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细粒棘球蚴AgB亚单位抗原基因的克隆和表达系统的优化
目的 从我国细粒棘球绦虫分离株(新疆源和甘肃源)中克隆AgB1和AgB2两个亚单位基因,并试用不同的表达载体对两个AgB亚单位基因的表达情况进行比较观察.方法 设计特异性引物,扩增AgB1和AgB2亚单位抗原基因,分别用pET28a(+)、pET32a(+)和pGEX4T-13种表达载体构建重组质粒,对AgB亚单位基因在不同载体中的表达情况进行比较.结果 从我国细粒棘球绦虫分离株中克隆的AgB1和AgB2抗原基因与GenBank中的序列比对,AgB1与德国人源、巴西羊源、意大利牛源均有一定的核苷酸和氨基酸差异;AgB2与乌拉圭羊源序列完全一致.在3种载体中表达重组蛋白的结果显示,不同载体和表达系统对重组表达蛋白的生物活性和可溶性有较大的影响.结论 成功地克隆了细粒棘球蚴AgB亚单位基因,AgB1和AgB2基因在3种不同表达载体中的表达情况及对融合标签蛋白的血清基础反应性的比较分析表明,两个重组抗原在pET32a载体中的表达优于pET28a和pGEX4T-1载体.
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Echinococcus granulosus钙结合蛋白基因的克隆和序列分析
目的获得细粒棘球蚴Calcium-binding protein(CaBPs)基因序列资料,进行序列分析,为包虫病免疫预防研究奠定基础.方法从包囊内获取细粒棘球蚴原头蚴(protoscolices),提取RNA,逆转录成cDNA,用特异引物扩增CaBPs基因;并将其克隆到T载体后进行序列测定和分析.然后登录Gene/Bank数据库.结果以cDNA为模板获得3个核苷酸长度不同的基因,分别是CaBP1为914bp,CaBP2为1095bp,CaBP3为1039bp.同源性比较结果表明:来自新疆羊源CaBPs基因序列和巴西(Brazil)羊源基因CaBPs同源性为90%以上;从cDNA获得的3个CaBPs基因序列的比较分析说明钙结合蛋白可能存在一个家族,有不同的成员组成.结论 CaBPs在E.granulosus虫体发育过程中具有十分重要的功能,到目前为止其机理尚不完全明了,CaBPs基因的获得为进一步研究其结构和功能,以及对包虫病的防治具有重要意义.
关键词： 细粒棘球蚴 钙结合蛋白(CaBPs) 克隆 序列分析 -
包虫疫苗候选抗原基因FABP的克隆与序列分析
目的获得细粒棘球蚴脂肪酸结合蛋白(FABP)基因序列资料,并进行序列分析.方法从包虫包囊内获取细粒棘球蚴原头蚴(protocloex),提取RNA和DNA,分别以cDNA和基因组DNA为模板扩增出FABP基因;并将其分别克隆到T载体后进行序列测定和分析;同时将从cDNA扩增得到的FABP基因亚克隆到原核表达载体(pTGEX-4T).结果获得长度分别为402bp和482bp两个FABP基因,序列分析表明内含子区域在349…427bp,同源性比较结果FABP基因ORF内一个碱基突变.结论获得了FABP基因,为研究其免疫效果奠定了基础.
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细粒棘球蚴线粒体rRNA的序列测定
通过EST方法对细粒棘球蚴cDNA文库进行筛选,将得到的EST序列送入GenBank和EBI进行同源性分析及登陆,对有意义的EST进行通测,得到了完整的细胞线粒体rRNA序列,并进行了同源性比较及质粒转化.为细粒棘球蚴的系统分类、鉴定及进化研究提供了新的有用依据.
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包虫病的疫苗研究进展
免疫预防是防止包虫病流行的比较理想的途径.用现代分子生物学技术对细粒棘球绦虫的有效免疫原成份进行筛选和克隆,制备基因工程疫苗,为包虫病的免疫预防和免疫诊断开辟了新途径.本文仅就囊性包虫病近年来的疫苗研究进展作一综述.
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包虫病诊断抗原的纯化及诊断效价
[目的] 建立一种简便快速、适合基层的包虫病诊断方法.[方法] 采用简便的一步层析方法从包囊液内纯化具有诊断价值的脂蛋白抗原,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)和诊断试纸法(Dipstick法),对血清进行检测,评价其效果.[结果] ELISA检测包虫病人血清48份,阳性45份,检出率93.7%,和10份羊多房棘球蚴血清中的1份起交叉反应,而和羊细颈囊尾蚴、弓形虫、血吸虫血清不起反应.用Dipstick方法检测24份包虫病人血清,19份阳性,检出率79.2%,和其它寄生虫血清无交叉反应.[结论] 本试验为包虫病诊断试剂盒的研制奠定了基础.
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肝包虫病864例手术治疗体会
肝包虫病是西北地区常见的一种寄生虫病,它是由细粒棘球蚴寄生在肝脏所致.肝包虫病的有效治疗方法是手术,并发症的处理至关重要.笔者总结银川市第一人民医院1982～2002年手术治疗肝包虫病人864例经验,特别是常见并发症的预防处理,旨在提高手术治愈率.
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细粒棘球蚴14-3-3重组疫苗免疫小鼠T淋巴细胞差异蛋白质组分析
目的：用蛋白质组学方法分析细粒棘球蚴（Eg ）14‐3‐3重组疫苗免疫小鼠和磷酸盐缓冲液（PBS ）注射小鼠 T淋巴细胞表达的蛋白质组，建立差异表达蛋白谱。方法以Eg14‐3‐3重组疫苗免疫小鼠为实验组，PBS注射小鼠为对照组，Eg14‐3‐3重组疫苗免疫2周后提取两组小鼠脾脏T淋巴细胞总蛋白，双向电泳（2‐DE）分离总蛋白，比较两组小鼠 T 淋巴细胞的差异表达蛋白质。结果凝胶电泳发现11个存在明显差异的蛋白质点，其中7个蛋白明显见于实验组小鼠 T淋巴细胞中，4个点明显见于对照组小鼠中。结论14‐3‐3重组疫苗免疫小鼠与PBS注射小鼠T淋巴细胞表达蛋白质组有明显差异，差异表达蛋白对疫苗免疫机制的研究及后续的疫苗优化具有重要意义。
关键词： 细粒棘球蚴 14-3-3重组疫苗 T淋巴细胞 差异蛋白质组 -
细粒棘球蚴 GST 抗原表位的生物信息学预测?
目的：应用生物信息软件分析细粒棘球蚴谷胱甘肽 S-转移酶(EgGST)的蛋白二级结构并预测 B 淋巴细胞表位和 T淋巴细胞表位，为后续表位疫苗的设计研究提供基本的数据和资料。方法采用 DNAstar 软件、ProPred MHC Class-Ⅱ Binding Peptide Prediction Server 和 Biosun 软件对 EgGST 的 B 淋巴细胞表位和 T 淋巴细胞表位进行预测。结果预测 EgGST 存在8个 B 淋巴细胞表位区域和7个 T 淋巴细胞表位。结论分析预测的 EgGST 抗原表位将对后续的表位疫苗研究具有重要意义。
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细粒棘球蚴重组蛋白GST诱导小鼠脾细胞增殖及对细胞因子水平的影响
目的 探讨细粒棘球蚴重组蛋白GST(rEg.GST)诱导小鼠产生免疫保护力的机制.方法 将rEg.GST与弗氏佐剂混合免疫小鼠,腹腔注射原头蚴制备包虫感染模型,分离脾淋巴细胞,用rEg.GST和刀豆蛋白A (ConA) 诱导后,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测小鼠脾淋巴细胞的增殖情况;酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清液中白细胞介素-2(IL-2) 、白细胞介素-4(IL-4) 、γ-干扰素(IFN-γ)和白细胞介素-10(IL-10) 的表达水平.结果 重组蛋白免疫组在rEg.GST及ConA刺激状态下脾淋巴细胞增殖水平均高于佐剂组(P=0.003 0; P＜0.001) 和PBS组(P=0.001 4; P=0.006 1).与PBS组比较,rEg.GST组在免疫后、感染后的IL-2、IFN-γ、与IL-4的水平均增高(P=0.007 7; P=0.041 9; P=0.014 8); rEg.GST组免疫后与免疫前相比,IL-2、IFN-γ、IL-4与IL-10水平均增高(P=0.001 7; P=0.023 1; P=0.003 1; P=0.021 2);感染后与免疫后相比,IL-4与IL-10水平升高,IL-2水平则呈下降趋势(P=0.009 4; P=0.039 3; P=0.0179).结论 rEg.GST能够促进脾淋巴细胞的增殖并同时活化辅助性T细胞1型(Th1)与2型(Th2)细胞.
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细粒棘球蚴感染对哮喘大鼠血清白介素-17水平及Th1/Th2平衡的影响
目的 建立细粒棘球蚴感染并发过敏性哮喘实验动物模型及探讨细粒棘球蚴感染对过敏性哮喘的作用.方法 24,只健康Wistar大鼠,随机分为3组,A组为正常对照组,B组为单纯哮喘组,C组为细粒棘球蚴感染并发哮喘组.C组大鼠经腹腔注射感染细粒棘球蚴,70 d后,以卵白蛋白(OVA)分别对B组、C组大鼠进行致敏及激发,建立过敏性哮喘模型.取大鼠肺组织作病理切片,观察大鼠肺组织的炎症变化,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清白介素-17(IL-17)、白介素-4(IL-4)及干扰素-γ(IFN-γ)的水平.结果 与B组比较,C组大鼠血清IL-17和IL-4的水平明显下降(P<0.05),而血清IFN-γ的水平明显上升(P<0.05).各组大鼠血清IL-4与IFN-γ水平呈密切负相关(r=0.915),IL-4和IFN-γ水平与IL-17呈负相关关系r=-0.406,-0.603),P<0.05.结论 细粒棘球蚴感染对过敏性哮喘的发生有抑制作用.
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Th9细胞和白介素-9在细粒棘球蚴感染患者中的变化特点及意义
目的 探讨辅助性T细胞9(Th9)在肝囊型包虫病患者慢性感染中的作用.方法 通过流式细胞术和实时荧光定量PCR法分别检测2010年8月至2012年12月新疆医科大学第一附属医院33例囊型包虫病患者(CE)及20例健康体检者外周血Th9细胞和特异性转录因子PU.1的表达.结果 1)CE组Th9细胞占CD4+T的比值(CD3+CD4+IL-9+/CD4+T cells) (0.91％±0.57％)高于健康对照组(0.61％±0.2％),差异具有统计学意义(P=0.042); 2)CE组PU.1、IL-9 mRNA的表达水平明显高于健康对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 CE患者体内Th9/IL-9表达上调,Th9细胞可能参与了细粒棘球蚴慢性感染的免疫应答和调控.
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肝棘球蚴病11例CT诊断分析
肝棘球蚴病(包虫病),为细粒棘球蚴和多房棘球蚴的寄生虫,寄生于人体引起的一种人畜共患的寄生虫病,也称包虫囊肿和泡型肝包虫病.我国主要流行于发达的畜牧业地区.肝棘球蚴病的CT诊断已有文献报告,泡型肝包虫病发病率低,约为1%～2%[1].本文主要报告资料完整的包虫囊肿病11例,旨在提高对本病的认识.
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细粒棘球绦虫抗氧化蛋白TPx的免疫定位
目的:研究抗重组细粒棘球绦虫抗氧化蛋白TPx(rEgTPx)多克隆抗体对天然EgTPx的结合活性,探讨EgTPx在原头蚴内的分布.方法:采集自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏,在无菌条件下收集包囊内的原头蚴,经消化处理后制备石蜡切片.利用rEgTPx多克隆抗体,以间接免疫荧光法确定抗氧化蛋白EgTPx在原头蚴内的分布.结果:rEgTPx多克隆抗体能够特异性地结合天然EgTPx抗原表位,EgTPx广泛分布在原头蚴的体表皮层、皮下层和钙颗粒细胞内.结论:确定了EgTPx蛋白在细粒棘球绦虫原头蚴内的分布,为研究EgTPx在原头蚴发育的生物功能奠定基础.
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不同部位囊型包虫病的 CT 影像学表现
目的：探讨不同部位包虫病的 CT影像学表现。方法经临床手术及病理证实的包虫病12例，就其 CT表现回顾性分析并就相关文献进行复习，就其 CT 表现回顾性分析并就相关文献进行复习。结果本组所有病例均为囊型包虫病，肺包虫8例，心脏包虫1例，眼眶包虫1例，小腿肌肉包虫1例，髂骨包虫1例，其中有1例同时合并肺、肝包虫，1例同时合并肺、盆腔及左前下腹壁多发包虫。CT表现为单囊征1例，囊内分隔征2例，混杂实性密度块影2例，内囊分离征3例，多子囊征3例，退变卷褶征1例。结论不同部位的囊型包虫CT影像具有一定的共性特征，结合临床流行病学特点可提高诊断准确率，为影像科和临床医生对于诊断与鉴别诊断提供帮助。
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CT在囊性肝包虫病诊治中的应用
囊性肝包虫病是细粒棘球蚴引起的一种肝脏占位性病变,因此CT在综合诊断方面优于X线、B超及MR[1-3].CT可显示肝包虫的位置、数目、大小、与周围组织器官的毗邻关系,周围组织器官的病理形态,同时反映出肝包虫发生、演变和转归过程等不同阶段的病理改变.随着CT技术普遍用于临床,对于囊性肝包虫病的诊断、预后与指导治疗都有着突出的意义.
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细粒棘球绦虫(中国大陆株)诊断抗原P-29重组蛋白的免疫保护性研究
目的:探讨细粒棘球蚴(Eg)诊断抗原P-29重组蛋白的免疫保护性及其作为候选疫苗的潜在价值.方法:ICR小鼠随机分为蛋白免疫组和佐剂对照组,每隔2 wk皮下免疫1次,在第3次免疫后2 wk,用Eg原头蚴进行攻击感染,感染后20 wk剖杀小鼠,检获棘球蚴包囊,计算免疫保护力,并用ELISA法测定血清中IgG及其亚型和IgE水平.结果:与佐剂对照组比较,蛋白免疫组小鼠的免疫保护力为96.6%;与免疫前比较,免疫后和攻击感染后蛋白免疫组小鼠血清IgG,IgG1,IgG2a和IgE水平均明显升高(P<0.05),IgG2b降低(P<0.05).结论:细粒棘球绦虫诊断抗原P-29重组蛋白能诱导小鼠产生一定的保护性免疫,是潜在的疫苗候选抗原分子.
关键词： 细粒棘球蚴 EgP-29重组蛋白 免疫保护 -
细粒棘球蚴Eg14-3-3 重组疫苗诱导小鼠细胞因子的动态观察
目的 观察重组疫苗Eg14-3-3免疫后及厡头蚴攻击感染后不同阶段6种细胞因子的动态变化,在分子水平上研究重组疫苗的免疫学机制.方法 研究采用rEg14-3-3和PBS分别免疫两组ICR小鼠,每隔两周免疫1次,在第3次免疫后4周,活的原头蚴攻击感染,在免疫后和攻击感染后不同时间静脉采血分离血清,ELISA法对血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-10水平变化进行检测.结果 rEg14-3-3组小鼠6种细胞因子水平在免疫后和感染后高于PBS对照组,其中Th1类细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α水平在第10周(急性感染期)达到峰值,30周后(感染慢性期)迅速降低并较长时间维持在高于免疫前水平,Th2类细胞因子IL-4、IL-5、IL-10免疫后水平相对无明显升高,在第18周后逐渐升高,30周达到峰值后逐渐降低,较长时间维持在相对较高水平;PBS组Th1类细胞因子在感染前无明显升高,原头蚴攻击感染后迅速升高,在第18周达到峰值后逐步降低,在相对较长时期维持相对较高水平.Th2类细胞因子IL-4、IL-5、IL-10维持在较低水平,攻击感染后水平缓慢升高,IL-4在18周达到峰值后降低并长期维持相对较高水平,IL-5、IL-10在第30周水平达到峰值后逐步降低并长期维持相对较高水平.结论 rEg14-3-3可诱导有效的Th1型细胞介导的细胞免疫和Th2型细胞介导的体液免疫,两种反应共同参与重组疫苗诱导的免疫保护作用.
关键词： 细粒棘球蚴 14-3-3重组疫苗 细胞因子 -
细粒棘球绦虫(中国大陆株)14-3-3重组蛋白的免疫保护力
目的 探讨细粒棘球蚴Eg14-3-3重组蛋白的免疫保护性及其伴随的免疫反应.方法 ICR小鼠随机分为rEg14-3-3蛋白免疫组和PBS佐剂对照组,每隔2周背部皮下免疫1次,连续免疫3次.在第3次免疫后6周,用细粒棘球蚴活的原头蚴进行攻击感染,感染后24周杀鼠取脾,分离培养脾细胞,MTT检测淋巴细胞增殖率,用试剂盒检测脾细胞培养上清液的IL-2、IFNγ、II-10和IL-4水平,同时检获棘球蚴包囊数并计算减囊率,用ELISA法测定血清中IgG及其亚型和IgE水平.结果 与佐剂对照组比较,rEg14-3-3蛋白免疫组小鼠的免疫保护力为84.47％,rEg14 3 3蛋白免疫组小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a抗体水平高于对照组(P＜0.05)；IgE略低,但两组间差异无统计学意义；淋巴细胞增殖实验结果显示rEg14-3-3免疫组小鼠脾淋巴细胞特异抗原刺激后增殖显著,免疫组淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-2分泌水平显著高于对照组,而IL4、IL-10在两组间差异无统计学意义.结论 rEg14-3-3蛋白能诱导小鼠产生高水平的免疫保护力,是潜在的疫苗候选抗原分子.
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适用于细粒棘球蚴囊液蛋白质组分析的双向电泳技术
目的 建立适用于细粒棘球蚴囊液蛋白质组的双向电泳分离条件.方法 冷冻干燥法制备囊液总蛋白提取物,观察不同的蛋白样品处理方法、IPG胶条pH范围和电泳上样量对双向电泳图谱的影响.结果 经ReadyPrepTM2-D Cleanup Kit处理的提取物上样量为400 μg,在pH7～10范围的胶条进行双向电泳分离,可获取蛋白斑点较多、重复性较好的二维电泳图谱.结论 建立的细粒棘球蚴囊液双向电泳技术及图谱,可为细粒棘球蚴虫蛋白质组学的研究提供理论依据.
