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P物质与白细胞介素1β在膝骨关节炎发病中的作用及其相关性
目的:研究显示,炎性细胞因子和神经肽与炎性相关疾病关系密切.实验通过检测骨关节炎患者膝关节滑液中P物质和白细胞介素1β的含量,探讨P物质、白细胞介素1β和膝骨关节炎发病以及病情严重程度之间的相互关系.方法:选择2006-03/09在中南大学湘雅医院门诊就诊和病房住院的膝关节骨关节炎患者50例,根据综合评分法,轻度15例,中度20例,重度15例;选取急性膝关节创伤患者6例为对照组.分别在就诊时或手术前抽取膝关节滑液至少1 mL,采用酶联免疫吸附试验法检测膝关节液中P物质与白细胞介素1β的含量.结果:56例患者均进入结果分析.①骨关节炎组膝关节液中P物质和白细胞介素1β浓度高于对照组,差异有显著性意义 (P < 0.05).②滑液中白细胞介素1β浓度与骨关节炎严重程度呈正相关(r =0.79, P < 0.01),滑液中P物质与骨关节炎严重程度呈正相关(r=0.76, P < 0.01),滑液中白细胞介素1β与P物质浓度呈正相关(r =0.83, P < 0.01).结论:①P物质和白细胞介素1β与膝骨关节炎的发病和病情发展密切相关.②P物质和白细胞介素1β在骨关节炎的发病及病情发展中可能相互协同作用.
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经髂腹股沟入路伯尔尼髋臼周围截骨术后并发症:182例回顾性分析
目的:经髂腹股沟入路髋臼周围截骨术是一项对术者技术要求很高的手术,也意味着它存在一个非常陡峭的学习曲线,在早期往往会遇到比较严重的并发症.统计分析经髂腹股沟入路髋臼周围截骨术存在的手术并发症,探讨如何从手术方法上减少并发症的发生,从而缩短学习曲线.方法:选择1997-10/2007-05北京积水潭医院矫形骨科进行的伯尔尼髋臼周围截骨术患者182例202髋.男17例,女165例;年龄12～48岁,平均27岁.患者手术前后均测量了CE角、AC角并进行了Harris评分.对该组患者术后并发症进行回顾分析.结果:182例全部进入结果分析.①患者术前外侧CE角平均为2.94°,AC角平均为27.7°,前方CE角平均为8.94°,术后外侧CE角平均为30.1°,AC角平均为5.5°,前方CE角平均为26.9°.②患者术前Harris评分平均87分,术后平均93分.③共有42例出现术后并发症,占总病例数的20.8%.与截骨相关的并发症有关节内截骨2例,截骨矫正不足或过度矫正5例,耻骨支截骨不愈合8例,因患者没有症状或症状轻微,未进行处理,内固定失效1例;血管神经并发症有股静脉损伤2例,术后下肢静脉血栓5例,股神经损伤1例,坐骨神经损伤1例,股外侧皮神经永久性损伤9例;膀胱功能障碍2例;切口疝4例;男性性功能障碍2例.上述并发症中发生在早期经验不足阶段约为81%.结论:经髂腹股沟入路髋臼周围截骨术是治疗成人髋臼发育不良非常有效的手术方法,因手术方法技术要求高,约81%并发症发生在早期经验不足阶段.
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E1A激活基因阻遏子蛋白过表达可抑制人血管平滑肌细胞的迁移
背景:成熟动脉中膜血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)分化稳态的丧失是血管老化的一个重要原因.目的:观察E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)抑制人血管平滑肌细胞迁移的分子机制.方法:应用已建立的稳定转染CREG过表达细胞hVSMCs-CREG和CREG表达沉默的hVSMCs-siCREG细胞株通过刮伤实验和Transwell小室细胞移行实验检测细胞迁移能力,通过Western blot检测转染前后细胞中CREG蛋白、基质金属蛋白酶和JNK表达及活化情况,应用JNK和基质金属蛋白酶9抑制剂阻断研究分析上述信号分子表达变化在细胞迁移中的作用.结果与结论:Western blot结果证实,CREG蛋白表达在hVSMCs-CREG组中增加(P < 0.05),而在hVSMCs-siCREG组中减少(P < 0.05).刮伤实验和Transwell实验分析结果证实hVSMCs-CREG组细胞较正常对照组细胞迁移能力受抑.相反,hVSMCs-siCREG组细胞迁移能力显著增加(P < 0.05).Western blot和明胶酶谱分析证实hVSMCs-siCREG组细胞中MMP9活性明显增加(P < 0.05),同时JNK蛋白活化.进一步应用JNK抑制剂阻断研究证实,CREG蛋白表达抑制引起的血管平滑肌细胞迁移能力增加与细胞中基质金属蛋白酶9活性均受到剂量依赖性抑制.结果证实,CREG蛋白表达可抑制JNK-基质金属蛋白酶9信号通路的活化,以此抑制体外培养的人血管平滑肌细胞迁移.
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止血带引起肢体缺血再灌注损伤与七叶皂苷钠的预处理
目的:七叶皂苷钠能够清除机体内自由基,起到保护血管壁的作用,实验拟进一步观察七叶皂苷钠预处理对止血带引起的肢体缺血再灌注损伤的保护作用.方法:选取南京中医药大学附属医院2006-08/2007-02期间择期骨科下肢手术患者40 例.分为对照组20例,给药组20例.给药组在上止血带前30 min静脉滴注含有5 mg七叶皂苷钠的注射液100 mL;对照组在相同时间点给予等量生理盐水.在上止血带前以及松止血带后5,10,20 min抽取静脉血4 mL分别测量血乳酸、超氧化物歧化酶、丙二醛和一氧化氮的含量变化,并观察患者在4个时间点的血压及脉搏的变化.结果:40例患者均进入结果分析.①与放气前比较,对照组舒张压在放气后5,10 min均下降(P < 0.05),乳酸在放气后5,10 min升高(P < 0.05).②与放气前比较,两组乳酸水平在放气后5 min,10 min,20 min均升高(P < 0.05).③与对照组比较,给药组超氧化物歧化酶值在放气后5,10,20 min均升高(P < 0.05),舒张压在放气后5 min升高(P < 0.05),乳酸在放气后10 min升高(P < 0.05),收缩压、丙二醛、一氧化氮值均无变化.结论:七叶皂苷钠预处理对止血带引起的肢体缺血再灌注损伤有一定的保护作用,它可能是通过提高超氧化物歧化酶的活性来实现,对乳酸,丙二醛和一氧化氮变化无明显影响.
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不同运动水平大学生躯干屈伸肌群等速肌力和耐力测定
目的:等速测定不同运动水平的健康年轻人躯干屈伸肌群肌力和耐力,了解年轻人躯干肌群的肌肉功能特点.方法:①受试者为2005级首都体育学院一年级大学生120名,其中男60名,女60名.②按不同标准分为3组,普通非体育专业的大学生、普通体育教育专业的大学生、获得二级运动员的运动系大学生,每组40名,男女各20名.受试者均自愿参加测试.测试仪器: 使用Cybex6000型等动测力系统(美国).③测试方法:对健康大学生躯干屈伸肌群的肌力[测试速度为60(°)/s和120(°)/s]和耐力[测试速度为120(°)/s]等速测试.④测试指标为峰值力矩、躯干屈/伸肌群峰力矩比值、耐力比、恢复比.结果:①躯干屈伸肌的峰值力矩值变化趋势:在同一测试速度下,普通组、体教组及二级组男性躯干屈伸肌的峰值力矩值均伸肌大于屈肌;随着测试速度的增加,躯干屈伸肌的峰值力矩值有下降趋势,伸肌下降明显;普通组的躯干屈伸肌的峰值力矩值小于体教组和二级组(P＜0.05),后二者差异无显著性(P＞0.05);女性3组屈伸肌的峰值力矩值变化同上.在 60(°)/ s和120(°)/s时的躯干屈/伸肌群峰力矩比值,男性均小于1,女性均大于1.②在同一测试速度下,3组男性及女性躯干伸肌群的耐力比和恢复比均低于屈肌群.结论:与体育教育专业和二级运动员大学生相比,非体育专业大学生存在着明显的腰背肌力下降,以及躯干屈伸肌力失衡.不同运动水平大学生伸肌群肌力和耐力弱于屈肌群.
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构建兔菜花耳模型和曲安奈德对耳郭的影响
背景:菜花耳主要是皮下的纤维组织增生,目前还没有找到一种令人满意的动物模型,曲安奈德常用于治疗增生性瘢痕和咬肌肥大,其是否也可以诱导其增生的组织萎缩呢?目的:构建菜花耳兔模型并观察注射曲安奈德对其增生性瘢痕的修复和治疗作用.设计、时间及地点:随机对照动物实验;组织学观察,于2008-08/2009-02在广西中医学院动物实验中心进行.材料:健康新西兰兔10只,耳郭没有异常,雌雄不限;曲安奈德注射液为昆明积大制药有限公司产品(国药准字53021604).方法:10只健康、耳郭正常的新西兰兔通过反复重物撞击耳郭造模,6轮实验后成功构建菜花耳模型,随机分为对照组和实验组,每组5只兔子(10只耳郭).对照组在增厚的耳郭内注射利多卡因0.3 mL,实验组注射曲安奈德40 mg(1 mL)和利多卡因1 mL混合液0.3 mL,每3周1次,共3次,游标卡尺测量耳郭的厚度,实验结束进行组织病理检查.主要观察指标:①两组兔大体观察.②耳郭厚度.③耳郭组织病理学观察.结果:6轮实验后,全部的耳郭显著增厚变硬,造模成功,两组耳郭厚度差异无显著性意义,注射后实验组显著比对照组变薄变软.实验结束的组织病理检查,对照组的组织特点同菜花耳,皮下大量的纤维组织增生,组织致密;实验组可见药物残留,其周围的纤维组织变得疏松,有的出现变性、玻璃样变、胶原断裂和钙盐沉积;而离药物较远的位置纤维组织增生、更致密,同菜花耳治疗前.结论:通过反复重物坠落撞击兔耳可构建菜花耳模型,局部注射曲安奈德可修复模型耳郭变薄变软.
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构建survivin shRNA重组载体及靶向下调PC3细胞survivin mRNA的表达
背景:survivin 基因特异性表达于肿瘤和胚胎组织,与肿瘤细胞的分化增殖、浸润转移以及多药耐药密切相关.目的:构建靶向survivin 基因的shRNA 重组质粒表达载体,转染前列腺癌细胞PC3,验证该载体能否下调细胞survivin 基因mRNA 水平.方法:以survivin 基因为靶点设计具有短发夹结构的shRNA 序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6 建立重组表达载体pENTR/U6-SUR ;转化E.coli TOP10 菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR 和测序鉴定;将重组质粒转染前列腺癌细胞株PC3 细胞,RT-PCR 检测重组质粒对细胞survivin 基因mRNA 水平的抑制效果.结果与结论:将设计合成的shRNA 序列经退火后克隆至pENTR/U6 载体中,菌落PCR 可扩增出目的条带,测序结果证实插入片段为所需序列;pENTR/U6-SUR 重组质粒转染后PC3 细胞survivin 基因mRNA 表达水平显著下降,且24 h 比48 h 作用更明显.成功构建了靶向survivin 基因的shRNA 质粒表达载体,并证实该载体显著下调了PC3 细胞中survivin 基因mRNA 水平.
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类风湿关节炎患者骨密度与生化指标的相关性
目的:类风湿关节炎患者容易发生骨密度降低,目前缺乏类风湿关节炎患者骨密度与生化指标相关关系的研究.试验拟验证类风湿关节炎患者骨密度与生化指标的相关性.方法:①试验对象:选择2004-04/2007-10在解放军南京军区南京总医院住院的类风湿关节炎患者26例,其诊断符合1987年美国风湿病学院关于类风湿关节炎分类标准,男4例,女22例,平均年龄(57±9)岁,患者对于诊治方案均知情同意,该方案经医院医学伦理委员会批准.全部患者无严重肾功能损害、甲状腺、甲状旁腺等疾病.②试验方法:应用双能骨密度仪检查患者腰椎骨密度,抽血查碱性磷酸酶、磷酸肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、谷酰转肚酶、乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、白蛋白、胆固醇、肌酐、尿素、氯、钾、钠、钙、总二氧化碳等生化指标.③试验评估:用直线相关分析腰椎骨密度与年龄、病程、体质量指数的关系,用多元线性回归分析腰椎骨密度与生化指标的相关关系.结果:纳入类风湿关节炎患者26例,均进入结果分析.①类风湿关节炎患者腰椎骨密度与年龄呈显著负相关(r=-0.546, P=0.004).②多元线性回归显示,碱性磷酸酶、磷酸肌酸激酶、钠对腰椎骨密度影响显著(F=9.860, P=0.001),前两者与骨密度呈负相关,后者与骨密度呈正相关.结论:类风湿关节炎患者腰椎骨密度与生化指标中碱性磷酸酶、磷酸肌酸激酶、钠的关系密切,并随年龄增长呈下降趋势.
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脂联素基因多态性与肥胖、血清脂联素水平的相关性
目的:研究发现,脂肪组织分泌的脂联素在体脂变化,糖、脂代谢以及抗动脉粥样硬化中发挥有益的作用.分析脂联素基因(apM1)多态性与肥胖、血清脂联素水平的相关性.方法:⑴试验对象:选取2000-08/2003-07在上海市华阳社区肥胖流行病学调查所诊断的超重/肥胖人群以及上海市第六人民医院门诊就诊的390名患者.男171例,女219例,平均年龄(51±1)岁.纳入标准:①符合世界卫生组织(WHO)肥胖诊断标准.②所有纳入对象均为汉族人.③对试验目的知情同意.⑵试验方法及评估:根据世界卫生组织(WHO)肥胖诊断标准将受试对象分为正常体质量组(体质量指数＜ 25 kg/m2)182例和超重/肥胖组(≥25 kg/m2)208例.进一步根据腹腔内脂肪面积将超重/肥胖组分为腹内型肥胖(腹腔内脂肪面积≥100 cm2)114例和非腹内型肥胖(腹腔内脂肪面积＜100 cm2)94例.采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性方法检测apM1基因第二外显子+45(Exon2+45)和第三外显子+331(Exon3+331)2个位点的基因多态性.应用核磁共振测定局部体脂,放射免疫分析法测定空腹血清脂联素水平.试验对数据先进行正态分布检验,如果符合正态分布,两组间计量资料的比较采用t检验,多组间比较用F检验.计算基因多态性的基因型频率,确认符合Hardy-Weinberg平衡,计算等位基因频率,基因型分布作Hardy-Weinberg吻合度检验.等位基因频率和基因型频率的比较采用χ2检验.结果:正常对照组182例和超重/肥胖组208例均进入结果分析.①中国汉族人apM1基因Exon2+45位点存在基因多态性,有3种基因型,即TT,TG,GG;Exon3+331位点不存在基因多态性,均为TT基因型.②apM1基因Exon2+45位点基因型及等位基因频率在超重/肥胖者与正常体质量者之间无显著差异;在腹内型肥胖与非腹内型肥胖者间亦无显著差异.③apM1基因Exon2+45位点各基因型组间血清脂联素水平无显著差异.结论:中国汉族人脂联素基因Exon2+45位点的多态性与肥胖以及肥胖类型、血清脂联素水平无相关性;Exon3+331位点不存在基因多态性.
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应用肌膜瓣包裹、羊膜管预置聚乳酸-羟基乙酸微丝模拟周围神经再生微环境修复周围神经缺损的实验
背景:周围神经损伤部位的微环境状况足影响神经再生的重要因素之一.周围神经损伤后,良好的神经再生微环境有利于保护受损神绛元、促进轴突的有效再生.目的:应用肌膜瓣包裹、羊膜管预置聚乳酸-羟基乙酸微丝,充填大鼠自体周围神经组织浆模拟周围神经再生微环境,探讨其修复坐骨神经缺损的可行性.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-06/2007-10在广东医学院实验动物中心完成.材料:清洁级2月龄SD大鼠30只,随机分为实验组、对照组、标准组3组,每组10只,右侧为实验侧,左侧为正常对照侧.取健康、足月、顺产的新鲜胎儿羊膜(产盘知情同意)制备羊膜基质膜.用医用Vicryl缝线和羊膜基质膜制备聚乳酸-羟基乙酸微丝桥接物.方法:大鼠切除坐骨神经6.0 mm,自然同缩建立坐骨神经缺损模型.实验组采用带蒂肌膜瓣、人羊膜管预置Vicryl微丝并充填大鼠白体坐骨神经组织浆;对照组采用单纯人羊膜管允填大鼠白体坐骨神经组织浆;标准组采用自体神经移植,桥接大鼠坐骨神经缺损.主要观察指标:术后8,12周行大体观察、组织学榆查、胫前肌湿质量、有髓神经纤维通过率及神经电生理学检测.结果:术后12周,实验组、标准组肌萎缩有所恢复,对照组则恢复不明显.实验、标准组中侧胫前肌色泽红润,饱满富有弹性;对照组色泽相对较暗,弹性度较差.术后8,12周3组胫前肌恢复率组间比较,术后12周3组有髓神经纤维总数、截面积,神经移植体血管数利血管截面积组间比较,以及小腿三头肌复合肌动作电位幅值组间比较,差片均有显著性意义(P<0.05),其中标准组神经纤维再生质量佳,实验组优于对照组.结论:肌膜转位、羊膜管预置聚乳酸-黔基乙酸微丝,并填允大鼠自体周围神经组织浆导管能较好的模拟周围神经再生之微环境,促进神经纤维再生,但与自体神经移植尚有差距.
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转化生长因子β1对肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质成分的调节与阿魏酸钠的干预效果
背景:细胞外基质在肾间质的积聚是肾小管间质纤维化的主要特征.肾小管上皮细胞一肌成纤维细胞转分化在肾间质纤维化发病机制中起了重要作用.目的:从细胞水平观察阿魏酸钠对转化生长因子β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化及细胞外基质主要成分Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和纤维粘连蛋白的影响.设计:以细胞为观察对象,随机对照实验.单位:四川大学华西医院肾脏科.材料:大鼠肾小管上皮细胞株NRK52E来源于American Type Culture Collection(ATCC),由澳大利亚Monash医学中心肾内科实验室提供,本实验所用细胞株为第36代.阿魏酸钠为白色晶体,可溶于水,纯度>98.0%,由成都亨达药业有限公司提供.实验时终浓度分别125,250,500μmol/L.兔抗大鼠α平滑肌肌动蛋白多克隆抗体为武汉博士德产品;EUSA试剂盒为上海森雄公司产品;人重组转化生长因子β1为R&D公司产品:DNA Engine OpticonTM实时荧光定量聚合酶链反应仪为MJResearch产品.方法:将体外培养的细胞株NRK52E分为5组;空白对照组:仅加入含血清的DMEM培养基;转化生长因子β1刺激组:培养液中加入终质量浓度为5ng/L的转化生长因子β1;阿魏酸钠低、中、高浓度组:培养液中加入终质量浓度为5 ng/L转化生长因子β1和125,250,500μmol/L的阿魏酸钠.主要观察指标:应用相差显微镜、实时荧光定量聚合酶链反应、酶联免疫吸附法观察阿魏酸钠对转化生长因子β1诱导的NRK52E细胞转分化的作用及对细胞外基质主要成分胶原Ⅰ胶原Ⅲ和纤维粘连蛋白的影响.结果:①NRK52E细胞形态:与空白对照组相比,转化生长因子β1刺激组细胞在培养3 d后,细胞株NRK52E从原有典型的铺路石样上皮细胞形态转变为长梭形类似成纤维细胞的形态.阿魏酸钠3个浓度组细胞受转化生长因子β1的刺激而出现的形态学改变得到不同程度的改善,并呈剂量依赖性.②α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达:转化生长因子β15 ng/L诱导6 h后α-平滑肌肌动蛋白mRNA较空白对照组上升,在72 h达高峰;经过不同剂量阿魏酸钠干预72 h后α-平滑肌肌动蛋白mRNA显著下调并呈剂量依赖性(P<0.05).③细胞外基质变化:经转化生长因子β15 ng/L诱导72h后,细胞培养上清中Ⅰ型胶原,Ⅲ型胶原和纤维粘连蛋白含量明显增加(P<0.05).经过不同剂量的阿魏酸钠干预后,不同程度地抑制了转化生长因子β1促Ⅰ型胶原、Ⅲ犁胶原和纤维粘连蛋白增多的作用,并呈剂量依赖性(P<0.05).结论:转化生长因子β1可以诱导大鼠肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化,刺激细胞外基质成分Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和纤维粘连蛋白的升高.阿魏酸钠可剂量依赖性地抑制转化生长因子β1所导致的肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化作用.
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生肌液复合封闭负压引流技术对创面Ⅰ型和Ⅲ型胶原代谢的影响
背景:在创面愈合过程中起主要作用的是Ⅰ、Ⅲ型胶原,Ⅰ型胶原起支架作用,Ⅲ型胶原决定胶原纤维的弹性好坏.目的:拟验证生肌液和封闭负压引流技术相结合对实验动物创面Ⅰ、Ⅲ型胶原的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-05/10在河南省正骨研究院生物医学工程研究室完成.材料:清洁级SD大鼠100只,体质量(220±20)g,制备大鼠皮肤切除伤模型.生肌液和麻油煎剂均由本院制剂室规范制各.方法:100只大鼠随机区组法分为5组,每组20只.模型组:等待创面自然愈合;麻油组:将麻油纱布敷于创面上.生肌液组:将生肌液纱布敷于创面上:封闭负压引流组:给予创面封闭负压引流治疗;生肌液复合封闭负压引流组:给予创面封闭负压引流治疗,停止负压吸引后,立即从注药管注入生肌液.各组大鼠随机分4批麻醉后处死(每次5只,10个创面)用于取材.主要观察指标:创面愈合时间:免疫组织化学法观察愈合组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量及比例.结果:纳入SD大鼠100只,除模型组及生肌液组各有1只动物死亡外,其余动物均进入结果分析.①生肌液复合封闭负压引流组及封闭负压引流组较其他各组愈合时间明显缩短(P<0.05).②创面形成后第3天生肌液组Ⅰ型胶原含量低(P<0.05);生肌液复合封闭负压引流组Ⅲ型胶原含量高.第6天,生肌液复合封闭负压引流组Ⅲ型胶原的含量仍高于生肌液组(P<0.05).创面完全愈合后,生肌液复合封闭负压引流组Ⅲ型胶原的含量明显高于封闭负压引流组(P<0.05).③造模后第3天Ⅲ/Ⅰ比值以生肌液组为高(P<0.05);造模后第6天,封闭负压引流组Ⅲ/Ⅰ比值低(P<0.05).创面愈合后,生肌液复合封闭负压引流组和生肌液组Ⅲ/Ⅰ比值无明显差别,均呈比较理想的状态.结论:生肌液复合封闭负压引流可以优化创面胶原构成并提高创面的愈合质量;对创面Ⅰ、Ⅲ型胶原代谢的影响可能是其重要干预途径.
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大鼠agrin基因实时定量聚合酶链反应的检测方法
目的:agrin基因对神经肌肉接头的形成、维持起着决定作用,也对神经元轴突的形成、延长、维持有重要作用,其表达产物在机体内分布广泛.设计绝对定量嵌合荧光法检测大鼠agrin基因mRNA的实时定量聚合酶链反应方法,并检测其特异性、敏感性和可重复性.方法:实验于2007-04/11在吉林大学基础医学院三综合实验室和吉林大学第一医院传染科实验室完成.以Primer 3软件设计大鼠agrin基因、ACTB基因mRNA嵌合荧光实时定量聚合酶链反应检测引物,经检索Blast验证特异性,并以Primer 5设计构建agrin基因标准品引物.选择清洁级Wistar大鼠交配,获取3日龄乳鼠,取脑,获取mRNA、cDNA,常规反转录-聚合酶链反应获取agrin 554个碱基DNA片断.PCR填加T7启动子后,T7 RNA Polymerase合成agrin基因标准品,消化模板.分光光度计测定其浓度,1∶5倍比稀释3次;经反转录反应合成agrin基因cDNA标准品,测序验证特异性.以ACTB引物反转录cDNA,1∶5倍稀释3次,构建ACTB基因标准品.常规聚合酶链反应确定、优化反应条件.标准曲线确定实时定量聚合酶链反应标准曲线的相关性,融解曲线验证检测方法的特异性,作重复性检测.结果:①agrin基因有意义链引物序列:GAA GGC CAG GTG CGA ATC A,反义链引物序列:CAC AGG TAG CAG TGG AGC CAA G,内标:ACTB基因有意义链引物序列:GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA,反义链引物序列:GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG,优化反应条件:95 ℃变性5 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s.②agrin基因、ACTB基因标准品所获得的标准曲线确定实时定量聚合酶链反应标准曲线的相关性均＞ 0.95.③聚合酶链反应产物电泳、测序、实时定量聚合酶链反应融解曲线证明特异性高、重复性好、灵敏度达到精确定量要求.结论:绝对定量嵌合荧光法检测大鼠agrin基因mRNA的实时定量聚合酶链反应方法可以作为大鼠agrin基因mRNA检测的标准方法.
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人外周单个核细胞来源树突细胞成熟与肺炎支原体膜脂蛋白的影响
目的:实验着眼于肺炎支原体膜脂蛋白对人外周血单个核细胞来源的树突细胞的表型(CD83,CD86)及分泌细胞因子的作用,探讨肺炎支原体加重哮喘的机制是否是改变了树突细胞的性状.方法:①对象:所有外周血采自正常人,志愿献血者为武汉大学医学院2005级硕士博士研究生6人;实验用肺炎支原体膜脂蛋白购自广州华银医药科技有限公司.②实验过程及分组:从肘静脉采集志愿者20 mL新鲜全血,以不连续密度梯度离心法及贴壁法获取单核细胞,加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,重组人白细胞介素4培养5 d得到不成熟树突细胞后,分别予肺炎支原体膜脂蛋白,脂多糖和空白刺激再培养2 d.③评估:用流式细胞仪检测各组树突细胞表面表达CD83,CD86的情况,用酶联免疫吸附法检测各组树突细胞分泌白细胞介素12的水平.结果:①肺炎支原体膜脂蛋白组树突细胞表达CD83,CD86高于未刺激组(P < 0.01,P < 0.01);脂多糖组树突细胞表达CD83,CD86高于未刺激组(P < 0.01,P < 0.01);肺炎支原体膜脂蛋白组树突细胞表达CD83较脂多糖组无差异,表达CD86高于脂多糖组(P < 0.05).②肺炎支原体膜脂蛋白组树突细胞分泌白细胞介素12高于未刺激组(P < 0.01);脂多糖组树突细胞分泌白细胞介素12高于未刺激组(P < 0.01);肺炎支原体膜脂蛋白组树突细胞分泌白细胞介素12低于脂多糖组(P < 0.05).结论:肺炎支原体膜脂蛋白可刺激未成熟树突细胞分化成熟,但较脂多糖刺激的不同,前者刺激成熟的树突细胞在呈递抗原给T细胞时,可进一步使T细胞向Th2极化,导致Th1/Th2平衡失调,从而加重哮喘.
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氟喹诺酮类及糖皮质激素类药物对跟腱影响的细胞学观察
目的:通过观察氟喹诺酮类药物和糖皮质激素类药物作用于大鼠跟腱后的细胞学表现,验证两药是否对跟腱有损伤作用,以及两者是否具有协同效应.方法:实验于2007-08109在甘肃中医学院实验动物中心完成.①实验材料:SPF级健康成年Wistar大鼠40只,雌雄各半,体质量200～250 g.实验用药盐酸环丙沙星片(国药准字H23022275)为哈药集团生产:醋睃泼尼松龙注射液(浙卫药准字(1996)第185301号)为浙江仙琚制药股份有限公司生产;盐酸利多卡因注射液(国药准字H37023473)为山东华鲁制药有限公司生产.②实验分组及给药:采用随机数字法将动物分为4组:生理盐水组8只,给予生理盐水2 mL灌胃和局部注射生理盐水1 mL/kg.环丙沙星组10只,给予盐酸环丙抄星800 mg/kg;强的松龙组10只,给予1:2醋酸强的松龙注射液和盐酸利多卡因注射液.1 mL/kg:联合作用组12只,给予盐酸环丙沙星800 mg/kg和强的松龙1 mL/kg.各组给药1次/d.③实验评估:分别于给药后2周、4周对实验动物进行体位、步态的行为学观察,局部组织病理学检查及流式细胞仪检测.实验过程对动物的处理符合动物伦理学标准.结果:40只大鼠全部进入结果分析.①行为学观察:用药后联合作用组大鼠跛行出现早,环丙沙星组、强的松龙组次之,生理盐水组末出现.②大体标本观察:环丙沙星组、强的松龙组、联合作用组大鼠跟腱不同程度变为灰褐色,无定形外观肌组织.③光镜和电镜榆测:与生理盐水组比较,其他3组大鼠跟腱损伤表现加重.④流式细胞仪检测:与生理盐水组比较,其他3组大鼠跟腱组织细胞凋亡率高(P<0.01),并且联合组高于其他两组(P<0.05),3组4周凋亡率高于2周(P<0.01).结论:氟喹诺酮类及糖皮质激素类药物应用后均对跟腱细胞有损伤作用,两者联合应用对跟腱的损伤作用更强:不论喹诺酮类还是糖皮质激素,其损伤作用均随时间延长而增强.
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激素性股骨头坏死模型兔血管内皮细胞生长因子表达与普伐他汀的干预
背景:有研究表明他汀类药物可使体外培养的人脐静脉内皮细胞的血管内皮细胞生长因子呈高表达,血管内皮细胞生长因子可促进内皮细胞增殖,明显提高成骨细胞活性并加速骨形成.目的:观察普伐他汀对激素性股骨头坏死兔模型血管内皮生长因子的蛋白表达的影响.方法:将新西兰白兔随机分为对照组,模型组和普伐他汀组.模型组和普伐他汀组制备兔激素性股骨头缺血坏死模型.普伐他汀组建模成功后以普伐他汀(1.2 mg/kg)灌胃,1次/d,模型组和对照组以等体积的蒸馏水灌胃.于造模后8,12,16周截取各组股骨头行免疫组织化学检测血管内皮生长因子蛋白的表达情况.结果与结论:对照组不同时间点股骨头血管内皮生长因子蛋白表达均为阳性.造模后8周,模型组血管内皮生长因子蛋白表达呈阴性表达,普伐他汀组呈弱阳性表达.造模后12周,模型组和普伐他汀组血管内皮生长因子蛋白表达呈阳性表达,16周呈弱阳性表达.结果证实,普伐他汀可有效促进早期激素性股骨头坏死兔模型坏死股骨头内源性血管内皮生长因子的蛋白表达.
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低功率激光照射对急性骨骼肌钝挫伤大鼠肌组织Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达的作用
背景:低功率激光照射能促进骨骼肌损伤愈合的结局早已公认,但其确切作用机制仍不十分明确.目的:通过635 amGaAIAs激光照射急件骨骼肌钝挫伤大鼠.观察腓肠肌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA的表达.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-07/2007-05在苏州大学体育学院中心实验室和苏州大学附属第一医院完成.材料:健康雄性sD大鼠96只,体质量180-220 g,随机分为自然愈合组54只和激光治疗组42只.根据取材时间进一步分为:正常对照组、损伤后即刻组及损伤后7个时间点,每组及每个时间点6只.方法:建立大鼠急性骨骼肌钝挫伤模型,激光治疗组采用美国Erchonia EML(ML2)型低功率GaALAs激光器在钝挫伤局部进行照射,自然愈合组不进行照射.主要观察指标:于损伤后即刻、伤后第1,2,3,7,14,21.28天以实时荧光定量聚合酶链反应法观察Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达,以光镜观察组织学改变.以黄嘌呤氧化酶法测定腓肠肌超氧化歧化酶活力、硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量.结果:96只人鼠全部进入结果分析.①苏木精-伊红染色显示,激光照射组肌肉再生速度、愈合质量显著优于自然愈合组.②急性钝挫伤后,肌组织中超氧化物歧化酶活性降低,丙二醛含量增加,在损伤后第7天仍未恢复至正常水平:激光照射组上述指标变化幅度小于自然愈合组,在损伤后第7天已恢复至正常水平.③急性钝挫伤后,肌组织中Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达增加,激光照射组升幅显著小于自然愈合组.结论:结局证明,635nm GaAlAs低功率激光能阻止胶原纤维的过度生成,抑制活性氧生成,减轻脂质过氧化损伤,促进肌肉再生.
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神经生长因子对大鼠胫骨骨折愈合的影响
背景:临床中发现失神经可导致骨折断端骨痂过度生长甚至在肌肉中出现异位骨化,这一现象提示神经因素对骨折愈合有影响.目的:探讨神经生长因子对大鼠胫骨骨折愈合的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-06/2006-03在解放军第二军大学动物实验中心完成.材料:健康雄性3个月龄SD大鼠120只,体质量250-300 g,随机分为单纯左胫骨骨折组和神经生长因子治疗组,每组60只.注射用神经生长因子由厦门北大之路生物工程有限公司提供.方法:两组大鼠制备单纯胫骨骨折,神经生长因子治疗组肌注2000AU(1.4g),1次/d,分别注射两侧腓肠肌,连续肌注2周.伤后第4周对2组大鼠骨折断端行断层CT,测量骨折断端大横截面及计算骨痂灰度值,行生物力学3点折弯试验.主要观察指标:①骨组织形态计量学、骨密度测定.②骨痂组织形态学的观察.③免疫组化法测定骨痂组织骨钙素的表达.④观察2组大鼠骨痂中成骨细胞的超微结构变化.⑤Western印迹检测Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达.结果:神经生长因子治疗组3点折弯试验各项生物力学参数均优于单纯左胫骨骨折组(P＜0.05).形态学及超微结构观察见神经生长因子治疗组骨折愈合优于单纯左胫骨骨折组.神经生长因子治疗组Ⅰ型胶原蛋白表达明显高于单纯左胫骨骨折组(P＜0.05):而单纯左胫骨骨折组骨痂Ⅱ型胶原蛋白的表达明显高于神经生长因子治疗组(P＜0.05).结论:生物力学测试及Ⅰ型胶原蛋白表达和成骨细胞微观结构均说明神经生长因子对骨折断端的骨化有促进作用,其途径有町能在骨痂生长的不同时期通过调节Ⅰ、Ⅱ型胶原的量来调控骨折的愈合.
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构建大鼠肝纤维化模型并观察大豆磷脂的保护作用
目的:目前认为肝纤维化尚存在可逆性.实验以光镜和细胞图像胶原半定量手段进一步验证大豆磷脂干预复合病因诱导肝纤维化大鼠模型肝细胞的组织学变化特点.方法:实验于2004-10/2007-05在辽宁医学院科学实验中心完成.①实验材料及分组:健康雄性SD大鼠24只,体质量180～220g.随机分为3组,即对照组、模型组、大豆磷脂组,每组8只.②实验过程:模型组采用复合病因诱导大鼠肝纤维化(给预高脂低蛋白食物和饮乙醇,皮下注射四氯化碳),大豆磷脂组给予造模饮食水,同时给予大豆磷脂300mg/(kg·d)灌胃,正常对照组给予大鼠正常饮食水.42d后麻醉下断颈处死大鼠.③实验评估:验证模型是否成功;采用光镜观察肝组织病理学改变;并用细胞图像分析仪对肝纤维化进行半定量分析;检测各组血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、单胺氧化酶活性.实验过程对动物的处置符合动物伦理学标准.结果:①造模结果:6周末验证大鼠肝纤维化模型造模成功.②光镜观察组织学变化:苏木精-伊红染色可见模型组正常肝小叶已经被破坏,坏死区中央或周围有炎性细胞浸润.肝窦多受压变窄或闭塞.门脉区有大量成纤维细胞、纤维细胞和增生的胶原纤维,纤维组织相互环绕形成大量假小叶.MASSON染色可见模型组肝组织形成了较宽的以胶原纤维为主要成分的纤维间隔(绿色),胶原纤维分隔、包绕肝小叶,多数形成假小叶.大豆磷脂组上述变化较轻.③细胞图像胶原半定量测定结果:模型组、大豆磷脂组肝组织胶原纤维面积密度显著高于正常对照组(P＜0.01),而大豆磷脂组的指标显著低于模型组(P＜0.01).④血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶及单胺氧化酶活性:模型组和大豆磷脂组高于正常对照组(P＜0.01),但大豆磷脂组的指标低于模型组(P＜0.01).结论:大豆磷脂干预肝纤维化大鼠后肝模型血清酶活性比模型组明显下降,胶原积累程度半定量分析也验证了干预后胶原纤维密度低于模型组,说明干预修复了受损的肝细胞.
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2型糖尿病中国地鼠模型构建与小檗碱对肝脏过氧化物酶体增殖体激活受体及其靶基因表达的影响
背景:研究表明小檗碱可用于治疗2型糖尿病,但小檗碱治疗糖尿病胰岛素抵抗尤其是肝脏脂诱性胰岛素抵抗的分子机制仍不明确.目的:观察小檗碱对2型糖尿病中国地鼠模型肝脏过氧化物酶体增殖体激活受体及其靶基因表达的影响.方法:以高脂饮食及结合小剂量链脲菌素的方法建立胰岛素抵抗和2型糖尿病中国地鼠模型.建模后随机分成4组:对照组给予普通饮食,胰岛素抵抗组给予高脂饮食,2型糖尿病组给予高脂饮食+小剂量链脲菌素,2型糖尿病小檗碱治疗组给予高脂饮食+小剂量链脲菌素+小檗碱,治疗9周.结果与结论:实时定量PCR结果显示与对照组相比,胰岛素抵抗及2型糖尿病组地鼠肝脏过氧化物酶体增殖体激活受体α,β/d,酰基辅酶A氧化酶,肉碱棕榈酰转移酶1和中链酰基辅酶A脱氢酶的表达降低(P < 0.05),而固醇调节元件结合蛋白1c,2,过氧化物酶体增殖体激活受体γ,脂蛋白脂酶,脂肪酸转运者(FAT/CD36)和脂肪酸结合蛋白(ap2)的表达增加(P < 0.05).结果证实,小檗碱可改善胰岛素抵抗,并逆转了氧化物酶体增殖体激活的受体及其靶基因表达的改变,小檗碱治疗2型糖尿病地鼠脂诱性胰岛素抵抗的分子机制与氧化物酶体增殖体激活的受体及其靶基因表达的改变相关.
关键词： 小檗碱 2型糖尿病 氧化物酶体增殖体激活受体 肝脏脂诱性胰岛素抵抗 中国地鼠 组织构建
