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含氯消毒剂灭活噬菌体效果的影响因素研究
目的 观察不同因素对消毒剂灭活噬菌体效果的影响.方法 采用正交设计试验和悬液定量病毒灭活试验方法,对含氯消毒剂灭活T7噬菌体效果的影响因素进行了观察.结果 消毒剂浓度、灭活时间、小牛血清含量、消毒剂浓度与小牛血清含量的交互作用以及灭活时间与小牛血清含量的交互作用对T7噬菌体的灭活效果的影响均有显著性意义,其对结果的影响程度由大到小的顺序为:小牛血清含量＞消毒剂浓度＞灭活时间＞灭活时间×小牛血清含量＞消毒剂浓度×小牛血清含量.在清洁条件下用有效氯150 mg/L对悬液内大肠杆菌T7噬菌体作用1 min可达到完全灭活,在加入有机物条件下用有效氯250 mg/L对悬液内该噬菌体作用5 min灭活率仅为99.97%.结论 在设计的4个因素对T7噬菌体灭活效果影响的试验中,有机物含量、消毒剂浓度、作用时间等3个单因子影响显著,有机物与消毒剂浓度之间和作用时间与有机物之间存在交互作用.
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A型禽流感病毒M2e重组T7噬菌体疫苗构建及免疫原性研究
构建展示A型禽流感病毒M2e多肽的重组T7噬菌体,检测其对SPF鸡的免疫保护效果.比对GenBank近期发表的A型禽流感病毒M2e基因序列进行人工合成并重复至两拷贝,将其克隆到T7 Select 415-1b噬菌体多克隆位点,构建重组噬菌体T7-M2e.经PCR鉴定并序列测定筛选阳性重组噬菌体,SDS-PAGE和Westernblot检测重组噬菌体表面M2e多肽.重组噬菌体以1×1010pfu/只剂量免疫SPF鸡,免疫后不同时间段采血通过ELSIA检测血清中抗M2e抗体,免疫荧光检测血清抗体与H9亚型禽流感病毒的结合能力,并以200个EID50/只剂量进行攻毒保护效率检测.成功构建重组噬菌体T7-M2e,插入两拷贝M2e基因获得表面展示,并与M2e抗体有免疫反应活性.噬菌体疫苗免疫后均产生抗M2e抗体,其抗血清能跟病毒粒子特异性结合,攻毒保护率达4/5(80％).获得了展示禽流感病毒M2e多肽的重组噬菌体,噬菌体疫苗免疫鸡产生较高血清抗体并提供攻毒保护,为新型通用禽流感疫苗研制提供新思路.
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白纹伊蚊T7噬菌体展示cDNA文库的构建
为筛选白纹伊蚊与相关蚊媒病毒相互作用的基因,本文构建了白纹伊蚊Aedes albopictus T7噬菌体展示cDNA文库,分离与纯化白纹伊蚊mRNA,所得 mRNA经反转录合成双链cDNA后,在双链cDNA 末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头使其两端分别带EcoRⅠ和Hind Ⅲ黏性末端;接着用Mini Column 纯化收集300 bp 以上的双链cDNA 片段连接于T7 Select 10-3b 载体;经体外包装后,以BLT 5403 为受体菌构建T7 噬菌体展示cDNA 文库.所建文库的库容量经测定为1.7×107 pfu/mL,扩增后文库滴度为2.5×1013 pfu/mL.对从原始文库中随机挑取的50个噬菌斑进行PCR 鉴定,重组率为95% 以上;阳性克隆片段长度分布在200～2 000 bp,其中有90%的插入片段大于300 bp.本文所构建的白纹伊蚊T7噬菌体展示cDNA文库,满足cDNA文库的基本要求,可以用于筛选白纹伊蚊与相关蚊病毒相互作用的基因.
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应用T7噬菌体展示技术筛选与sLRIG1亲和结合蛋白
目的 用T7噬菌体展示技术(phage-displayed technique,PDT)筛选与可溶性多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1(soluble leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1,sLRIG1)相互作用的蛋白,为进一步研究sLRIG1作用于人脑胶质瘤的机制找到突破点.方法 利用BacPAK6杆状病毒蛋白表达系统(baculovirus expression system,BEVS)获得人sLRIG1重组蛋白,以该蛋白为靶标,采用亲和淘洗方法经6轮筛选人肝细胞cDNA T7噬菌体展示文库;随机挑选96个筛选到的噬菌体行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段并送测序.结果 经过6轮筛选,噬菌体投入和产出量比达1.85×106 PFU,趋于稳定.回收的DNA片段多在250～750bp,纯化回收后得到35个克隆样本,送测序后得到35条有效表达序列标签,对其行同源性搜索及功能预测等生物信息学分析,终获得12个可能与sLRIG1蛋白有相互作用的蛋白或多肽,这些蛋白大多与肿瘤相关.结论 通过PDT可获得与sLRIG1蛋白相互结合的蛋白,这些结果为下一步研究sLRIG1的生物功能及其对人脑胶质瘤的作用及机制奠定了基础.
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T7噬菌体衣壳蛋白10A的表达、纯化及多克隆抗体的制备
目的 表达纯化T7噬菌体衣壳蛋白10A,并免疫家兔得到抗10A多克隆抗体,为研究噬菌体展示抗体技术,进而筛选致病微生物蛋白抗体奠定基础.方法 37℃培养含有T7噬菌体10A蛋白质粒的大肠杆菌BLT5615,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷直接诱导表达该蛋白;SDS-PAGE鉴定表达状态,盐酸胍变性-尿素复性纯化以包涵体形式存在的蛋白并免疫家兔;辛酸-硫酸铵沉淀法纯化多克隆抗体,间接ELISA测定效价,Western Blot鉴定特异性生.结果 成功表达了T7噬菌体衣壳蛋白10A.SDS-PAGE显示所表达的蛋白相对分子质量约为37 kDa,主要以包涵体形式存在;复性后SDS-PAGE分析获得单一条带蛋白.利用该蛋白免疫家兔,6次免疫后抗血清的效价均达到1∶160000.纯化后的多克隆抗体可以和T7噬菌体衣壳蛋白10A特异结合.结论 成功表达、纯化了T7噬菌体衣壳蛋白10A,并制备了其多克隆抗体.
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从T7噬菌体展示cDNA文库筛选生殖支原体黏附蛋白的互作蛋白
目的:从人尿道上皮细胞(SV-HUC-1)T7噬菌体展示cDNA文库筛选生殖支原体黏附蛋白(MgPa)的互作蛋白.方法:以原核表达、纯化的重组生殖支原体黏附蛋白(rMgPa)为靶分子,对人尿道上皮细胞T7噬菌体展示cDNA文库进行4轮生物淘选,采用T7特异性引物扩增阳性克隆的插入片段,PCR产物测序后进行BLAST分析,间接ELISA、斑点免疫印迹和Far-western blot检测阳性噬菌体与rMgPa的特异结合.结果:经过4轮生物淘选,噬菌体克隆富集明显;DNA测序后经BLAST比对分析,结果表明随机挑取的32个阳性克隆包括7种不同序列,其中以RPL35重复次数多;间接ELISA、斑点免疫印迹和Far-western blot结果表明7个代表性噬菌体均能与rMgPa特异结合.结论:60S核糖体蛋白L35(RPL35)可能是MgPa的互作蛋白,为深入了解MgPa的生物学功能以及生殖支原体的致病机制奠定了实验基础.
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T7噬菌体尾蛋白 P11的表达、纯化及鉴定
目的：表达、纯化T7噬菌体尾蛋白P11并进行鉴定。方法：PCR扩增T7噬菌体尾蛋白P11基因片段， EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后连接表达载体pTIG-TRX，重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达，纯化目的蛋白，SDS-PAGE分析P11蛋白的相对分子质量大小，并多次免疫新西兰大白兔制备其多克隆抗体，Western blot鉴定蛋白活性。结果：PCR扩增P11基因后，成功诱导表达了含6×His标签的P11蛋白，SDS-PAGE显示所表达蛋白的相对分子质量约为25000，通过多次免疫获得了抗P11的多克隆抗体并对其纯化；制备的多克隆抗体能够识别T7噬菌体和P11蛋白，具有较高特异性。结论：成功表达了P11蛋白并制备了其多克隆抗体，为T7噬菌体展示系统的应用奠定了基础。
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用T7噬菌体展示筛选系统筛选与p38相结合的蛋白
目的用T7噬菌体筛选系统筛选与重要信号分子p38 MAPK结合的蛋白.方法以p38 MAPK为靶蛋白,分别用不同的介质(ELISA平板和Ni-NTA亲和树脂)筛选T7人肝和人肺cDNA文库.结果选择86个第4轮筛选后的洗脱噬菌体单个噬斑克隆,经EDTA处理后利用特异性PCR引物扩增插入片断,回收PCR产物并进行测序,将所得到的序列用BLAST软件搜索GenBank中的同源序列,得到了46个编码蛋白的序列.结论T7噬菌体展示筛选系统筛选新的结合蛋白简单、快速、有效.
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T7噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白3的相互作用蛋白
目的 用T7噬菌体筛选系统筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白(NS)3的相互作用蛋白.方法 应用T7噬菌体展示技术,以通过原核表达的方式得到的丙型肝炎病毒NS3为靶分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行筛选,对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性研究.结果 经鉴定得到2个阳性克隆,并确定能与丙型肝炎病毒NS3相互作用的蛋白质为serine peptidase inhibitor,clade A,member 1(SERPINA1)和cyclophilin-LC.结论 T7噬菌体筛选系统是筛选相互作用蛋白的一种简单、快速和有效的手段,筛选到的相互作用蛋白为进一步探讨NS3的致病、致癌机制提供了重要依据.
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噬菌体展示技术筛选与白介素-32相互作用的蛋白
目的 利用T7噬菌体展示技术筛选与白介素-32(interleukin-32,IL-32)相互作用的蛋白.方法 构建IL-32α的原核表达重组质粒,表达并纯化重组IL-32α蛋白(recombinant IL-32α,rIL-32α);以纯化后的rIL-32α作为靶蛋白,应用T7噬菌体展示技术对人肝细胞cDNA文库进行筛选;对筛选到的阳性克隆进行DNA测序及计算机辅助分析;利用哺乳动物双杂交实验和免疫共沉淀实验对筛选到的阳性克隆进行验证.结果 成功表达并亲和纯化了rIL-32α蛋白;经过5轮筛选,投入和产出的噬菌体滴度比值达到稳定;同源性分析初步确定9个与IL-32α蛋白相互作用的蛋白;进一步实验证实IL-32α与这9个蛋白片段能发生相互作用.结论 利用T7噬菌体展示技术成功筛选到9个与IL-32α相互作用的蛋白,我们的发现为深入揭示IL-32的生物学功能奠定了研究基础.
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T7噬菌体衣壳蛋白P11的原核表达、纯化及其单克隆抗体的制备
目的:表达、纯化T7噬菌体衣壳蛋白P11,并制备其单克隆抗体(mAb).方法:克隆并表达T7噬菌体P11蛋白,其氨基端带有6-His标签.纯化后的蛋白免疫BALB/e小鼠,经融合、筛选制备特异性mAb.结果:成功表达了P11蛋白. SDS-PAGE显示所表达蛋白的相对分子质量(Mr)约为27 000.获得了1株稳定分泌抗P11抗体的杂交瘤细胞株(2G11),其分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG2b.ELISA检测,对应腹水mAb的效价为1∶8.1×105.Western blot结果显示抗P11mAb具有良好的特异性.结论:成功地制备了P11蛋白及其mAb.
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鸡B淋巴细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建与鉴定
目的:构建鸡B淋巴细胞cDNA T7噬菌体表达文库并对文库质量进行鉴定.方法:利用oligo(dT)-纤维素亲和层析从SPF雏鸡法氏囊细胞制备mRNA,合成的双链cDNA定向克隆到T7 EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ载体臂,包装并构建cDNA表达文库.对文库进行滴度测定和重组子测定.扩增文库并进行PCR鉴定插入序列的长度及分布.结果:文库初始滴度为5×107pfu/mL,扩增后滴度达到1.88×10 10 pfu/mL.插入片段平均长度1 440 bp,主要分布在750～2000 bp之间.结论:构建的鸡B淋巴细胞cDNA T7噬菌体表达文库具有很高的质量,为进一步研究鸡B细胞发育以及传染性法氏囊病毒(IBDV)的分子致病机制奠定了实验基础.
