡增加.结论:5-Aza-CdR能够逆转RASSFIA基因甲基化状态,调控RASSF1A基因表达,并能有效地抑制HEC-1-B细胞的增殖和诱导细胞调亡.
关键词： 子宫内膜癌 5-氮杂-2’-脱氧胞苷 RASSF1A基因 甲基化 -
三氧化二砷对前列腺癌DU-145细胞RASSF1A基因的去甲基化作用
目的 研究三氧化二砷( arsenic trioxide,As2O3)对激素非依赖性前列腺癌DU145细胞的生长抑制作用及对RASSF1A基因去甲基化和蛋白表达的影响.方法 应用MTT法检测不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、12.0、20.0μmol/L)的As2O3不同作用时间(24、48、72 h)对DU145细胞的生长抑制作用；应用甲基化特异性PCR(MSP)和Western blot检测As2O3对DU145细胞RASSF1A基因甲基化状态及蛋白表达的影响.结果 As2O3可抑制DU145细胞的增殖,在一定范围内随着药物浓度的增高,抑制作用逐渐增强(F=838.089,P＜0.05)；同一浓度作用时间越长,抑制率越高(F=8.849,P＜0.05)；且As2O3可使RASSF1A基因甲基化逆转,蛋白重新表达.结论 As2O3可以逆转前列腺癌DU145细胞RASSF1A基因启动子CpG岛的异常甲基化,诱导该抑癌基因的重新表达,抑制前列腺癌DU145细胞的增殖.
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RASSF1A基因启动子区甲基化在胃癌阶段性发生及进展中的作用及临床意义
目的 通过检测胃癌癌旁距离原发灶不同距离组织及胃癌原发灶RASSF1A基因启动子区甲基化状态的差异,分析正常胃组织、癌前病变及癌组织中该基因甲基化的动态变化以及RASSF1A基因甲基化与胃癌原发灶病理生物学行为的关系,探讨RASSF1A基因启动子区甲基化在胃癌阶段性发生及进展中的作用及临床意义.方法 采用甲基化特异性PCR(MSP)法检测距胃癌癌灶边缘5、3、1 cm组织及胃癌原发灶组织中RASSF1A基因甲基化状态.结果 RASSF1A基因启动子区甲基化发生率在距胃癌灶边缘5、3、1 cm组织及胃癌组织中分别为5.0%、7.5%、22.5%及42.5%,从距癌灶边缘5 cm胃组织至胃癌原发灶组织中的表达中随距癌灶边缘距离的减少呈上升趋势,差异有统计学意义(P＜0.01).从组织病理学角度分析,RASSF1A基因启动子区甲基化发生率在正常胃组织、癌前病变组织及胃癌原发灶中分别为0.0%、17.39%、42.5%,动态上升,三者间差异具有统计学意义(P＜0.01).RASSF1A基因甲基化发生率在胃癌患者透浆膜组显著高于未透浆膜组(P＜0.05);在转移淋巴结数7枚以上组显著高于0～7枚组(P＜0.05),与胃癌胃壁浸润深度、转移淋巴结数相关,在不同大体类型、生长方式、分化程度、性别及年龄胃癌患者间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 RASSF1A基因启动子区异常甲基化可能与胃癌的阶段性发生及临床进展相关.
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宫颈癌中RASSF1A基因杂合性丢失及HPV感染状态的研究
[目的]研究RASSF1A基因的杂合性丢失(Ioss of heterozygosity, LOH)及人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染与宫颈癌临床病理参数之间的关系.[方法]选择3p上2个微卫星位点,对110例宫颈组织进行LOH及HPV感染状态的分析.[结果]宫颈癌及CIN中RASSF1A基因LOH阳性的比例明显高于正常宫颈(P<0.05);官颈癌Ⅲ和Ⅳ期LOH的阳性率明显高于Ⅰ期和Ⅱ期(P<0.05);低分化宫颈癌的LOH阳性率明显大于高中分化官颈癌(P<0.05);随CIN级别的增加LOH阳性率也呈逐渐递增趋势,高级别CIN(CINⅢ及原位癌)明显高于低级别CIN(CIN I/Ⅱ)(P<0.05).宫颈癌中HPV感染阳性率明显高于CIN组及正常宫颈组(P<0.05);RASSF1A的LOH阳性率在HPV感染阳性组明显高于阴性组(P<0.05).[结论]RASSF1A基因的改变是宫颈癌发生过程中的较晚期事件,RASSF1A基因的LOH对于宫颈癌的筛查、早期诊断及判断预后可能具有临床实用价值.HPV感染与RASSF1A基因的LOH共同作用在宫颈癌发展过程中更有意义.
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地西他滨对裸鼠子宫内膜癌移植瘤的作用及机制研究
目的 探究去甲基化药物地西他滨对裸鼠子宫内膜癌移植瘤的作用及其机制.方法 建立子宫内膜癌裸鼠移植瘤模型后随机分为地西他滨组(AZA组)、顺铂组(DDP组)、醋酸甲羟孕酮组(MPA组)、AZA+ DDP组、AZA+MPA组、DDP+ MPA组、模型组,每组3只,各实验组给予相应药物(1 ug/g单用或各1ug/g联合),模型组给予生理盐水,每3d一次尾静脉注射给药,共给药8次.处理后观察各组裸鼠瘤体生长情况;取出瘤体后,计算抑瘤率;采用甲基化特异性PCR(MSP)、Western blot和TUNEL染色法分别检测移植瘤组织细胞中RASSF1A基因启动子区域甲基化状态、蛋白表达及肿瘤细胞的凋亡情况.结果 AZA+ DDP组抑瘤率高,而AZA组抑瘤率低.AZA组、AZA+ DDP组、AZA+ MPA组RASSF1A基因启动子区域甲基化水平明显降低,显示明显的非甲基化条带,其余组则主要显示甲基化条带.AZA组、AZA+ DDP组、AZA+ MPA组这三组之间RASSF1A蛋白的表达量差异无统计学意义(P＞0.05),但均高于模型组(P＜0.05);DDP组、MPA组、DDP+ MPA组与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05).凋亡指数为模型组＜3个单药组＜3个联合用药组(P＜0.05).结论 地西他滨可逆转内膜癌中RASSF1A基因启动子区域的异常甲基化,恢复RASSF1A蛋白生物学功能,增强DDP与MPA的药效,对临床子宫内膜癌的治疗有很大的潜在应用价值.
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5-Aza-CdR对子宫内膜癌中RASSF1A基因甲基化的作用
目的 探讨去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧脱苷(5-Aza-CdR)对子宫内膜癌中Ras相关区域家族1A(RASSF1A)基因甲基化的作用.方法 取子宫内膜癌细胞株HEC-1-B细胞随机分组,用不同浓度(1.0×10-6,3.0×10-6,10.0×10-6 mol/L)的去甲基化药物5-Aza-CdR处理后,采用甲基化特异性PCR、实时定量PCR、Western blot、TUNEL等技术,分析空白对照组及实验各组子宫内膜癌细胞株HEC-1-B中RASSF1A基因启动子区域甲基化情况、mRNA表达水平、蛋白表达和细胞凋亡的情况.结果 人子宫内膜癌细胞株HEC-1-B细胞中RASSF1A基因启动子区存在高甲基化,mRNA、蛋白低表达,以及细胞凋亡失控.不同浓度的5-Aza-CdR可逆转RASSF1A基因高甲基化状态,恢复mRNA、蛋白表达量,并可抑制HEC-1-B细胞的生长及诱导凋亡.结论 子宫内膜癌异常甲基化RASSF1A基因作为治疗靶点,去甲基化药物5-Aza-CdR是基因治疗的有效途径.
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RASSF1A基因启动子区甲基化状态在食管鳞癌诊断中的研究
目的:检测RASSF1A(ras association domain family 1A,RASSF1A)基因在肿瘤组织的甲基化频率差异,并且评价其对食管鳞癌的诊断价值.方法:收集食管鳞癌组织、癌旁组织各43例,记录病人的病理资料.应用甲基化特异性PCR法结合琼脂糖凝胶电泳检测RASSF1A基因在组织中的甲基化情况,比较甲基化基因检测与肿瘤标志物两种检测标志物在食管癌诊断中的价值.将实验结果录入统计软件,计数资料两组间比较采用χ2检验统计分析.结果:RASSF1A基因在肿瘤组织中的甲基化频率为34.88%,显著高于癌旁组织6.98%,差异有统计学意义(P=0.001);RASSF1A基因启动子区异常甲基化状态与患者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、肿瘤深度、是否淋巴结转移及临床分期无明显关系(P>0.05),RASSF1A基因甲基化检测阳性检测率为34.88%,明显高于肿瘤标志物的阳性检测率11.62%,差异有统计学意义(P=0.011);结论:RASSF1A基因启动子区甲基化的检测在食管鳞癌的诊断中具有较高的价值.
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MSP法检测胃癌组织中RASSF1A基因启动子区甲基化改变
目的:探讨抑癌基因RASSF1A启动子区CpG岛甲基化与胃癌及临床病理特征的关系.方法:采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)法检测60例胃癌组织及相应癌旁组织和30例对照组织中RASSF1A基因启动子区甲基化状态.结果:胃癌组织中RASSF1A基因启动子区CpG岛甲基化率为65.0%(39/60),显著高于癌旁组织6.7%(4/60),及对照组0%(0/30)(P＜0.01).胃癌组织中不同年龄、性别、分化程度及淋巴结转移与否的RASSF1A基因甲基化率的差异均无统计学意义.结论:胃癌中RASSF1A基因启动子区的高甲基化提示其与胃癌的发生密切相关,MSP法对RASSF1A基因启动子区甲基化的检测有望成为胃癌早期监测的重要方法.
