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腺病毒载体在心血管基因转移体系中护理应用
心血管疾病是我国常见的疾病,同时由于心血管疾病的特点,会对患者的身体健康造成极大危害,目前在对心血管疾病患者进行治疗的过程中,基因治疗得到了较多医务人员的关注.而基因转移载体是一种基因治疗的重要方法,在对心血管疾病患者进行基因治疗的过程中,需要使用高效的基因转移载体以及转移的体系来将基因转入到患者的血管以及心脏中.文章讨论了腺病毒载体在心血管基因转移体系中的应用.
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仙台病毒BB1株6个编码基因的克隆及表达
在仙台病毒BB1株全基因组序列测定的基础上,用反转录和PCR方法获得了核蛋白基因(N),磷蛋白基因(P),神经血凝素基因(HN),基质蛋白基因(M)、融合蛋白基因(F)和聚合酶蛋白基因(L)等6个编码基因全长克隆;测序结果表明,其序列与Genbank中登录的序列(DQ219803)完全一致.为了提供仙台病毒基因组载体拯救和包装所需的反式作用蛋白,将N、P、M、F、HN和L分别克隆到腺病毒穿梭表达载体pDC316上,将它们分别与腺病毒基因组质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,获得了6种复制缺陷性重组腺病毒Ad5-N、Ad5-P、Ad5-M、Ad5-F、Ad5-HN和Ad5-L,酶切结果表明6种重组腺病毒穿梭质粒构建正确;用PCR方法证明所获得的6种重组腺病毒分别携带了上述6个编码基因;用重组腺病毒感染LLC-MK2细胞后用Western blotting和免疫荧光方法检测到了相应仙台病毒编码基因的表达.本研究为仙台病毒BB1株全长基因组的拼接和病毒载体包装系统组建打下了基础.
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共表达甲型流感病毒M1和HA双基因的重组腺病毒的构建及鉴定
以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)作为研究对象,通过引入内部核糖体进入位点序列(IRES),构建共表达H5N1亚型禽流感病毒膜蛋白基因M1和HA的重组腺病毒.PCR扩增禽流感病毒H5N1亚型M1和HA基因的全长可读框片段,先后亚克隆入pStar载体,然后扩增M1-IRES-HA片段并将其插入穿梭载体pShuttle-CMV,再与pAd-Easy载体在BJ5183菌中通过同源重组产生重组腺病毒载体,转化293细胞,包装出重组腺病毒Ad-M1/HA.将Ad-M1/HA感染293细胞,可观察到明显细胞病变效应,用免疫荧光及Westernblot方法均检测到M1和HA基因的表达.共表达M1和HA双基因的重组腺病毒的成功构建为开发新型重组腺病毒流感疫苗奠定了基础.
关键词： M1蛋白 血凝素 内部核糖体进入位点序列 腺病毒载体 -
表达流行性感冒病毒血凝素蛋白的重组腺病毒的构建
用RT-PCR方法扩增流感病毒血凝素基因,将其克隆到5型腺病毒载体质粒pAd5C中.用此质粒与EcoRI酶切回收的5型腺病毒基因组大片段共转染293细胞,通过PCR初步筛选得到重组病毒.SDS-PAGE电泳、Western blot证明重组病毒能表达流感病毒的血凝素蛋白.此重组病毒经滴鼻免疫Balb/C小鼠,ELISA实验证明能诱导小鼠产生针对流感病毒的循环抗体IgG和分泌型抗体IgA.本实验证明,利用E3区缺失的5型腺病毒载体可以用来表达流感病毒血凝素抗原,重组抗原具有良好的免疫原性,有可能发展成为基因工程流感疫苗.
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Gibson组装技术简化腺病毒载体反向遗传改造
重组腺病毒是常用的基因转移载体,本文介绍一种对腺病毒基因组进行反向遗传改造的策略.拟在维持基因编码蛋白氨基酸序列不变的前提下,突变去除重组人5型腺病毒Ad5GFP基因组的PmeI酶切位点.软件分析腺病毒质粒pAd5GFP序列,选择限制性内切酶BamHI将pAd5GFP切割为大小11.7和24.6kb两个片段,24.6kb大片段自身环化形成一个质粒pAd5GB,PmeI位于其上.PmeI/AscI双酶切pAd5GB质粒,产生2.4kb和22.2kb两个片段;在引物部位引入突变的PmeI位点(由gtttaaac突变为gtttaaaT),PCR扩增得到两端各延长30bp的上述2.4kb片段,与22.2kb片段进行Gibson组装,转化E.coli TOP10感受态细胞,得到pAd5GBXP质粒.BamHI酶切pAd5GBXP,碱性磷酸酶处理,与11.7kb片段连接,还原得到腺病毒质粒pAd5GXP.PacI线性化pAd5GXP质粒,转染293细胞,拯救得到Ad5GXP病毒;酶切分析证明Ad5GXP基因组不含有PmeI位点.研究结果说明将酶切连接与DNA组装技术相结合,能够方便灵活地对腺病毒基因组进行突变改造.
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肝细胞生长因子延长原代培养大鼠脊髓神经元的生存时间
目的 探讨肝细胞生长因子(HGF)对原代培养脊髓神经元的保护作用.方法 原代培养脊髓神经元转染不同滴度的绿色荧光蛋白或肝细胞生长因子重组腺病毒(Ad-GFP or Ad-HGF),用流式细胞仪检测转染率,PI-Hoechst双染色观察神经元生长状况.用ELISA、中性红、MTT和NSE-ELISA等方法分别检测Ad-HGF转染脊髓神经元后HGF的表达,以及HGF对神经元的保护和迁移作用.结果 在转染复数(M0I)为50时,Ad-GFP可高效转染脊髓神经细胞,且细胞生长状态好.转染Ad-HGF后,HGF能有效表达,同时HGF作用后的神经元活性明显高于对照组(P＜0.05).并观察到HGF对脊髓神经元有明显促迁移作用.结论 HGF对体外培养的脊髓神经元有保护和迁移作用.
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重组siRARγ腺病毒构建及其对小鼠肝脏祖细胞分化的影响
目的 构建并筛选小鼠RARγ基因的siRNA腺病毒载体,并探讨抑制RARγ表达对小鼠肝脏祖细胞分化的影响.方法 设计3对特异性针对小鼠RARγ基因的siRNA序列,体外退火形成双链,与SfiⅠ酶切后的pSES-HUS质粒连接,随后在BJ5183中与pAdEasy-1骨架质粒同源重组获得pAd-siRARγ重组腺病毒质粒,并在HEK293细胞中包装腺病毒Ad-siRARγ.腺病毒感染小鼠肝脏祖细胞HP14.5d,real-time PCR及Western blot检测RARγ的表达,1 μmol/L ATRA诱导肝细胞分化,ALB-Gluc活性及PAS染色检测肝脏细胞分化的状态.结果 PCR、酶切鉴定均证实siRNA正确克隆至腺病毒质粒中,测序结果与设计的siRNA序列一致.腺病毒在HEK293细胞中包装10 d可见红色荧光细胞的云雾状扩增,HP14.5d细胞的48 h腺病毒感染率为60％.其中,Ad-siRARγ2、3可有效抑制小鼠HP14.5d细胞中RARγ的表达(P＜0.05).ATRA可诱导肝细胞分化,ALB-Gluc活性及PAS染色阳性细胞明显高于对照组,Ad-siRARγ2,3可显著抑制ATRA诱导的小鼠HP14.5d细胞的ALB表达和糖原合成能力(P＜0.05).结论 成功构建并筛选出能有效抑制RARγ表达的siRNA腺病毒,感染小鼠肝脏祖细胞HP14.5d能显著抑制ATRA诱导的肝细胞成熟分化.
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表达Cre酶复制缺陷型重组腺病毒载体的构建及鉴定
目的构建Cre-loxP条件性基因敲除系统中Cre酶的重组腺病毒表达载体,作为体细胞条件性基因敲除的基础,并为传统ES细胞条件性基因敲除提供新的选择.方法用pAd-easy系统在大肠杆菌内经同源重组的方法构建Cre酶的复制缺陷型重组腺病毒载体;Western blot方法鉴定Cre蛋白的表达.结果在大肠杆菌内构建出重组腺病毒质粒,在包装细胞系内包装出重组病毒颗粒;测定病毒滴度为106pfu/L;重组病毒在细胞内表达Cre蛋白.结论表达Cre酶的重组腺病毒载体构建成功,阳性重组质粒的鉴定方法得以改进,为进一步的体细胞Cre-loxP条件性基因敲除提供了基础.
关键词： Cre重组酶 Cre-loxP条件性基因打靶 腺病毒载体 -
乙肝病毒X蛋白对人肝细胞内β-catenin定位及转录活性的影响
目的 研究HBx对Wnt/Wingless信号传导通路中主要信号分子β-catenin的影响,探讨HBV相关性HCC的发生机制.方法 Ad-HBx转染人肝细胞系L02细胞,免疫细胞化学和Luciferase检测细胞中β-catenin细胞定位及活性变化.结果 免疫细胞化学:转染苇组HBx腺病毒前L02细胞中β-catenin仅在细胞质有少量表达,转染后胞质表达明显增强,并出现胞核的大量积聚;Luciferase检测:实验组TOP荧光素酶活性与对照组及空白组相比明显增强,为阴性对照的11倍(P<0.05),Ad-HBx感染后24 h和36 h的TOP荧光素酶活性无显著差异.结论 Ad-HBx重组腺病毒在体外能有效转染人肝细胞系L02细胞,受感染细胞能有效表达HBx蛋白,HBx影响了人肝细胞系L02细胞中β-catenin的细胞定位及转录活性.
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ERK信号途径对EGF诱导的HaCaT细胞增殖具有双向调节作用
目的利用带有ERK-2基因的腺病毒载体感染成角质细胞系HaCaT,探讨ERK信号途径在EGF对HaCaT细胞增殖影响中的作用.方法用3H-TdR掺入法检测HaCaT细胞增殖及PD98059对EGF促HaCaT细胞增殖的影响.腺病毒载体转染HaCaT细胞,流式细胞仪检测转染率,Western blot检测ERK-2蛋白的表达.结果 1μg/L和10μg/L EGF可促进HaCaT细胞增殖,而100μg/L EGF促增殖作用反下降.PD98059抑制EGF引起的HaCaT细胞增殖,且具有浓度依赖性.腺病毒载体具有高转染率,感染Ad-ERK2的HaCaT细胞高表达ERK-2.EGF抑制转染的HaCaT细胞增殖.结论 ERK信号途径在EGF促HaCaT细胞增殖中具有双向调节作用.
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腺病毒介导的AIF及其突变体对K562细胞凋亡的影响
目的 构建凋亡诱导因子(Ad-AIF)及其突变体的重组腺病毒(Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF),观察其对白血病K562细胞凋亡的影响.方法 扩增AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF片段,分别克隆至pAd-Track-CMV-HA质粒中,经过PCR、双酶切和测序鉴定后,分别与pAd-Easy1质粒重组得到腺病毒质粒,经包装和扩增后得到腺病毒,以无外源序列的腺病毒作为空载腺病毒.Western blot验证重组腺病毒在K562细胞中的表达,免疫共沉淀检测AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF是否与HSP70相结合,Hoechst33258染色和流式细胞术检测AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF对K562细胞凋亡的影响.结果 重组腺病毒构建成功,能够在K562细胞中表达;AIF和DMLS-AIF与HSP70相结合,DHBD-AIF不结合HSP70;Ad-DHBD-AIF引起K562细胞染色质凝集,而Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF处理的K562细胞染色质分布均匀;Ad-DHBD-AIF引起K562细胞凋亡数明显高于Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF(P＜0.05).结论 成功构建了腺病毒Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF,其中Ad-DHBD-AIF对K562细胞的凋亡影响明显高于Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF,为K562细胞凋亡受阻的进一步研究奠定了基础.
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带有CMV、CEA误启动子的腺病毒载体介导TK基因在肿瘤细胞中的表达特性
TK基因-GCV系统是有希望在临床上用于肿瘤基因治疗的方法之一.为了提高基因靶向表达的效率,使之可以应用于体内实验,我们构建重组腺病毒AdCMVTK和带有CMV、CEA两个启动子的AdCMVCEATK,在五种癌细胞中进行了体外实验.发现腺病毒介导的TK基因赋予癌细胞GCV敏感性比对照组高2～3个数量级,并使感染病毒和未感染病毒细胞比例为1:10时仍产生较强的"旁观效应".实验表明PG肺癌,CAE结肠癌,HeLa细胞是腺病毒介导的TK基因的理想靶细胞.
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血管抑素K1-5腺病毒载体的构建及对人血管内皮细胞的抑制作用
目的 构建携带血管抑素的腺病毒载体,并探讨其对血管内皮细胞增殖及迁移的抑制作用.方法 采用基因重组技术,构建携带血管抑素K1-5的腺病毒载体,PCR鉴定,50%组织培养感染剂量法测定病毒滴度及氯化铯密度梯度离心法纯化病毒.直接感染台盼蓝染色排除法、MTT及体外趋化实验检测血管抑素K1-5对内皮细胞增殖及趋化的抑制作用.结果 经50%组织培养感染剂量法测定病毒滴度及氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,病毒滴度为1.5×109pfu/mL.扩增纯化后,病毒滴度达1.1×1010pfu/mL.实验表明,携带血管抑素K1-5的腺病毒能抑制血管内皮细胞增生,并对其具有杀伤力,且能使血管内皮细胞趋化能力减弱,抑制血管形成.结论 成功构建了携带血管抑素K1-5的腺病毒载体,血管抑素K1-5能明显抑制血管内皮细胞增殖及迁移,为进一步体内实验,研究对血管形成的抑制作用奠定了基础.
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利用腺病毒载体介导的RNA干扰技术在悬浮细胞中获得基因沉默效应
目的 利用重组腺病毒载体携带短发夹RNA (shRNA),使难于转染的悬浮细胞达到较高的目的基因沉默效率.方法 分别将含有人胎盘生长因子(PLGF)的干扰序列及阴性对照序列(scramble)连入pRNAT-H1.1/Adeno载体,获得重组穿梭质粒；将线性化的重组穿梭质粒与腺病毒骨架重组；将重组子转染HEK 293细胞,经过3轮病毒包装,收获病毒颗粒并测定滴度.病毒颗粒感染悬浮细胞——人小细胞肺癌细胞(NCI-H 250和NCI-H 209),通过实时定量PCR方法鉴定靶基因沉默效应,并利用肿瘤细胞重建基质膜侵袭实验进行功能鉴定.结果 成功构建带有靶基因干扰序列及scramble、空载体的3种腺病毒重组子(AD-shuttle-shPLGF、AD-shuttlescramble和AD-shuttle).经过HEK 293细胞包装,终获得3株病毒颗粒,病毒滴度分别为1.5×1011、1.6×1011和1.6×1011.NCI-H 250和NCI-H 209细胞感染腺病毒颗粒48 h后,大部分细胞表达GFP,感染率接近100％；且两株细胞感染AD-shuttle-shPLGF病毒48 h后,PLGF mRNA表达水平降低(P＜0.01),肿瘤细胞侵袭能力明显下降(P＜0.01).结论 携带shRNA的腺病毒表达载体可以代替电转、脂质体介导等方法,使难于转染细胞的目的基因达到有效沉默.
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腺病毒介导hTGF-β1基因体内转染兔椎间盘髓核细胞的表达
目的观察以腺病毒为载体的外源性治疗基因Ad/CMV-hTGF-β1转染兔椎间盘髓核细胞后的表达.方法采用本实验室构建的腺病毒载体基因Ad/CMV-hTGF-β1 20μl(6×106 pfu)注射于纯种成年新西兰大白兔腰椎间盘髓核内;手术后不同时间分别取出椎间盘,用免疫组织化学方法对椎间盘髓核细胞进行基因表达产物测定;用VIDAS图像分析系统进行半定量观察.结果免疫组织化学染色显示注射Ad/CMV-hTGF-β1椎间盘,4 d组可见髓核细胞内呈现阳性染色颗粒;1周组即显示强阳性染色,阳性表达持续至12周组.实验对照组及自身椎间盘对照组呈阴性或弱阳性反应.结论椎间盘髓核作为靶细胞能够被外源性基因转染;腺病毒载体基因Ad/CMV-hTGF-β1转染兔椎间盘髓核细胞后能在相当长时间内表达TGF-β1蛋白.
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腺病毒载体介导的人类B7.1基因修饰的肿瘤细胞疫苗
为了证明腺病毒载体可做为将B7基因导入肿瘤细胞的替代载体,达到提高肿瘤细胞疫苗效应的目的,且不存在逆转录病毒载体的局限性,用同源重组的方法构建了表达人类B7.1cDNA的重组人类5型腺病毒(AdB7.1),并用它感染小鼠乳腺癌细胞系EMF\-6和大鼠神经胶质瘤细胞系C6,检测B7.1基因在感染过的肿瘤细胞中的表达;用AdB7.1感染过的肿瘤细胞给同基因宿主(BALB/c小鼠和Wistar大鼠)接种,观察它们在体内的致瘤性及对肿瘤的防治作用;用51Cr-释放法对用各种肿瘤细胞免疫后3周的动物脾淋巴细胞进行CTLs杀伤活性的测定,来检测其细胞免疫活性.结果的Northern blot分析表明:AdB7.1感染过的肿瘤细胞表达了B7.1基因.接种/侵袭实验和CTLs杀伤活性的测定实验表明,与野生型肿瘤细胞相比,表达B7.1的肿瘤细胞在动物体内的致瘤性降低(P＜0.01),能诱导针对野生型肿瘤的高水平的系统性免疫应答和细胞毒T细胞活性,对肿瘤也有一定的防治作用.本研究的结论是,腺病毒载体可代替逆转录病毒载体将B7.1基因导入肿瘤细胞,提高肿瘤细胞疫苗的抗肿瘤作用.它操作简单,感染效率高,避免了使用逆转录病毒载体的局限性.
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胶原膜用于血管内基因投递的实验研究
目的 评价胶原膜上通过抗体结合腺病毒或质粒DNA作为基因投递载体的可行性及效果.方法 采用交联剂N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)将抗腺病毒或抗DNA抗体共价键结合在胶原膜上,通过这些抗体将腺病毒载体(Ad-GFP)和质粒DNA(pEGFP-C1)结合在膜上.采用同位素标记的质粒DNA(pDNA)在体外测定基因的释放,用细胞转染试验评价这种新型基因递送体系的功能.结果 通过SPDP交联剂成功地将抗体共价键连接在胶原膜上,并结合了表达绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒和质粒DNA.细胞实验发现胶原膜上有大量表达GFP的阳性细胞,而膜以外的区域则没有GFP阳性细胞,表明具有局部递送特征.偶联Ad-GFP的胶原膜大转染效率达到92.8%,而且在107～1010病毒粒子/mL范围内,转染效率呈正剂量相关性.偶联pEGFP-C1的胶原膜诱导的细胞转染效率约为21.8%,结合32P标记的pDNA的胶原膜体外基因释放持续13天以上.用胶原涂层的不锈钢血管支架进行了同样的试验,在细胞培养中支架表面有大量GFP阳性细胞,其他区域没有GFP阳性细胞.结论 胶原膜携带抗体偶联基因是一种新型的基因投递体系,可实现高效和局部定位的基因转染.
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抗体/腺病毒复合物为载体的基因定位递送
临床基因治疗方案中基因载体在疾病部位的靶向递送仍是急待解决的问题.本研究将腺病毒与一种生物素化的特异性抗腺病毒六邻体的多克隆IgG结合,固定于结合了亲和素的胶原蛋白膜上,成功获得腺病毒载体基因靶向定位递送体系.体外稳定性研究结果表明该体系中病毒载体可有效保持活性.通过这种特异性抗体偶联方式,将携带单纯疱疹胸苷激酶(HSVtk)编码基因片断的腺病毒结合在胶原膜上转染大鼠平滑肌细胞(A10),加入更昔洛韦(ganciclovir)后,只有生长在胶原膜上及膜邻近50μm内的细胞被杀死.在使用非特异性抗体的对照实验中,整个培养基范围内的细胞几乎全被杀死.以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因对猪的心肌进行转基因实验,结果显示注射特异性抗体偶联病毒的胶原凝胶比直接注射病毒悬液获得更高效的心室基因表达.所有研究结果表明,通过生物素和特异性抗体使病毒载体固定在胶原蛋白基质上,可达到有效的局部定位基因表达,避免向非病灶部位的扩散,是基因治疗中一种极具发展潜力的载体定位递送方法.
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重组腺病毒载体Ad5-hTRX-EGFP的构建及其表达
本研究旨在构建并制备人硫氧还蛋白(hTRX)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因腺病毒载体Ad-hTRX-EGFP,感染HEK293细胞,为基因治疗提供实验基础.设计含有Not Ⅰ和EcoR Ⅴ酶切位点的引物,PCR扩增hTRX,将扩增产物连接到带有EGFP标记的pDC316-mCMV穿梭质粒上,构建重组穿梭质粒pDC316-hTRX-EG-FP,利用Lipofectamine2000脂质体的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHG lox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-hTRX-EGFP共转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒pAd-hTRX-EGFP,并在其中包装扩增病毒,用氯化铯高速梯度离心、纯化病毒,测定病毒颗粒数及滴度.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用流式细胞仪测定感染HEK293细胞的效率,Western blot方法验证细胞表达hTRX蛋白.结果显示,重组腺病毒质粒经PCR和Not Ⅰ、EcoR Ⅴ酶切鉴定,证实含有hTRX基因,测序结果和设计片段的序列一致.重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达5.558 × 1010pfu/ml.病毒成功感染HEK293细胞,MOI=100时,感染效率达92.25％.经Western blot方法验证表明,感染后的HEK293细胞高表达hTRX蛋白.结论:应用细胞内同源重组方法成功构建了含hTRX基因的重组腺病毒载体,制备获得高滴度的病毒,能高效感染HEK293细胞并表达目的蛋白,为后续研究奠定了基础.
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腺病毒递送BMI-1shRNA
近年来发展了一些质粒载体介导shRNA的转录,然后在细胞酶的作用下加工成功能性的siRNAs.虽然这些载体较化学合成的siRNA有更多的优点.但仍存在相当多的缺点,如转染效率低和不能在体内使用.本研究建立一种没有上述缺点的腺病毒递送BmihRNAs系统,设计靶向人Bmi-1的载体.以pAdTrack CMV质粒为模板扩增CMV-GFP表达盒,从pGEIBMIhRNA质粒上酶切下U6-BMI-1 shRNA表达盒,克隆它们入穿梭质粒pShuttle中,然后与pAdEasy-1质粒基因重组产生腺病毒质粒pAd-BMIhRNA-CVM-GFP,转染293A包装细胞,收获病毒.病毒感染K562细胞后,在mRNA和蛋白水平上分别用Real Time-PCR和Westem blot检测BMI的表达水平.结果表明:成功构建了pGEIBMIhRNA腺病毒质粒并有效包装出病毒.感染BmihRNA腺病毒的K562细胞在mRNA和蛋白水平上均显著下调了Bmi-1的表达,而时照病毒没有明显的效果.结论:腺病毒是一种有效递送siRNA入哺乳动物细胞的载体.腺病毒递送siRNA载体可能成为siRNA药物的基因治疗载体.
