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脂肪间充质干细胞研究应用进展
脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived stem cells,ADSCs)被用于多种疾病的相关治疗研究,其中包括肝纤维化、神经损伤、血管缺损、骨骼肌损伤、原发慢性免疫性血小板减少症、心肌梗死和组织硬化症等[1-3].ADSCs可以分化为多种成熟细胞类型,已成为细胞治疗中的理想种子细胞之一,应用于组织修复的研究也逐渐增多.
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人脂肪间充质干细胞体外培养鉴定与诱导分化的初步研究
目的 分离培养人脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs),观测表型及表达特异性蛋白与多向诱导分化的能力.方法 取人脂肪组织,机械法与酶消化法分离、培养,观察细胞形态及增殖活力,免疫细胞化学和FCM检测其标志蛋白.第9代ADSCs向成脂、成软骨和成骨细胞诱导分化.结果 原代细胞贴壁后多呈多角形,传代后呈均一梭形.免疫细胞化学结果显示:ADSCs不表达CK19,而波形蛋白(Vimentin)阳性表达,间充质干细胞表面标志CD105、CD90、CD44、CD73均高表达,CD45 +34+ 11b+ 19+ DR为0.48％.第9代ADSCs诱导培养后分别出现脂肪、软骨、骨细胞特征性染色阳性.结论 酶消化法可有效分离ADSCs,第9代生长状态好,仍保持良好干性,经诱导可多向分化,表明ADSCs可作为良好的细胞治疗或组织工程种子细胞的来源,且有潜在广泛应用前景.
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人大网膜间充质干细胞的体外培养、鉴定及诱导化分方法
目的 建立人大网膜脂肪间充质干细胞(adipose derived mesechymal stem cells,ADSCs)的原代培养及诱导分化为脂肪细胞的方法.方法 术中取人大网膜脂肪组织,采用胶原酶消化法原代培养,经流式细胞仪鉴定细胞CD44、CD34、CD90和CD45分子、MTT法测定细胞生长曲线,取P3细胞以3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松及吲哚美辛诱导该细胞向脂肪细胞分化,油红0脂肪染色法进行脂肪细胞鉴定.结果 培养出的细胞形态均一呈梭形或漩涡状生长,经流式细胞仪鉴定为ADSCs,细胞生长曲线表明P3细胞增值旺盛,用分化培养基诱导后,细胞形态由梭形变为圆形,细胞体积增大,胞浆内聚集脂肪颗粒,油红0染色鉴定为成熟的脂肪细胞.结论 该方法能培养出形态均一的人大网膜ADSCs,经诱导后可向成熟脂肪细胞分化.
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脂肪间充质干细胞促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化
目的 探索脂肪间充质干细胞(ADSC)对M1/M2型巨噬细胞的影响以及ADSC能否促使M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化.方法 利用脂多糖(LPS)、γ干扰素(IFN-γ)刺激J774.1巨噬细胞24h诱导为M1型巨噬细胞,利用白细胞介素4(IL-4)刺激J774.1巨噬细胞24h诱导为M2型巨噬细胞;将M1/M2型巨噬细胞分别与ADSC共培养24h后,收集巨噬细胞和上清液,用实时定量PCR和ELISA检测巨噬细胞IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、CC趋化因子配体2 (CCL2)、CD86、精氨酸酶1(Arg1)、甘露糖受体/CD206 (MR/CD206)、IL-10、炎症区分子1(found in inflammatory zone 1,FIZZ1)、几丁质酶3样分子3(chitinase 3-like 3,即Ym-1)的变化.结果 ADSC使M1型巨噬细胞分泌的IL-6、TNF-α、iNOS、CCL2、CD86明显减少,Arg1、CD206、IL-10明显增加,且上清液中IL-6和TNF-α含量明显减少,CD206明显增加;使M2型巨噬细胞分泌的IL-6、TNF-α、iNOS、CD86明显减少,Arg1、CD206、FIZZ-1、Ym-1、IL-10明显增加,且上清液中IL-6和TNF-α含量明显减少,CD206明显增加.结论 ADSC抑制M1型巨噬细胞的特异性基因的表达,促进M2型巨噬细胞特异性基因的表达,并使M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化.
关键词： 脂肪间充质干细胞 巨噬细胞极化 M1/M2型巨噬细胞 共培养 -
丝素蛋白/壳聚糖复合纳米纤维膜心脏补片的生物相容性研究
目的 探讨丝素蛋白(SF)/壳聚糖(CS)复合纳米纤维膜对小鼠脂肪间充质干细胞(AD-MSCs)黏附和生长的影响,评估该材料用作心脏补片的可行性.方法 通过静电纺丝技术制备纤维素纳米纤维底板,用层层自组装技术(LBL),将SF和CS组装到纤维素纳米纤维表面,得到改性的SF/CS复合纳米纤维膜,用ζ-电位和X射线光电子能谱(XPS)测定材料的表征.分离培养携带绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(Fluc)双重报告基因的小鼠AD-MSCs细胞,并接种于SF/CS复合纳米纤维膜上共培养,用激光共聚焦显微镜(CFM)观察细胞黏附和生长形态,扫描电子显微镜(SEM)观察超微结构,生物发光成像(BLI)及MTT比色法评估AD-MSCs细胞的数量和活性.结果 XPS测定的结果提示SF/CS复合纳米纤维膜构建成功.SEM观察可见纳米纤维直径均一,具有良好的三维多孔结构,细胞在SF/CS复合纳米纤维膜上增殖活跃,形态和生长状态良好.CFM、BLI及MTT比色法的结果提示细胞与SF/CS复合纳米纤维膜共培养后呈三维分布,增殖状态好.结论 对纤维素纳米纤维用LBL进行改性后可明星促进AD-MSCs的三维生长,SF/CS复合纳米纤维膜是可用于组织工程心肌补片的理想材料.
关键词： 丝素蛋白/壳聚糖纳米纤维膜 脂肪间充质干细胞 心脏补片 -
脂肪间充质干细胞移植对兔心梗后近期心功能的影响
目的:观察脂肪间充质干细胞(ADMSCs)心肌内移植对兔心肌梗死(MI)后心力衰竭近期心功能的影响,并初步探讨其机制.方法:将30只兔随机分为假手术组(只穿线不接扎)、对照组(心肌内注射IMDM培养基)及干细胞移植组(心肌内注射ADMSCs),每组10只(n:10);结扎兔冠状动脉左前降支(LAD)制作急性Ml模型,同时将6-二氨基-乙-苯茚二酮(DAPI)标记的ADMSCs注射到梗死区数个不同部位.造模前及移植后4周、8周,用超声心动图检测心功能,术后8周处死动物测量左室体质量指数及组织学观察,采用免疫荧光方法鉴定移植的细胞.结果:移植后4周起,心功能指标明显改善(P<0.05),术后第8周心功能指标改善更明显(P<0.01),左室重构程度也得到明显改善(P<0.01).结论:移植的ADMSCs可在宿主体内成活,并显著改善兔MI后的心功能.
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脂肪间充质干细胞移植治疗扩张型心肌病大鼠的研究
目的 脂肪间充质干细胞(ADMSCs)移植对扩张型心肌病(DCM)大鼠心肌损伤及心功能的影响.方法 80只健康Wistar大鼠腹腔注射阿霉素建立DCM大鼠模型,按随机数字表法分为治疗组和对照组,各35只(建模中死亡5只,建模后又处死5只).将体外分离培养的ADMSCs移植入治疗组DCM大鼠,同时将以相同体积的IMEM培养基移植入对照组DCM大鼠.术后4周,处死动物留取心脏,于荧光显微镜下观察ADMSCs植入后存活及分化情况.于细胞移植术前、术后4周,将两组大鼠进行超声心动图、血流动力学检查,测定、比较心功能的指标.结果 ①注药4周后,根据留取大鼠心脏的大体形态、病理切片及心功能指标,提示DCM大鼠模型建立成功.②移植术后4周,于移植部位可见DAPI标记的ADMSCs,同时,免疫组织荧光染色发现部分DAPI阳性细胞,TnT染色也为阳性,且排列方向与心肌细胞一致.③移植术后4周,对照组与ADMSCs治疗组比较,左心室舒张末容积(LVEDV)及左心室收缩末容积(LVESV)明显减少(P<0.01);左心室每搏量(SV)、心脏射血分数(EF)、左心室收缩压(LVSP)、左心室室内压大上升/下降速率(±dp/dtmax)均明显增加(P<0.05,P<0.01).结论 ADMSCs移植可在心肌内存活,并可分化为心肌细胞,改善DCM大鼠的心脏功能.
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人脂肪间充质干细胞向表皮细胞表型转化的研究
目的:探索人脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)向表皮细胞表型转化的方法.方法:以手术中剩余的人皮下脂肪组织为材料来源,利用胶原酶消化法分离ADSCs,流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD90、CD105的表达,成脂诱导后油红0染色鉴定.实验组利用第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科实验室已成功构建的pcDNA3.1 (+)/SP+EGF质粒经脂质体介导转染的HaCat细胞,与ADSCs在Transwell小室中共培养,对照组为ADSCs加入10％ FBS培养基,14天后Realtime-PCR检测两组ADSCs中CK19、integrin-β的mRNA表达量.结果:实验组ADSCs中CK19、integrin-β的mRNA表达量较对照组明显升高,且差别有统计学意义.结论:转染EGF的HaCat细胞可诱导ADSCs向表皮细胞表型分化,从而为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持.
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人脂肪间充质干细胞的分离培养及生物学特性研究
目的:探索高效分离和扩增人脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)的方法,观察其生物学特性,并通过形态学、免疫表型及多向分化能力进行鉴定.方法:以手术中剩余的人皮下脂肪组织为材料来源,利用胶原酶消化法分离ADSCs,体外扩增后传代,倒置显微镜观察,MTT比色法测定细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标记CD29,CD31、CD34、CD45、CD90、CD105的表达.在DMEM及胎牛血清培养基、地塞米松、IBMX、吲哚美辛的诱导下向脂肪细胞定向分化;在DMEM及胎牛血清培养基、地塞米松、抗坏血酸、β-磷酸甘油、胰岛素的诱导下向成骨细胞定向分化.结果:原代和传代细胞呈梭形外观,生长增殖能力良好.细胞传代后2天内处于潜伏期,第3天进入生长期,5天后进入平台期.流式细胞仪检测CD29、CD31、CD34、CD45、CD90、CD105阳性率分别为73.4%、3.6%、4.5%、2.O%、97.3%.80.4%.经定向诱导分化后,细胞分别呈现脂肪细胞、骨细胞的表型特征.结论:酶消化法能有效分离纯化人ADSCs,细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有ADSCs的一般生物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持.
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体外培养的人脂肪间充质干细胞生物学特性的研究
目的:了解体外培养的人脂肪间充质干细胞的生物学特性及其体外成脂和成骨的能力.方法:体外培养人脂肪间充质干细胞并传代计数,行成骨和成脂诱导,流式细胞仪检测其细胞增殖周期与表面分子.结果:人脂肪干细胞经过体外培养均一的阳性表达CD44、CD106,而CD49d、CD34、CD45和HLA-DR表达阴性.细胞周期分析表明:G0/G1、S和G 2/M所占比例分别为79.1%、19.7%和1.3%.分离细胞在诱导体系下可以向成骨和成脂方向分化.结论:脂肪间充质干细胞具有特殊的生物学特点,体外能够向成骨和成脂方向分化.
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脂肪间充质干细胞促进皮肤创面修复及其作用机制探讨
大面积深度烧伤以及慢性难愈性创面修复一直是临床治疗的难点.随着干细胞研究的开展和深入,体内外实验证明位于皮下脂肪组织内的脂肪干细胞[1](adipose-derived stem cells, ADSCs)可以有效促进皮肤创面愈合.皮肤创面愈合[2]是一个复杂的多因素过程,涉及炎症反应、细胞增殖、细胞迁移、再上皮化、血管生成、细胞外基质沉积以及重塑等多方面.在创伤条件下,伤口渗液和其中的炎性因子以及有丝分裂原等趋化因子促进ADSCs增殖,向伤口迁移[3].实验证明,ADSCs在体、内外均可以向皮肤表皮细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞等多种细胞分化,分泌多种生物活性分子限制炎症和凋亡、促进血管形成、促进创周组织细胞,参与损伤修复等,终实现促进创面愈合的作用.
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不同年龄段大鼠脂肪间充质干细胞增殖及成骨能力的研究
通过研究年龄对大鼠脂肪间充质干细胞增殖、成骨分化的影响,从而为临床寻找理想的种子细胞来源.用密度梯度离心法分离不同年龄段脂肪间充质干细胞进行培养,并保留贴壁细胞传代,观察细胞生长情况,榆测其增殖活性,诱导后茜素红染色,钙离子浓度测定.结果显示,传代细胞的增殖速度比原代细胞快,但随着年龄的增长脂肪间充质干细胞的增殖能力下降.诱导条件下,各年龄组均出现矿化结节,但钙离子浓度随年龄增加而降低.本实验提示,脂肪间允质干细胞增殖和成骨分化能力随着年龄的增加而降低,但各年龄段脂肪间充质干细胞经过体外增殖、诱导后均可满足临床应用中不同患者的要求.
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复方黄柏液涂剂对脂肪间充质干细胞免疫抑制的影响
目的 探讨复方黄柏液涂剂对人脂肪间充质干细胞(A-MSC)免疫调控能力的影响情况.方法 从人皮下脂肪样本分离间充质干细胞,观察形态学改变和细胞表型,用A-MSC完全培养基按梯度稀释后进行流式细胞术凋亡检测,按1:100稀释后,用CCK-8法检测复方黄柏液涂剂处理24h后的A-MSC对淋巴细胞增殖能力的影响,实时定量PCR法检测复方黄柏液涂剂处理后免疫调控相关基因在A-MSC中的表达情况.结果 所得A-MSC具有典型成纤维细胞形态和显著增殖能力,阳性表达CD29,CD44,CD73,CD90和CD105,不表达CD31,CD45和CD133等血细胞标记,复合MSC国际标准.予低浓度复方黄柏液涂剂处理后,A-MSC对淋巴细胞增殖的抑制作用明显增强,且A-MSC中细胞免疫抑制相关基因表达增加,促炎相关基因表达减弱.结论 复方黄柏液涂剂可通过加强脂肪间充质干细胞免疫抑制能力影响创伤局部炎性微环境.
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大鼠骨髓间充质干细胞与脂肪间充质干细胞生物学特性的比较
目的:本研究旨在比较同一个体来源的脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)和骨髓问充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的生长特点和诱导分化能力.方法:取7～10dSD大鼠的脂肪和骨髓,体外分离、纯化脂肪和骨髓来源间充质干细胞,分别从细胞形态、生长动力学、表面标志、分化潜能等方面进行鉴定和比较.结果:脂肪间充质干细胞的增殖速度明显大于骨髓间充质干细胞(P＜0.05),两种细胞所表达的表面蛋白标志物基本相似,但脂肪间充质干细胞表面蛋白标志CD106呈阴性,而骨髓间充质干细胞CD106呈阳性.在成软骨分化中脂肪间充质干细胞弱表达Ⅱ型胶原,而骨髓间充质干细胞不表达.第5、10、15、20代ADSCs及BMSCs经成骨诱导后茜素红染色均呈阳性且有“矿化”结节形成,碱性磷酸酶活性以第5代强,随着细胞代次的递增,碱性磷酸酶活性呈递减趋势.结论:ADSCs较BMSCs更易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨、成脂、成软骨能力较强,适合作为再生医学的种子细胞.
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5-氮胞苷诱导脂肪间充质干细胞向心肌细胞分化的毒理遗传学研究
目的:观察5-氮胞苷(5-aza)对成人脂肪间充质干细胞(ADMSCs)向心肌细胞方向诱导分化的毒理遗传学影响.方法:自成人脂肪组织中分离培养ADMSCs,用5-aza对ADMSGs进行诱导,设立不同诱导浓度的Ⅰ ,Ⅱ,Ⅲ,(5,10,20μmoL/L)组及对照组Ⅳ,光镜下观察细胞的生长情况及形态学变化,免疫细胞化学方法检测心肌特异性肌钙蛋白I(cT-nI),RT-PCR方法检测cTnI基因的表达,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡,并对各诱导组常规核型分析.结果:诱导后4wk Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ组ADMSCs呈现类似心肌细胞的形态学特征.Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ组免疫组化结果见cTnI阳性表达,RT-PCR条带见cTnI基因表达.各组染色体结构及数目均未见异常.结论:5-aza作为诱导剂对ADMSCs遗传性无不良影响.
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绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪间充质干细胞的多向分化潜能
目的:研究绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠脂肪间充质干细胞(ADSC)体外定向诱导下的多向分化潜能.方法:取出生后4 d的GFP转基因小鼠腹股沟的皮下脂肪组织,经过胶原酶消化,加入脂肪组织来源干细胞条件培养基中培养.将生长状态良好的第5代GFP-ADSCs分别加入成骨及成脂条件培养液进行体外多向分化诱导研究.并分别采用茜素红钙盐染色和油红O染色进行鉴定.结果:成功获得了稳定表达GFP的ADSCs,GFP-ADSC经成骨诱导20 d后茜素红染色可见有橘红色钙盐沉积;经成脂诱导10 d后油红O染色阳性.结论:GFP作为报告基因在ADSCs分化过程中没有被关闭,亦未影响到ASCs的多向分化潜能,是ADSC在体多向分化研究的一个有效示踪工具.
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5-氮胞苷诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化成肌细胞
目的:观察并检测5-氮胞苷(5-Aza)诱导大鼠脂肪间充质干细胞(AMSCs)分化成肌细胞的过程中,细胞形态及相关基因、蛋白的表达情况,探讨5-Aza对大鼠AMSCs分化的诱导作用.方法:分离大鼠AMSCs,在含有10 μmol/L 5-Aza的培养液中培养,观察细胞形态的变化,并通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测诱导后MyoG的表达,免疫细胞化学染色法检测诱导后Desmin和α-Sarcometric Actin的表达.结果:用10 μmol/L 5-Aza诱导后,细胞形态逐渐伸展变长,呈现肌细胞形态;RT-PCR结果显示,诱导后15 h左右开始表达MyoG;免疫细胞化学染色结果显示,诱导10 d后Desmin染色呈弱阳性,14 d阳性程度增强,且此时部分细胞开始表达α-sarcomeric Actin,并随时间延长表达增强,至28 d呈强阳性.结论:采用10 μmol/L 5-Aza可以诱导大鼠AMSCs向肌细胞分化.
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不同年龄段大鼠脂肪间充质干细胞生物学特性的研究
目的 观察不同年龄段大鼠脂肪间充质干细胞(adiposE-derived stromal cells, ADSCs)生物学特点与年龄的关系,为临床寻找理想的种子细胞并迅速获取所需ADSCs提供实验依据.方法 使用密度梯度离心法分离不同年龄段脂肪间充质干细胞进行培养,保留贴壁细胞传代,分析脂肪间充质干细胞的纯度,观察细胞生长情况,检测其增殖活性、细胞周期.结果 不同年龄段ADSCs均贴壁生长,呈典型ADSCs形态和生长特征,传代细胞的增殖速度比原代细胞快,但随着年龄的增长,原代及传代培养ADSCs的增殖能力下降,生长周期延长.结论 ADSCs的增殖能力和活性随着年龄的增长而降低,但各年龄段ADSCs均可满足临床不同患者组织工程种子细胞的要求.
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脂肪间充质干细胞移植对兔心肌梗死后心功能及凋亡的影响
目的:探讨脂肪间充质干细胞(ADMSCs)心肌内移植对兔心肌梗死后心功能及凋亡的影响及其机制.方法:结扎兔左前降支(LAD)制作急性心肌梗死(AMI)模型,同时将4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)标记的ADMSCs注射到梗死区,造模前及移植后4周超声心动图检测心功能,测量左室体重指数,缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞并计数.结果:移植组可见标记的植入细胞,心功能较对照组明显改善,左室体重指数、凋亡指数均显著小于对照组.结论:脂肪间充质干细胞心肌内移植能减少兔心梗后心肌细胞凋亡、减轻左室重构,从而改善兔心肌梗死后心脏功能.
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慢病毒载体介导增强绿色荧光蛋白感染人脂肪间充质干细胞及其成脂分化的实验研究
目的 探讨慢病毒载体介导增强绿色荧光蛋白(EGFP)感染人脂肪间充质干细胞(hADSCs)的佳条件与其成脂分化能力.方法 以不同感染复数(MOI)感染hADSCs8h,在荧光倒置显微镜下观察感染效果;流式细胞仪检测感染率;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测感染前后hADSCs的增殖情况;成脂诱导14d后油红O染色,Image-ProPlus图像分析软件比较hADSCs在感染前后的成脂能力.结果 以MOI值1、10、25、50、75、100、150感染hADSCs时,其感染率依次为0.24％、13.48％、40.33％、89.27％、94.52％、98.49％和99.11％.以MOI值50感染hADSCs,比较感染前后细胞的增殖与成脂能力,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 慢病毒感染hADSCs的佳MOI值为50.
