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柯萨奇病毒A组16型病毒株VP1基因序列测定及进化分析研究
目的 通过检测分析2015年杭州市柯萨奇病毒A组16型(CA16)病毒株VP1区核苷酸序列,掌握杭州市CA16的流行情况及种系进化关系,为手足口病的预防和治疗提供支持,同时为CA16疫苗株的选择提供依据.方法 收集2015年杭州市儿童医院256例临床资料齐全且临床诊断为手足口病患儿的粪便或咽拭子,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增CA16病毒株VP1区核苷酸序列(约1020 bp),测序后利用DNASTAR和Primer Premier 5.0进行序列比对分析,并用Mega 3.1软件建立检测样本VP1区序列与GenBank上CA16参考毒株VP1核苷酸序列的系统发育树.结果 共分离到80株CA16阳性病毒.序列比对分析结果显示,CA16分离株的核苷酸同源性为90.8%~100.0%,氨基酸同源性为99.5%~100.0%.系统发育树分析结果显示,17株CA16全部属于B1基因亚型,并且同时存在B1a和B1b两个进化分支,其中4株属于B1a亚型,13株属于B1b亚型.结论 2015年杭州市CA16病毒株属于B1基因亚型,与国内外某些地区手足口病病原学及分子进化研究结果一致,有望成为疫苗候选株作进一步研究.
关键词： 手足口病 柯萨奇病毒感染 柯萨奇病毒A组16型 VP1 系统进化分析 -
2013年辽阳市手足口病实验室检测结果解析
目的 了解2013年辽阳市全市手足口病实验室检测结果,并对结果进行分析,从而得出2013年辽阳市手足口病发病情况及病原学特征,为实验室诊断手足口病提供依据.方法 采集2013年4-10月辽阳市五区两县送检的304例手足口病患者的粪便、咽拭子标本,应用Real time-PCR技术检测标本中肠道病毒、肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CoxA16).结果 304份标本中,检测到肠道病毒阳性95份,EV71病毒阳性4份,Cox-A16病毒阳性187份,检出率分别为31.25％、1.32％、61.51％,其中CoxA16病毒较EV71病毒检出率高很多.结论 EV71病毒是引起手足口病死亡和重症病例的主要毒株类型,而通过辽阳市实验室检测结果可得出2013年辽阳市手足口病感染者多为临床症状较轻微的CoxA16病毒感染,且感染者多集中于3、4、9月份,粪便标本检出率较咽拭标本略高.
关键词： 手足口病 实时荧光定量PCR 肠道病毒 肠道病毒71型 柯萨奇病毒A组16型 -
2012年上半年惠州地区手足口病的实验室检测结果分析
目的 对惠州市2012年1-6月手足口病实验室检测结果进行分析了解手足口病病例肠道病毒的感染情况,为制定预防和控制肠道病毒感染策略提供依据.方法 采集2012年1--6月我院送检的疑似手足口病患者的粪便、肛拭子、咽拭子和脑脊液等标本3480份,应用荧光RT-PCR技术检测样本中的肠道病毒(EV)、肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CA16).结果 共检出758份EV阳性标本,478份EV71阳性标本,138份CA16阳性标本,阳性率分别为65.69%,39.02%和12.53%,差异有统计学意义(P<0.05);男女患者的感染率分别为63.25%和36.75%,差异有统计学意义(P<0.05);0-4岁的儿童是手足口病的高发人群;4-6月份是2012年上半年手足口病发病高峰期,感染肠道病毒,EV71型和CA16型人数占所有肠道病毒,EV71型和CA16型感染者的84.43%(20.71%+36.15%+36.15%),91.42%(22.59%+40.17%+28.66%),76.53%(28.98%+27.54%+19.57%%);手足口病城区和乡镇的分布比例分别为41.70%和58.30%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 惠州地区2012上半年手足口病的病原以肠道病毒71型为主;0-4岁儿童是感染肠道病毒的高危人群;4-6月份是手足口病发病高峰期;手足口病的感染率乡镇高于城镇.
关键词： 手足口病 荧光RT-PCR 肠道病毒 肠道病毒71型 柯萨奇病毒A组16型 -
2010-2011年蚌埠市手足口病的病原学检测分析
目的 对2010-2011年蚌埠市哨点医院手足口病病原进行检测分析,以调查本地区手足口病流行情况.为手足口病的综合防治提供参考资料.方法 收集哨点医院2010-2011年送检的手足口病病例咽拭子标本,应用实时荧光定量PCR技术检测手足口病病原(肠道病毒71型、柯萨奇病毒A组16型).结果 2010年共检测332份咽拭子标本,阳性101份,阳性率30.42％,分别是肠道病毒71型55份,柯萨奇A组16型46份;2011年检测447份咽拭子标本,阳性215份,阳性率48.08.％,肠道病毒71型200份,柯萨奇A组16型15份.结论 肠道病毒71型是2011年蚌埠市手足口病流行的主要病原.
关键词： 手足口病 实时荧光定量PCR 肠道病毒71型 柯萨奇病毒A组16型 -
实时荧光RT-PCR法检测手足口病病原体EV71和CA16及临床特点分析
目的 探讨应用实时荧光RT-PCR法检测手足口病患儿病原体肠道病毒71型(EV71)与柯萨奇病毒A组16型(CA16)的诊断价值以及其临床意义.方法 采集自2015年1月以来该院收治的明确诊断为手足口病患儿的粪便标本共150份,从中提取病毒RNA采取实时荧光RT-PCR法进行肠道病毒通用型(EV)、EV71和CA16检测,并根据检测结果对比分析两种不同类型的病原体感染致手足口病患儿的临床特征及治疗转归差异.结果 肠道病毒通用型(EV)阳性的标本共有141份,检出率为94.00％;EV71(+)的标本共有89份,检出率为59.33％;CA16(+)的标本共有19份,检出率为12.67％.EV71或(和)CA16(+)的标本,其EV检测均亦是阳性.该结果与云南省疾病预防控制中心复检报告完全一致.89例EV71(+)患儿与19例CA16(+)患儿的年龄、细胞、体温、发热率、手足部皮疹率、WBC、ALT、AST、BUN、Scr、X线双肺纹理增粗发生率、肺部啰音发生率、心动过速发生率、治疗后体温恢复时间、住院时间差异均不具有统计学意义(P＞0.05).结论 不同病原体感染类型手足口病患儿的临床表现特异性不明显,起病早期对手足口病患儿的粪便进行检测可鉴别诊断病原体感染类型,有助于治疗方案的制定.
关键词： 手足口病 肠道病毒71型 柯萨奇病毒A组16型 实时荧光定量PCR法 -
柯萨奇病毒A组16型抗原的ELISA定量检测方法建立
目的:建立柯萨奇病毒A组16型(CA16)抗原的双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于CA16灭活疫苗的研发和生产过程的抗原定量检测.方法:以CA16中和单抗T26H12为包被抗体、NA14B9为标酶抗体,构建定量检测CA16抗原的双抗体夹心ELISA方法,并对方法的特异性、灵敏度、精密度、准确性、线性和稳定性进行分析.结果:建立了双抗体夹心定量检测CA16抗原的ELISA方法.方法的线性相关系数R2=0.998,线性范围为8~128 ng/ml,定量限度为8 ng/ml;变异系数CV<15%;回收率介于87.0%~113.8%之间;37℃6天的回收率>80%;与CA16以外的其他样本没有交叉反应.结论:构建的CA16抗原ELISA定量检测方法的各项性能符合定量检测需要,可用于CA16疫苗的研发和生产过程的抗原活性的定量检测.
关键词： 柯萨奇病毒A组16型 抗原 双抗体夹心ELISA -
手足口病病毒核酸1166例检测结果分析
目的:采用荧光PCR法对手足口病患儿进行病原学检测,分析手足口病病毒分型.方法:采集1166例临床确诊手足口病患儿的肛拭子及咽拭子,采用荧光核酸检测试剂盒进行肠道病毒筛选,对两种常见肠道病毒进行归纳比较.结果:1166例患者中以埃可病毒属感染为主,EV<,71>明显多于Cox A<,16>,P<0.005;在Cox A<,16>阳性病例中多有埃可病毒协同感染.结论:注重埃可病毒感染手足口病患者的防治工作,EV<,71>感染的患者须注意重症患者的出现.
关键词： 手足口病 病毒感染 荧光定量PCR 柯萨奇病毒A组16型 肠道病毒71型 -
柯萨奇病毒A组16型临床分离株的生物学特性分析
目的 对引起手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)的重要病原体柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus group A type16,CA16)临床分离株的生物学特性进行分析,为后续的疫苗研发奠定基础.方法 从昆明地区HFMD临床疑似患者178份咽拭子及粪便标本中分离并鉴定CA16毒株,并对病毒的生长特性、蚀斑形态以及对乳鼠的致病性等生物学特性进行分析.结果 共分离出7株CA16病毒:KM1、KM15、KM154、KM165、KM168、KM263、KM881,均属于B1亚型;病毒在Vero细胞上增殖较快,多数毒株4～6d即可达到增殖高峰,但感染性滴度差别较大,低为4.75 lgCCID50/ml,而高可达7.78 lgCCID50/ml;各毒株在Vero细胞上培养相同时间形成的蚀斑形态不同,其中KM15、KM154、KM168蚀斑呈圆形,针尖样大小,边缘较清晰,KM1、KM881、KM263、KM165蚀斑较大,不规则,边缘较模糊;各毒株毒力均较强,经乳鼠颅内注射后,乳鼠均于3～6 d陆续开始发病,除KM168、KM154、KM15组乳鼠为不同程度的发病及死亡外,其他组乳鼠发病率及病毒致死性死亡率均达100％;各毒株对乳鼠的脑、心肌、肺、肌肉、脊髓和肝脏等组织均有不同程度的损伤,其中损伤较严重的组织为脑和肌肉.结论 分离的CA16毒株对Vero细胞均具有良好的适应性,蚀斑清晰,毒力较强,且多数毒株感染性滴度较高,可用于CA16病毒致病机理的研究及疫苗的研发.
关键词： 手足口病 柯萨奇病毒A组16型 生物学特性 -
2009年中国云南昆明地区柯萨奇病毒A组16型遗传特性分析
目的 对2009年中国云南昆明地区柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CoxA 16)毒株的部分VP1区进行分析,了解CoxA16的遗传特性.方法 设计针对肠道病毒A群的通用引物,采用半巢式RT-PCR扩增目的片段,对PCR产物测序；使用Omiga和Mega4.1等生物学软件进行核苷酸、氨基酸序列比对及病毒的系统进化分析.结果 200份2009年昆明市儿童医院临床诊断为手足口病或并发脑炎疑似肠道病毒感染的患者粪便标本中有52份为CoxA16感染,其中15份来自脑炎患者.52株CoxA 16病毒部分VP1区核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,核苷酸序列同源性为98.5％～100％,氨基酸序列同源性为98.8％～100％;与shzh00-2、shzh99-48和107/Toyama/1990相比较,核苷酸序列同源性为92.3％ ～ 93.8％,氨基酸序列同源性为95.3％～96.8％；与国际标准株G10相比较,核苷酸序列同源性为78.5％～ 80.3％,氨基酸序列同源性为93.2％ ～ 94.5％；与其他13个参考株的核苷酸序列同源性为96.6％～99.5％,氨基酸序列同源性为98.3％～100％.基因系统进化分析显示,52株CoxA16均属于B基因型的一个分支.结论 2009年中国云南昆明地区CoxA16株属于B2亚型.
关键词： 柯萨奇病毒A组16型 VP1 序列分析 -
33株柯萨奇病毒A组16型分离株的全基因序列分析
目的 对2008～2010年北京和青岛地区流行的33株柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus A16,CA16)分离株的全基因序列进行分析.方法 收集2008 ～ 2010年北京和青岛地区CA16感染患者咽拭子标本,采用Vero细胞对病毒进行分离,并经噬斑纯化.提取病毒RNA,采用RT-PCR法分段扩增CA16全长基因,经序列测定和拼接后,利用DNAStar和MEGA5.10软件分析全基因序列.结果 经病毒分离和噬斑纯化,共获得33株CA16分离株；33个分离株之间的核苷酸序列同源性大于90.9％,与CA16国际标准株G10各区段的核苷酸序列同源性为72.7％～89.0％,氨基酸序列同源性为79.3％～100.0％；与近年中国分离的CA16 SZ/HK08-7株同源性较高,全基因组同源性大于91.5％,各区段核苷酸序列同源性均大于83.7％；在基于VP1序列的种系进化树中,BJWG16、BJWG17、BJWG20等23个分离株属于C1亚型,其余10个分离株属于C3亚型.结论 2008 ～ 2010年北京和青岛地区流行的33株CA16分离株均为C基因型.本研究对我国CA16分子流行病学、毒力位点的研究以及疫苗株的选择具有重要意义.
关键词： 柯萨奇病毒A组16型 全基因组 序列分析 -
柯萨奇病毒A组16型实壳病毒颗粒与空壳病毒颗粒免疫原性的比较
目的 比较柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)实壳病毒颗粒(full particle,FP)和空壳病毒颗粒(empty particle,EP)的免疫原性.方法 以CVA16病毒株CVA16-L731感染Vero细胞,采用10层细胞工厂培养工艺培养病毒,收获液经离心纯化后,用甲醛灭活,获得灭活纯化的CVA16-L731 FP和EP.采用BCA法检测CVA16-L731 FP和EP的蛋白浓度,4％ ～ 12％ SDS-PAGE、Western blot及透射电镜对CVA16-L731 FP和EP进行鉴定.以氢氧化铝为佐剂,分别以EP、FP、EP/FP为抗原,于第0、14、28天经后肢肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,于0、7、21、35、49、63、77、91d对小鼠进行眼眶采血.采用微量中和试验法检测免疫小鼠血清中和抗体滴度,ELISA法检测免疫小鼠血清特异性IgG抗体滴度,母传抗体保护试验检测CVA16-L731 FP和EP的垂直保护效果.结果 纯化后的CVA16-L731 FP和EP的蛋白浓度分别达到420和150 μg/ml;CVA16-L731 FP可见4条相对分子质量分别约为34 000(VP1)、26 000(VP2)、24 000(VP3)和8 000(vP4)的条带,CVA16-L731 EP可见3条相对分子质量分别约为36 000 (VP0)、34 000(VP1)和24 000(VP3)的条带;CVA16-L731 FP和EP的纯度均可达95％;CVA16-L731 VP1兔多抗可与FP及EP的VP1、CVA16-L731 VP2兔多抗可与FP-VP2及EP-VP0发生特异性免疫反应;CVA 16-L731FP和EP分别为内部不可被磷钨酸负染的FP致密圆形颗粒和内部可被磷钨酸负染的黑色EP圆型颗粒.小鼠免疫试验结果显示,第1次免疫后各抗原免疫组小鼠血清中和抗体阳性率均为100％;第2次免疫后血清中和抗体滴度和血清特异性IgG水平均显著升高;第3次免疫后血清中和抗体滴度均无明显变化,但血清特异性IgG水平均明显升高;第3次免疫后的63 d内,血清中和抗体滴度均无显著变化.各抗原免疫组乳鼠存活率均为100％.结论 CVA16-L731 FP和EP均能诱导小鼠持续产生较高水平的血清中和抗体和特异性IgG抗体,且母传抗体可保护2日龄乳鼠抵抗CVA16-S315的致死性攻击,为CVA16疫苗的研制提供了实验依据.
关键词： 柯萨奇病毒A组16型 中和抗体 垂直保护 -
柯萨奇病毒A组16型cDNA感染性克隆的构建
目的 构建柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)cDNA感染性克隆.方法 提取CA16基因组RNA,经RT-PCR得到基因组全长cDNA,插入至TOPO-XL-PCR载体,获得CA16全长cDNA克隆.采用T7聚合酶系统将线性基因组cDNA体外转录出病毒基因组RNA,纯化后转染Vero细胞,获得拯救病毒.通过RT-PCR、基因测序及免疫荧光法对拯救病毒进行鉴定,并对拯救病毒与母本病毒的增殖特性进行比较.结果 病毒基因组RNA转染Vero细胞后48 h,可见典型的肠道病毒致细胞病变.拯救病毒经RT-PCR、基因测序和免疫荧光鉴定为CA16,且与母本野生型病毒增殖特性基本一致.结论 成功构建了具有感染性的CA16全长cDNA克隆,为研究CA16基因功能和研发CA16新型疫苗奠定了基础.
关键词： 柯萨奇病毒A组16型 感染性克隆 病毒拯救 -
柯萨奇病毒A组16型中和抗体检测方法的实验室评价
目的 评价柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)中和抗体检测方法于不同实验室内和实验室间的可重复性.方法 参照WHO脊髓灰质炎病毒中和抗体检测方法,建立CA16中和抗体检测方法和实验标准;收集22份血清样品,对CA16 A基因型毒株G10及B基因型毒株W190、33、203、P11和CS02毒株独立进行CA16中和抗体有效检测实验,评价所建立的检测方法于A～G实验室内和实验室间的可重复性;分别于A、B、C、D和E实验室比较G10毒株与W190、33、203、P11和CS02毒株对CA16中和抗体检测结果的影响.结果 在各实验室内,有17/22份血清样品的变异系数(variable coefficient,CV)在0～11.4％之间,表明该检测方法在同一实验室内具有较好的可重复性;在实验室间,除3份低效价血清和1份效价过高血清外,其余血清样品的几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)大差异倍数均在3.0倍以内,实验室间检测差异在可接受范围内;W190、33、203、P11和CS02毒株与G10毒株检测结果趋势相近.在同一实验室内,W190和33毒株与G10毒株的检测结果差异无统计学意义;203、P11和CS02毒株的检测结果均低于G10毒株,差异有统计学意义,表明B基因型毒株与A基因型毒株生物学活性存在一定差异.结论 以G10毒株检测CA16中和抗体的方法在各协作实验室可得到良好应用,有利于CA16中和抗体检测的标准化,但适用性需进一步评估和验证.
关键词： 柯萨奇病毒A组16型 中和抗体 基因型 -
生物反应器-微载体技术培养Vero细胞制备柯萨奇病毒A组16型
目的 利用生物反应器-微载体培养技术培养Vero细胞制备柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16).方法 应用生物反应器-微载体培养法进行Vero细胞培养,待细胞长成致密单层时,接种CA16,于37 ℃培养,每隔24 h观察细胞病变情况,并检测病毒滴度.结果 Vero细胞在微载体上吸附140 h后,绝大部分细胞在微载体上长成致密单层,细胞密度约为12.3×105个/ml;接种CA16后72 h,Vero细胞完全病变,几乎全部从微载体上脱落,病毒滴度达高,约7.75 TCID50/ml.结论 成功采用生物反应器-微载体培养技术培养Vero细胞制备了CA16,且病毒滴度较高,为CA16灭活疫苗的研制奠定了基础.
关键词： 生物反应器 微载体 Vero细胞 柯萨奇病毒A组16型 -
氯仿抽提纯化CA16病毒优条件的筛选
目的 筛选氯仿抽提纯化柯萨奇病毒A组16型(Coxsakievirus A 16,CA16)的优条件.方法 根据《中国药典》三部(2015版)的相关要求,选择病毒感染性滴度、残余蛋白、残余牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、残余卡那霉素及残余氯仿含量等指标,分析氯仿抽提的不同条件及超滤浓缩对纯化产物质量指标的影响.将CA16浓缩病毒液与氯仿按不同体积比进行一抽多洗纯化,分析不同比例氯仿对纯化效果的影响;将CA16超滤浓缩病毒液分别用不同浓度的PBS洗涤,以评价不同离子浓度的PBS洗涤对纯化病毒纯化液质量指标的影响.结果 不同浓度的PBS洗涤液、病毒液与氯仿体积比对纯化液病毒感染性滴度均无明显影响,病毒回收率平均为81.7％;随着PBS洗涤次数的增多,洗液中的杂蛋白逐渐减少,氯仿比例及PBS离子浓度对蛋白去除率影响不明显,蛋白去除率均大于82％(82.69％ ～ 93.6％),平均去除率88.37％;不同氯仿比例、不同PBS浓度及不同洗涤次数对残余卡那霉素含量无明显影响,结果均低于30 ng/ mL,经超滤浓缩后,其含量低于3.0 ng/mL;氯仿抽提纯化残余BSA的去除率可达68.87％,若结合超滤浓缩工艺,残余BSA的去除率可达94.74％;超滤浓缩后纯化病毒液残余氯仿去除率可达98％以上,终纯化液残余氯仿含量小于6μg/mL.结论 氯仿抽提方法结合超滤浓缩可得到符合要求的CA16病毒实验性疫苗.
关键词： 柯萨奇病毒A组16型 氯仿抽提 疫苗 质量控制 -
柯萨奇病毒A组16型抗原定量检测ELISA方法的建立及初步应用
目的 建立柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus group A type 16,CA16)抗原定量检测的ELISA方法,用于CA16疫苗中抗原的定量检测.方法 以纯化的CA16病毒颗粒作为免疫原,分别免疫家兔和BALB/c小鼠,制备抗CA16多克隆抗体和单克隆抗体.以抗CA16多抗作为包被抗体,经HRP酶标记的单抗作为酶标抗体,建立CA16抗原定量检测的双抗体夹心ELISA方法,确定该方法的线性范围,并进行准确度、精密度、稳定性及特异性验证.用建立的方法检测CA16疫苗原液制备过程样品中CA16抗原含量.结果 以抗CA16多抗为包被抗体,针对74株不同基因型的CA16的ELISA检测结果均为阳性,该抗CA16单抗的广谱性较好.该方法的线性范围为23.4 ～ 750 ng/ml,R2＞0.99,小检出量为23.4 ng/ml;样品回收率在89％～108％之间,CV＜15％,准确度和精密度较好;抗体包被板干燥后于37 cc放置6d,CV＜20％,稳定性较好;PV纯化样品、EV71收获液、Vero细胞样品中抗原的A值均小于cutoff值,特异性较好.随着CA16疫苗制备过程的不断进行,中间品1～4比活分别为0.44、0.64、92.13和1 239.03,呈逐渐上升趋势.结论建立了CA16抗原定量检测的双抗体夹心ELISA方法,该方法准确度、精密度高,稳定性及特异性较好,为CA16疫苗的研制及工艺开发奠定了基础.
关键词： 柯萨奇病毒A组16型 抗原 酶联免疫吸附法 -
柯萨奇病毒A组16型疫苗的研发进展
柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)是引起手足口病(hand,foot and mouth desease,HFMD)的主要病原体之一.研发CA16疫苗对控制HFMD流行具有重要意义.本文探讨了CA16疫苗研发的必要性和可行性,并对CA16疫苗中和抗体检测方法、动物模型、重组病毒样颗粒(recombinant virus-like particles,rVLPs)疫苗及灭活疫苗等相关的研发进展作一综述.
关键词： 柯萨奇病毒A组16型 疫苗 中和抗体 动物模型 -
手足口病病原EV71和CA16的比较
手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是世界范围内流行的儿童传染病,曾在亚太地区出现过多次大规模的暴发和流行,肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus A16,CA16)是引起该病的两种主要病原.尽管这两种病毒在遗传学上关系很近,但其感染在临床表现和体征方面均存在一定差异,这种差异是源于病毒基因组的不同,还是由遗传表型特性所致,是值得研究的课题.本文就二者的特征及感染后宿主的细胞反应和比较蛋白质组学研究进行综述.
关键词： 手足口病 肠道病毒A型.人 柯萨奇病毒A组16型 蛋白质组学 -
柯萨奇病毒A组16型病毒样颗粒的制备及其免疫原性
目的 应用Bac-to-Bac杆状病毒系统表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP),通过条件优化,提高VLP的表达量,纯化后检测其免疫原性.方法 对CVA16结构蛋白基因P1及蛋白酶基因3CD进行密码子优化,插入启动子P10改造为CMV的重组杆状病毒表达载体pFastBac Dual-CMV中,获得重组穿梭质粒pFastBac Dual-CMV-P1-3CD,转化DH10 BacTM Competent Cells,提取重组杆粒Bacmid-CMV-P1-3CD,转染Sf9细胞,组装成重组杆状病毒AcMNPV-CMV-P1-3CD,并进行扩增,采用间接免疫荧光法、Western blot法及透射电镜观察对表达产物进行初步鉴定.对重组CVA16 VLP的表达条件(病毒接种MOI值、感染时间及细胞培养方式)进行优化后,通过20％蔗糖垫层及氯化铯连续密度梯度离心法纯化CVA 16VLP,并通过腹部皮下注射免疫ICR小鼠3次,采用间接ELISA法检测小鼠血清特异性IgG抗体滴度,微量中和试验法检测血清中和抗体滴度.结果 重组杆状病毒AcMNPV-CMV-P1-3CD经PCR及测序鉴定证实组装成功;重组CVA16 VLP在Sf9细胞中成功表达,优化的表达条件为:重组杆状病毒AcMNPV-CMV-P1-3CD按MOI=5接种,Sf9细胞采用悬浮培养方式悬浮培养96 h,收集细胞及培养上清;纯化的CVA16 VLP纯度可达90％以上,针对VP2的单克隆抗体能与VP0及VP2发生特异性反应,电镜下可见大量形态规则的类球形VLP,直径约为27 nm;纯化的CVA16 VLP免疫ICR小鼠后,诱导机体产生的特异性血清IgG滴度可达1∶105,中和抗体滴度达1∶358.结论 应用杆状病毒表达系统成功表达了CVA16的P1和3CD蛋白,并组装形成完整的VLP;通过质粒启动子的改造及表达条件的优化,有效提高了CVA16 VLP的表达量;纯化的CVA16 VLP可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,为CVA16亚单位疫苗的研究提供了参考.
关键词： 手足口病 柯萨奇病毒A组16型 病毒样颗粒 免疫原性 -
CA16疫苗候选株特异性免疫血清保护性的初步评价
目的 评价CA16 K168/8疫苗候选株免疫血清对不同CA16毒株的交叉中和能力及对致乳鼠麻痹CA16临床分离株的体内中和保护能力.方法 将CA16 K168/8疫苗候选株病毒纯化液辅以弗氏佐剂经背部及侧腹部皮下多点注射免疫新西兰大白兔,制备高效价免疫血清.采用微量细胞病变法检测中和抗体效价;用中和抗体效价终浓度为32 U的特异性免疫血清对18株不同CA16临床分离毒株及15株EV71毒株进行交叉中和指数检测;选取中和抗体效价为16、32、64、128、256 U的特异性免疫血清对可致乳鼠产生明显麻痹作用的CA16 FY-18株进行体内中和保护水平检测.结果 获得的兔抗CA16 K168/8血清对14株CA16毒株的中和效价为1∶1 024～1∶6144,GMT值为1∶3 153;可于体外完全中和18株不同CA16毒株,中和指数为100～5 623.4,平均值为794.1,而对15株EV71临床分离株中和指数仅为0.32～5.62,平均值为2.2;体内中和保护水平随抗体效价升高而增加,呈量-效关系,当中和抗体效价达128 U时,可完全保护乳鼠不发生临床麻痹反应.结论 CA16 K168/8疫苗候选株特异性免疫血清体内、外试验结果表明其具有良好的免疫保护性.
关键词： 柯萨奇病毒A组16型 疫苗候选株 免疫血清 交叉保护
