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肝素联合层黏连蛋白对大鼠脂肪间充质干细胞向运动神经元分化的影响
目的 研究单独或联合应用肝素(heparin)与层黏连蛋白(laminin)对大鼠脂肪间充质干细胞(AD-MSCs)向运动神经元分化的影响.方法 用酶消化法分离纯化SD大鼠AD-MSCs,取传至第3代的AD-MSCs,检测表面抗原CD31、CD44、CD49d及CD106的表达情况,MTT法检测增殖活性.根据处理因素不同为4组:空白对照组,不加任何诱导剂;L组(laminin组),加入1μg/ml层黏连蛋白;H组(heparin组),加入50μg/ml肝素;HL组(heparin+laminin组),加入50μg/ml肝素和1μg/ml层黏连蛋白.细胞诱导后第15天,观察细胞形态的变化;采用免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、Hb9和ChAT的表达,比较各组抗体的阳性率.诱导后3、6、9、12和15d分别收集各组细胞,ELISA法检测细胞内Ach的含量.结果 原代细胞为贴壁生长的长梭形细胞,流式细胞仪检测结果显示,CD44高表达,CD49d低表达,CD31、CD106阴性.MTT法结果表明AD-MSCs经多次传代培养后,其增殖能力没有明显降低.空白对照组和L组细胞诱导后形态变化不明显,NSE阳性表达率均很低,两者之间无明显差别.H组和HL组细胞诱导第15天后具有神经元样形态;NSE的阳性表达率比其他两组明显增多.H组和HL组细胞诱导后可见Hb9表达阳性,阳性率分别为为6.89％和30.47％,ChAT阳性率分别为10.83％和39.36％,其他两组无Hb9和ChAT表达,各组的GFAP均低表达.ELISA检测结果显示,对照组和L组诱导后细胞不表达乙酰胆碱(Ach),而H和HL组自诱导后第9天起表达Ach,且随着诱导时间的延长逐渐增加,到第15天时分别达到1.27和4.98ng/ml.结论 肝素联合层黏连蛋白能显著促进大鼠AD-MSCs向运动神经元分化.
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脂肪间充质干细胞移植治疗兔急性心肌梗死的实验研究
目的 探讨脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)移植治疗兔急性心肌梗死后心力衰竭的作用及其可能机制.方法 30只健康日本大耳白兔随机分为注射磷酸盐缓冲液的假手术组(n=10)、心肌梗死对照组(n=10)以及注射ADMSCs移植组(n=10).结扎兔前室间支,建立急性心肌梗死动物模型,急性心肌梗死1 h内将4',6-二脒-2-苯基吲哚(4',6-diamidio-2-phenylindole,DAPI)标记的第三代ADMSCs(5×10 (6)个,1 mL)植入ADMSCs移植组梗死心肌,对照组及假手术组注射等量磷酸盐缓冲液液.术前及术后4周分别做超声心动图检查其心功能变化.取心肌梗死区组织作冰冻切片,荧光显微镜下验证移植后的ADMSCs是否向心肌细胞分化,苏木素-伊红染色和CD34免疫组化观察梗死区毛细血管新生情况.结果 超声心动图检测证实移植后4周ADMSCs组左心室收缩末期直径、舒张末期直径与左心室重量指数均小于心肌梗死对照组[(0.72±0.04)cm vs.(0.88±0.07)cm,P<0.05;(1.07±0.12)cm vs.(1.21±0.09)cm,P<0.05;(1.176±0.057)g/kg vs.(1.361±0.095)g/kg,P<0.05],而短轴缩短率、射血分数均大于心肌梗死对照组[31.87%±2.03% vs.28.00%±3.38%,P<0.05;51.75%±3.37% vs.43.13%±3.72%,P<0.05];ADMSCs移植组荧光显微镜下可以观察到DAPI标记细胞存在,并分化为心肌样细胞;CD34免疫组化染色显示ADMSCs组梗死局部毛细血管密度明显高于心肌梗死对照组[(20.00±2.65)个 vs.(7.75±2.12)个,P<0.05].结论 同种舁体移植的ADMSCs能够在梗死心肌内存活并分化为心肌样细胞,增加梗死区血管新生,抑制心室重构、改善心肌梗死后心功能.
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腺病毒介导的BMP-2基因诱导脂肪间充质干细胞向成骨细胞定向分化
目的 探讨入骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因通过腺病毒转染青山羊脂肪间充质干细胞(ADSCs)的可行性及其向成骨细胞定向分化的能力.方法 取麻醉状态下青山羊腹股沟脂肪组织,经体外分离培养获得ADSCs,转染以腺病毒介导的人BMP-2基因.倒置相差显微镜观察细胞形态,MTT法检测ADSCs生长增殖情况,免疫细胞化学法对ADSCs细胞进行碱性磷酸酶(ALP)活性测定,SABC法检测ADSCs Ⅰ型胶原的表达,通过RT-PCR、Western blot法检测BMP-2基因的表达水平.结果 转染人BMP-2基因的ADSCs形态规则;细胞生长速度快,且随培养时间的延长逐渐增多(P＜0.05);成骨诱导后,转染组细胞ALP活性和Ⅰ型胶原表达强度明显高于未转染组(P＜0.05);转染组ADSCs BMP-2基因mRNA水平和蛋白含量均明显强于未转染组(P＜0.05).结论 经腺病毒介导的人BMP-2基因转染的青山羊ADSCs在体外诱导培养中可以向成骨细胞定向分化,并保持较强的增殖能力;转染后细胞BMP-2目的基因表达增高.
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脂肪来源间充质干细胞治疗克罗恩病的实验研究
目的：探讨脂肪来源间充质干细胞（ADMSC）在克罗恩病（CD）治疗中的作用及可能的作用机制。方法采用三硝基苯磺酸（TNBS）法建立CD小鼠动物模型。将75只6～8周龄SPF级雌性BALB／c小鼠，随机分成3组，包括对照组（乙醇溶液灌肠加PBS腹腔注射）、TNBS组（TNBS灌肠加PBS腹腔注射）和ADMSC组（TNBS灌肠加ADMSC腹腔注射），每组25只。通过免疫组织化学染色和实时定量 PCR等方法检测组织炎性细胞因子的水平，并记录各组小鼠生存曲线。结果 ADMSC组较TNBS组病变程度明显减轻，生存率明显增加（60％比30％，P＜0．05）。ADMSC组促炎因子坏死因子α（TNF-α）、白介素12（IL-12）及血管内皮生长因子（VEGF）的表达显著低于TNBS组，而抑炎因子IL-10的表达显著增加（均P＜0．05）。结论 ADMSC可能通过下调促炎因子TNF-α、IL-12和VEGF的表达和上调抑炎因子IL-10的表达，有效修复结肠炎性损伤，有望用于CD的临床治疗。
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脂肪间充质干细胞在神经修复中的研究进展
脂肪间充质干细胞(ADSC)具有自我更新和多向分化的潜能,可被诱导分化为神经元、神经胶质细胞等,表达多种神经营养因子并具有免疫调节作用,且来源广泛、采集方便、无伦理学问题,为神经修复及功能重建提供了新的细胞来源,可在多种神经系统疾病中发挥治疗作用.
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经γ射线辐照后的脂肪间充质干细胞对大鼠薄型子宫内膜的治疗作用
目的 直接进行脂肪间充质干细胞(ADSCs)移植治疗疾病,有可能因为干细胞的无限增殖能力导致治疗的风险性升高,尤其是有致瘤的风险.本实验将γ射线辐照后的ADSCs移植入小鼠薄型子宫内膜模型,以提高治疗安全性.方法 ADSCs取材于雌性SD大鼠,应用流式细胞技术进行鉴定后,分别以0、5和10Gy的γ射线辐照ADSCs.24只薄型子宫内膜模型SD大鼠随机分为4组,在造模6-8h后子宫内移植未经辐照的ADSCs(组Ⅰ)、经5 Gy辐照的ADSCs(组Ⅱ)、经10 Gy辐照的ADSCs(组Ⅲ),或仅子宫内注射PBS(组Ⅳ).测量各组大鼠细胞移植后子宫内膜的厚度变化以观察治疗效果.结果 ADSCs经10 Gy的辐照后完全失去了增殖能力.组Ⅰ和组Ⅱ大鼠在细胞移植治疗后子宫内膜厚度比组Ⅳ有显著增加(P＜0.01),但是组Ⅲ和组Ⅳ大鼠的子宫内膜厚度无显著差异.结论 γ射线破坏了ADSCs的增殖能力,经10Gy照射后,ADSCs完全失去了增殖能力并失去了治疗能力.经5Gy照射后的ADSCs部分丧失了增殖能力,但仍有治疗效果,能够改善子宫内膜的厚度.
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艾塞那肽通过SDF-1/CXCR-4/Rho GTPase通路增强脂肪来源间充质干细胞的趋化性迁移
目的：探究艾塞那肽对脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）迁移的影响，并证实Rho GTPase为SDF-1/CXCR-4迁移通路的下游效应蛋白。方法分离并培养大鼠来源ADSCs并通过流式细胞术及体外诱导分化鉴定。应用RTCA xCELLigence系统检测艾塞那肽对ADSCs增殖能力的影响。Transwell观察不同浓度艾塞那肽，AMD3100（CXCR-4阻断剂），CCG-1423（Rho GTPase阻断剂）处理对ADSCs趋化性迁移能力的影响。流式细胞术及Western blot技术分别检测不同艾塞那肽浓度处理组细胞CXCR-4蛋白表达水平。活化的Rho蛋白pull-down检测试剂盒检测艾塞那肽处理组和AMD3100阻断组Rho GTPase表达情况。激光共聚焦显微镜观察不同处理组细胞应力纤维形成情况。结果 RTCA xCELLigence系统提示艾塞那肽处理24h内对ADSCs的增殖能力无明显影响。艾塞那肽呈浓度依赖性的增加ADSCs的趋化性迁移能力，AMD3100及CCG-1423可阻断这种效应（P<0.05）。流式细胞术及Western blotting结果都表明CXCR-4蛋白随艾塞那肽处理浓度升高而表达上调。此外， Western blot实验证实Rho GTPase的表达受SDF-1/CXCR-4通路影响。共聚焦显微镜观察到应力纤维的形成与SDF-1/CXCR-4/Rho GTPase通路相关。结论艾塞那肽能增强ADSCs的趋化性迁移能力，Rho GTPase为SDF-1/CXCR-4经典归巢通路的下游效应蛋白。
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脂肪来源的间充质干细胞分离方法的改进
目的:从供体年龄、取材部位、提取方法3方面来研究稳定的脂肪间充质干细胞(ADMSCs)分离提取方法.方法: 从兔颈背部皮下、肌间以及腹股沟皮下的脂肪组织取材,分别采用一次消化收集法和多次消化收集法分离提取ADMSCs,单层传代培养.分别比较不同提取方法,老年兔、壮年兔与幼年兔,同一供体不同部位的脂肪组织,所分离的ADMSCs产量和生物学特性.结果: 运用多次消化收集法能从脂肪组织中稳定分离出生长旺盛的ADMSCs,与一次消化收集法相比能显著提高所获取的的细胞产量.从老年兔、壮年兔、幼年兔以及同一供体的不同部位脂肪组织中所提取的ADMSCs生长增殖活性无明显差异,但从单位体积脂肪组织提取得到的ADMSCs产量显著不同.结论: 多次消化收集法能显著提高分离获得的ADMSCs产量,是对传统的一次消化收集法的改进.选择不同供体年龄和取材部位提取ADMSCs,对细胞的生物学活性影响不大,但对细胞产量有明显影响.
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自体脂肪间充质干细胞移植对糖尿病大鼠肾功能的改善作用
目的：利用动物模型研究自体脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells ， ADMSCs ）移植对糖尿病大鼠肾功能的改善作用。方法：SD 大鼠连续5 d 腹腔注射40 mg／kg 链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）建立1型糖尿病动物模型。造模4周后随机将18只 SD 大鼠分为糖尿病组（n ＝9）和ADMSCs移植组（n ＝9），另选正常大鼠作为对照组（n ＝9）。取自体ADMSCs经体外培养、鉴定后，尾静脉注射到ADMSCs组大鼠体内。于ADMSCs移植8周后测定各组大鼠血糖、胰岛素、血尿素氮、血肌酐和24 h尿蛋白的水平，并测量体重、肾重。结果：ADMSCs经体外培养后表达间充质干细胞表型抗原，并能够诱导分化为成骨细胞和成脂细胞。糖尿病组和ADMSCs 组大鼠的血糖、尿素氮、血肌酐、24 h 尿蛋白及肾重／体重比值均明显高于对照组（P ＜0．05）。 ADMSCs 组大鼠的血糖、尿素氮及肾重／体重比值均低于糖尿病组（P ＜0．05），且胰岛素水平较糖尿病组有所升高（P ＜0．05）。另外，ADMSCs 组较糖尿病组的24 h 尿蛋白和血肌酐水平下降，但差异无统计学意义。结论：自体ADMSCs移植能够在一定程度上改善和缓解1型糖尿病大鼠的肾功能紊乱。
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脂肪间充质干细胞向肝细胞横向分化的研究
目的 探讨脂肪源性间充质干细胞(AMSC)向肝细胞横向分化的可能性.方法 胶原酶消化脂肪组织,贴壁培养,体外扩增后以流式细胞仪鉴定其表面标志.取扩增3代的AMSC分为2组,诱导分化组在含有2%FBS的DMEM F12培养基中加入肝细胞生长因子20 ng/ml和成纤维细胞生长因子4 10ng/ml、1×ITS和地塞米松0.1μmol/L,培养14 d;空白对照组则不加任何细胞因子.RT-PCR检测诱导分化过程中肝细胞核因子1、GATA4等基因转录水平的变化.2周后,采用流式细胞术检测AFP和Alb阳性细胞在两组细胞中的比例,检测肝细胞特异性细胞角蛋白(CK)18、CK19的表达.结果 分离、培养的AMSC呈成纤维细胞样生长,可以稳定传代.流式细胞术检测结果显示第3代脂肪间充质干细胞高表达表面CD29、CD44;不表达CD34、CD45.RT-PCR检测诱导5、8、11、14 d的细胞,显示有肝细胞特异性转录因子GATA4和肝细胞核因子1A基因的表达,并随时间延长而逐渐增多.流式细胞术检测诱导14 d的细胞,发现30.0%的细胞表达Alb,17.8%细胞表达AFP,双阳性的细胞为6.9%;免疫荧光检测发现诱导细胞表达CK18、CK19.空白对照组脂肪间充质干细胞则未见上述各项变化.结论 在低血清培养体系中,采用细胞因子联合诱导,显示脂肪间充质细胞在体外能定向分化为肝细胞样细胞.
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兔脂肪间充质干细胞的培养鉴定及体外磁标记MR成像
目的 研究兔脂肪间充质干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)的培养鉴定方法,联合应用超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide particles,SPIO)和多聚赖氨酸(poly-l-lysine,PLL)行体外磁标记细胞,探讨磁标记示踪的可行性.方法 分离、纯化并培养兔ADSCs,流式细胞术鉴定细胞表面抗原CD90、CD44和CD34.应用SPIO-PLL标记细胞,普鲁士蓝染色和透射电镜检测胞内铁粒子.体外3.0T MR分别对1×107个未标记ADSCs(空白对照),经25、50、75 μg/mL SPIO-PLL分别标记的1×107个细胞,经25 μ,g/mL SPIO-PLL标记的1×107个(标记1d)、1×10 7个(标记3d)和5×106个(标记1d)ADSCs进行成像,包括T1WI、T2WI及T2* WI序列,测量各组的信号强度和弛豫时间.结果 第3代ADSCs纯度高、排列规则,细胞呈漩涡状,流式细胞术检测结果示CD44和CD90阳性表达率分别为99.2％、98.7％,CD34表达阴性.普鲁士蓝染色和透射电镜示胞浆内蓝色颗粒,磁标记率近100％.MR示随着SPIO-PLL浓度增高,T2* WI和T2WI序列的信号强度变化较T1WI明显.1×10 7个ADSCs(标记1d)的信号强度变化率较1×107个(标记3d)和5×106个(标记1d)大,T2*和T2弛豫时间与T1弛豫时间相比差异均有统计学意义(F=161.47,P＜0.05),但T2*和T2弛豫时间相比差异无统计学意义(F=5.88,P＞0.05).结论 通过分离纯化培养可获得足量的ADSCs,SPIO-PLL能够有效标记ADSCs,体外可行MR细胞成像,以T2* WI和T2WI序列敏感.
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旁分泌机制在脂肪间充质干细胞移植治疗心肌梗死中的作用
目的 探讨旁分泌机制在脂肪间充质干细胞(adiopose-derived stem cells,ADSC)移植治疗心肌梗死中的作用.方法 原代分离和培养人ADSC,将经鉴定的第3～5代的ADSC用于实验.①用8～ 10周龄(20～24 g)的雄性C57 B/L小鼠,结扎左前降支建立心肌梗死(myocardial infaretion,MI)损伤模型,实验分假手术组,MI+ DMEM/F12组和MI+ ADSC-CM(conditioned medium,条件培养液)组(n=12).在MI处理的小鼠心肌梗死边缘区分别注射DMEM/F12和ADSC-CM,观察动物生存率、TTC染色测量心肌梗死面积、超声评价心功能变化、TUNEL染色检测心肌细胞凋亡等方法评价心肌梗死的治疗效果.②用H2O2建立乳鼠心肌细胞(neonatal rat ventricular myocytes,NRVM)体外损伤模型,观察ADSC-CM对心肌细胞的保护作用.实验分对照组,H2O2+ DMEM/F12组和H2 O2+ ADSC-CM组(n=5).分别用caspase-3 蛋白定量和TUNEL染色检测心肌细胞凋亡.结果 ①相较于DMEM/F12,ADSC-CM显著减少心肌梗死面积[(35.3±0.5％)vs(41.7±1.9％)P ＜0.05]、提高心功能[EF:(60.4±4.8)％vs(47.2±3.7)％,P＜0.05]、减少梗死边缘区心肌细胞凋亡[TUNEL+心肌细胞/106细胞核:(677.4±64.2) vs (867.3±67.9),P＜0.05]；②相对于DMEM/F12,ADSC-CM明显减少H2O2诱导的心肌细胞凋亡[caspase-3蛋白表达下降；TUNEL阳性率:(58.84±2.19)％vs(71.65±0.86)％,P ＜0.05].结论 ADSC-CM通过减少心肌细胞凋亡发挥对心肌梗死的治疗作用；旁分泌作用是ADSC移植治疗心肌梗死的重要机制.
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复合同种异体类雪旺细胞的异种神经支架修复面神经损伤的早期实验研究
目的 探讨化学联合冻融方式处理的脱细胞异种神经支架复合体外培养的同种异体类雪旺细胞后修复面神经损伤的实验效果.方法 取日本大耳白兔腹股沟脂肪垫,通过单酶消化法体外培养脂肪间充质干细胞(adiopose-deribed stem cell,ADSCs),并通过化学试剂及自体富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)体外定向诱导成类雪旺细胞(schwann cell-like cell lineages,SCs-like);取Wistar大鼠双侧坐骨神经,通过化学联合冻融的方式制备脱细胞异种神经支架.使用DiOC16(3)荧光探针进行类雪旺细胞的标记.建立兔面神经5 mm的缺损模型,以不同移植物确立3组实验分组(n=10):A组(自体神经修复组);B组(复合DiOC16-SCs的异种神经支架修复组);C组(单纯异种神经支架修复组).术后8周通过再生神经的电生理、有髓神经纤维密度及特异性蛋白定量评价神经功能的早期修复效果.结果 术后各组动物分笼饲养,均存活良好.解剖时发现各组动物再生神经连续性及完整性均良好,未形成明显的神经瘤.术后8周各组术侧动作电位潜伏期延长,A、B组明显快于C组,且A组与B、C组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).甲苯胺蓝染色计算再生有髓神经纤维密度,A、B组明显高于C组(P＜0.05),A、B组之间比较差异无统计学意义.再生神经内特异性蛋白神经生长因子(nerve growth factor,NGF)及脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)染色观察,可见A、B组内NGF及BDNF的蛋白含量均高于C组(P＜0.05),且A组NGF蛋白含量高,B组BDNF蛋白含量高.结论 复合体外定向诱导的类雪旺细胞的脱细胞异种神经支架在修复面神经5 mm的缺损中早期获得的修复效果与自体神经的修复效果相近.
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2型糖尿病患者脂肪间充质干细胞成脂肪分化能力的实验研究
目的 探讨2型糖尿病(T2DM)患者与健康者脂肪间充质干细胞(ADSCs)成脂肪分化能力.方法 取T2DM患者与健康者脂肪组织,分离培养出ADSCs.取第3代细胞接种,比较两组细胞细胞表型及生长速度的差异.加入成脂肪诱导液,观察两组细胞成脂肪分化情况,于第14天加入油红O对细胞进行染色并观察,用异丙醇对油红O进行萃取并比较两组细胞吸光度值,通过实时荧光定量(PCR)法比较两组细胞成脂肪分化14 d时PPAR-γ、C/EBP-α和C/EBP-β的表达水平.结果 T2DM患者和健康者ADSCs在细胞表型及生长速度方面比较差异无统计学意义(P＞0.05),成脂肪诱导分化14 d时T2DM患者ADSCs油红O吸光度值明显高于健康者ADSCs,T2DM患者ADSCs PPAR-γ、C/EBP-a、C/EBP-β表达水平明显高于健康者ADSCs.结论 T2DM患者ADSCs成脂肪分化能力明显高于健康者,其可能是T2DM患者容易并发肥胖的原因之一.
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阿魏酸联合脂肪间充质干细胞调节TGF-β/Smad信号转导通路对肝星状细胞凋亡的影响研究
目的 探讨阿魏酸(FA)联用大鼠脂肪间充质干细胞(ADMSCs)调节TGF-β/Smad信号转导通路对肝星状细胞(HSCs)凋亡的影响.方法 实验将HSCs分为4组:空白组、FA组、ADMSCs组、FA+ADMSCs组.流式细胞术检测各组HSCs的凋亡率;qRT-PCR检测HSCs中TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA的表达水平;Western blot检测HSCs中TGF-β1和Smad7蛋白、Smad2/3磷酸化(p-Smad2/3)表达变化.结果 与其他3组比较,FA+ ADMSCs中HSCs凋亡率明显升高(P＜0.05);TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达明显下降,Smad7 mRNA表达明显升高(P＜0.05);TGF-β1蛋白、p-Smad2/3表达明显降低,而Smad7蛋白表达明显升高(P＜0.05).结论 FA能增强ADMSCs对HSCs中TGF-β1表达的下调作用,进而导致下游p-Smad2/3活性下降及Smad7表达升高,从而参与促进细胞凋亡.
关键词： 阿魏酸 脂肪间充质干细胞 肝星状细胞 细胞凋亡 TGF-β/Smad信号转导通路 -
间充质干细胞抗衰老的理论研究进展
研究抗衰老是当今社会的热点课题.干细胞是具有自我更新能力和多向分化能力的细胞,间充质干细胞包含其中.研究常用的间充质干细胞有骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞,二者均在组织修复和抗衰老方面有广泛的应用,有很好的发展前景.本文综述了近年来脂肪间充质干细胞抗衰老作用的特点、机制及应用研究进展.
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不同电刺激波形对脂肪间充质干细胞定向排列的影响
目的 探讨不同电刺激波形对脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)定向排列和细胞存活率的影响.方法 取5周龄SD大鼠(体质量100 ～ 150 g)体外分离培养ADSCs.用第3～5代细胞制备细胞爬片,放入自制电场生物反应器中,分别施以电场强度为1、2、3、4、5、6 V/cm的直流电刺激(分别设为A1、A2、A3、A4、A5、A6组);电场强度6 V/cm、占空比50％、频率1 Hz和2 Hz的方波电刺激(分别为B1、B2组);电场强度6 V/cm、脉宽2 ms、频率1 Hz和2 Hz的双相脉冲波电刺激(分别为C1、C2组).对照组(D组)不施加电刺激.采用倒置显微镜定时拍照法观察ADSCs在电场作用过程中的形态学变化,计算细胞排列的平均对齐指数(orientation factor,OF);采用罗丹明-鬼笔环肽荧光染色分析电场刺激后细胞的骨架排列;活死染色法分析细胞存活率;钙离子荧光染色标识电刺激中细胞内钙离子分布,分析细胞钙离子活动功能.结果 ADSCs对直流电刺激的响应与电场强度相关,电场强度越高,形成垂直排列的细胞越多;各时间点B1、B2组及C1、C2组均未发现明显的细胞定向排列现象.除A5、A6组平均OF显著高于D组(P＜0.05)外,其余各组平均OF与D组比较差异均无统计学意义(P＞0.05).细胞骨架染色分析表明,A5、A6组细胞形成紧密的束状细胞骨架结构,且趋向于垂直电场矢量方向排列.细胞活死染色显示,除A4、AS、A6组细胞存活率显著低于D组(P＜0.05)外,其余各组细胞存活率与D组比较差异均无统计学意义(P＞0.05).钙离子荧光染色显示,A4、A5、A6组细胞内的钙离子荧光强度稍高于D组,其余各组细胞内的钙离子荧光强度与D组比较无显著差别.结论 直流电场强度5 V/cm和6 V/cm刺激可引起ADSCs定向排列,直流电场强度低于5 V/cm以及方波和双相脉冲波均未引起细胞定向排列;电刺激后细胞存活率与电场强度成负相关.
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脂肪间充质干细胞在皮肤创伤修复中的研究进展
目的 综述脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)在皮肤创伤修复中的研究进展.方法 广泛查阅近年来将ADSCs应用于皮肤创伤修复的相关文献,对ADSCs进行皮肤创伤修复的体外、体内及临床研究治疗效果、可能机制、新应用技术进行综述.结果 体外、体内及临床研究均证实,ADSCs主要通过直接分化为皮肤创伤修复所需的靶细胞和间接旁分泌作用促进多种皮肤创伤修复所需细胞系的增殖与迁移来实现促进修复的作用.新兴支架材料、细胞膜片技术可进一步提高ADSCs促进创面愈合的能力.结论 ADSCs促进皮肤创伤修复的研究取得了显著进展,而ADSCs的应用途径仍有待进一步研究.
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腺病毒介导的骨形态发生蛋白-2基因转染脂肪间充质干细胞的实验研究
目的探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2(Ad-hBMP-2)基因转染大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)的可行性及其成骨特性.方法取4周龄SD大鼠腹股沟的脂肪组织,经体外分离培养的方法获得ADSCs,分别转染以腺病毒为载体的绿色荧光蛋白(Ad-GFP)基因和Ad-hBMP-2基因.用荧光显微镜每隔12 h观察转染Ad-GFP的细胞,并确定转染率,观察其形态变化,绘制生长曲线;利用免疫细胞化学法对转染Ad-hBMP-2的细胞作碱性磷酸酶(ALP)染色,用免疫细胞化学法作骨钙素(OC)检测确定成骨活性,Western blot法检测hBMP-2的表达.结果12 h后荧光显微镜观察转染Ad-GFP的细胞,有52%的阳性表达细胞,48 h后转染率达95%;转染Ad-hBMP-2后倍增时间延长,ALP、OC检测为阳性表达,hBMP-2蛋白转染后48 h为阳性表达,并持续至第5代.结论ADSCs可以作为腺病毒转染的载体,转染Ad-hBMP-2基因后有明显的成骨作用,可以作为骨组织工程的种子细胞.
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脂肪间充质干细胞在颅颌面修复重建中的应用
颅颌面软硬组织缺损是临床常见病和多发病，对患者容貌和功能均有严重妨碍。其修复重建是涉及多学科的综合性临床难题，目前仍有不少问题亟待解决。组织工程的发展为颅颌面修复重建带来了新的思路，而种子细胞来源是组织工程研究的首要问题。近年来，脂肪间充质干细胞因其具有来源广泛、取材方便、诱导条件下多向分化、扩增能力强等优点而成为较为理想的种子细胞。本文就脂肪间充质干细胞在颅颌面修复重建中的应用进展作一综述。
