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HSV-sr39TK-GCv/ACV系统抑制小鼠异基因骨髓移植后移植物抗宿主病
目的 研究突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶一更昔洛韦/阿昔洛韦(HSV-sr39TK-GCV/ACV)系统对小鼠异基因骨髓移植后移植物抗宿主病(GVHD)的影响.方法 采用改良的磷酸钙沉淀法,以携带HSv-sr39TK基因的慢病毒感染C57BL/6小鼠的脾淋巴细胞.制得sr39TK+T淋巴细胞.以C57BL/6小鼠为供者,Balb/c小鼠为受者进行骨髓移植,受者移植前接受60>Coγ射线照射.实验分6组进行:(1)GCV组共30只小鼠,均于骨髓移植的同时输注sr39TK+T淋巴细胞.其中10只于骨髓移植当天至第6天腹腔注射GCV 0.5 mg/d,10只于骨髓移植后第7～13天腹腔注射GCV0.5 mg/d,10只于骨髓移植后第12～18天腹腔注射GCV 0.5 nag/d;(2)ACV组共30只小鼠,骨髓移植与sr9TK+T淋巴细胞输注同GCV组,其中10只于骨髓移植当天至第6天腹腔注射ACV 0.5mg/d,10只于骨髓移植后第7～13天腹腔注射ACV 0.5 mg/d,10只于骨髓移植后第12～18天腹腔注射ACV 0.5 mg/d;(3)移植对照组仅行骨髓移植;(4)脾细胞对照组行骨髓移植和脾淋巴细胞输注;(5)GCV对照组在脾细胞对照组的基础上于骨髓移植后第7～13天腹腔注射GCV 0.5 mg/d.(6)sr39TK对照组行骨髓移植和sr9TK+T淋巴细胞输注.观察各组受者的存活时间、GVHD的发生情况及程度.结果 GCV对照组、sr9TK对照组、睥细胞对照组和移植对照组小鼠均于骨髓移植后19 d内死亡.GCV组移植当天用药者、第7天用药者和第12天用药者的存活时间分别为(36.70±5.20)d、(40.30±4.69)d和(27.10±4.85)d.ACV组移植当天用药者、第7天用药者和第12天用药者的存活时间分别为(36.50±5.26)d、(46.20±3.61)d和(30.90±5.21)d.GCV组和ACV组受者的存活时间均长于4个对照组(P<0.01),GCV组和ACV组中第7天用药者的存活时间和5(1 d存活率优于其它各时间用药者,差异有统计学意义(P<0.05),而ACV组第7天用药者又明显优于GCV组第7天用药者(P<0.05).4个对照组小鼠移植后10～12 d均开始出现Ⅲ～Ⅳ级GVHD.GCV组和ACV组死亡小鼠可见Ⅱ～Ⅳ级GVHD.而该两组中长期存活受者仅有Ⅰ～Ⅱ级GVHD.结论 HSV-sr9TK-GCV/ACV系统对小鼠异基因骨髓移植后的GVHD有一定的抑制作用;ACV的效果优于GCV;移植后7 d时应用ACV的效果较佳.
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单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦系统联合化疗药物治疗前列腺癌
目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦(HSV-TK/GCV)系统联合几种临床常用的化疗药物对激素非依赖性人前列腺癌(HRPC)细胞PC-3m的杀伤效应.方法将HSV-TK基因导入PC-3m细胞,采用活细胞拒染法、四甲基偶氮唑盐酶反应比色法(MTT法)检测单独给予GCV(10 μmol/L)和顺铂(CDDP,10 μmol/L)、足叶乙甙(VP-16,10 μmol/L)、长春新碱(VCR,135 nmol/L)、氨甲喋呤(MTX,5 nmol/L)、5-氟尿嘧啶(5-Fu,1μmol/L)及苏拉明(100 μmol/L)等物质,以及GCV联合上述药物对PC-3m细胞的体外杀伤效应,并用流式细胞术(FCM)检测GCV联合5-Fu或苏拉明后细胞坏死和凋亡状况.结果 HSV-TK/GCV联合VP-16、VCR、5-Fu和苏拉明后杀伤PC-3m细胞的效应增强,联合CDDP后杀伤效应降低,联合MTX后则杀伤效应无明显改变.FCM检测显示,GCV联合5-Fu和苏拉明后72 h出现较大比例的细胞凋亡和细胞坏死,细胞凋亡比例分别为36.38%和35.51%,细胞坏死比例分别为33.05%和28.87%.结论 HSV-TK/GCV系统联合某些化疗药物后可对前列腺癌(Pca)细胞发挥协同的杀伤效应.
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CEA启动子启动双自杀基因CD/TK重组AdEasy XL腺病毒构建
目的构建含有CEA启动子(CEA promoter,Cp)启动的双自杀基因CD与TK的复制缺陷型腺病毒.方法设计带有限制性内切酶酶切序列的PCR引物.在2μl T4 DNA ligase作用下,Cp插入pAdTrack(pAT)的MCS,形成pAT.Cp;CD插入pAT.Cp的MCS,形成pAT.Cp.C;TK插入pAT.Cp.C的MCS,形成pAT.Cp.C.T.5 μg pAT.Cp.C.T经4 μl Pme Ⅰ线化后,转化BJ5183-AD-1,1μl PacⅠ酶切鉴定.重组AdEasy质粒转化XL10-Gold细胞,大量扩增提取纯化,转染5 × 105 AD-293细胞,荧光显微镜观察,制备带有Cp.C.T重组腺病毒(recombinant adenovirus with Cp.C.T,RA-Cp.C.T),测定病毒滴度.结果pAT.Cp,pAT.Cp.C,pAT.Cp.C.T双酶切以及PCR均见长约500 bp的Cp,1 300 bp的CD,1 100 bp的TK.对照质粒DNA转化BJ5183-AD-1效率为7.36×106 cfu/μg.线化pAT.Cp.C.T转化BJ5183-AD-1,形成重组AdEasy质粒DNA,Pac Ⅰ酶切见典型长约3.0或4.5kb与30.0kbDNA片断.重组质粒转染AD-293出现绿色荧光.RA-Cp.C.T滴度为5.67×107 pfu/ml.结论RA-Cp.C.T构建正确;AdEasy XL腺病毒载体系统转导Cp.C.T具有高效性,易于观察转染效果.
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腺病毒介导HSV-TK/CD基因对胆管癌体内体外的杀伤作用
目的研究HSV-TK/CD融合基因对胆管癌的杀伤作用.方法腺病毒介导HSV-TK/CD融合基因体外转染胆管癌细胞QBC939,与单自杀基因对照,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定肿瘤细胞生长抑制率,旁观者效应;构建胆管癌裸鼠模型,瘤内注射重组腺病毒,观察肿瘤生长情况.结果与单一自杀基因转染组对照,双基因组表现出更强的抗肿瘤作用.当给予相同浓度的前体药物时,融合基因组,CD组和TK组的肿瘤细胞存活率分别为3.1%、32.1%、55.2%.体内实验显示,融合基因组的肿瘤生长受到明显抑制,抑制率达70.7%.单自杀基因TK、CD组则分别为41.2%和55.7%,差异有统计学意义(P<0.05).组织学检查可见实验组肿瘤发生明显坏死,这种现象在融合基因治疗组尤为明显.结论与单自杀基因相比,HSV-TK/CD融合基因在体内和体外都具有更强的抗肿瘤活性.
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自杀基因治疗神经母细胞瘤的实验研究
目的探讨自杀基因疗法对神经母细胞瘤的作用,为临床应用打下基础. 方法利用含胸苷激酶基因(tk)与潮霉素磷酸转移酶基因(hy)的融合基因的真核表达载体及仅含hy的空载体,以脂质体为介导,将这两种质粒分别转染神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y.利用潮霉素药物敏感实验筛选SH-SY5Y,用不同浓度的丙氧鸟苷(GCV) 分别作用于SH-SY5Y、SH-SY5Y-hytk及SH-SY5Y-hy.结果利用潮霉素药物敏感实验筛选SH-SY5Y,12 d时SH-SY5Y全部死亡的低浓度为60 μg/ml,30 μm丙氧鸟苷可大限度杀死SH-SY5Y-hytk.杀伤效应为96 h死亡率＞80%.仅含有18%的SH-SY5Y-hytk就可使周围的20%的SH-SY5Y细胞死亡,总死亡率为38%.结论 60 μg/ml潮霉素是筛选SH-SY5Y-hytk及SH-SY5Y-hy阳性克隆的佳剂量.30 μM丙氧鸟苷是作用于SH-SY5Y-hytk的佳剂量.tk/GCV系统大于18% SH-SY5Y-hytk具有旁观者效应, 可极大地提高疗效.
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质量放大压电免疫传感器法测定人血清胸苷激酶的临床实验
目的 探讨将质量放大压电免疫传感器方法检测血清中胸苷激酶(TK)作为肿瘤临床诊断的可行性.方法 采用质量放大压电免疫传感器方法检测正常人、不同肿瘤患者血清.结果 肝癌血清的TK水平高(2.44±0.46)ng/ml,其次为乳腺癌(1.16±0.24)ng/ml,两者的TK水平均明显高于其他恶性肿瘤(P＜0.001).肺癌、胃肠恶性肿瘤、生殖系统恶性肿瘤以及其他恶性肿瘤血清问的TK水平接近,差异无统计学意义(P＞0.05),但与良性肿瘤之间的差异有统计学意义(P＜0.001).此外,良性肿瘤血清的频移值亦显著大于正常人血清(P＜0.001).结论 质量放大TK压电免疫传感器法作为一种简便灵敏hTK测定新方法,可用于临床肿瘤普查以及区分肿瘤类型,尤其是肝癌、乳腺癌临床的诊断.
关键词： 胸苷激酶 质量放大压电免疫传感器 临床诊断 -
KDR启动子介导胸苷激酶体外靶向杀伤血管内皮细胞
目的 构建含以KDR为启动子的HSV-tk重组腺病毒,体外评估其对血管内皮细胞的特异性杀伤效能.方法 采用pAdeasy系统,构建受KDR启动子或巨细胞病毒(CMV)启动子调控并可表达HSV-tk基因的AdKDR-tk和AdCMV-tk,在293细胞中包装、扩增后,体外分别感染表达KDR的人脐静脉血管内皮细胞系(HUVEC)和不表达KDR的肝癌细胞系HepG2,用丙氧鸟苷(GCV)处理受染细胞,并以MTT法检测其细胞增殖情况.结果 病毒滴度均为1×1010 pfu/mL.在感染复数(M0I)为100的条件下,当细胞培养液中加入的GCV浓度由0增至50 μg/mL时,感染含AdKDR-tk的HUVEC细胞和HepG2细胞其存活率由100%分别下降至(28.94±5.67)%和(75.45±2.91)%(P＜0.01),而感染含AdCMV-tk的HUVEC细胞和HepG2细胞其存活率分别下降至(17.56±2.48)%和(23.15±5.72)%(P＞0.05).结论 KDR启动子介导的HSV-tk具有特异性杀伤血管内皮细胞的作用.
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HSV1-TK基因重组腺相关病毒载体的构建及表达
目的:构建含单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶(HSV1-TK)基因的重组腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-TK,制备重组腺相关病毒rAAV2/HSV1-TK,并检测HSV1-TK基因在转染晶状体上皮细胞中的整合和表达,为后囊膜混浊的基因治疗奠定基础.方法:用基因重组技术构建含HSV1-TK基因的重组腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-TK,并通过PCR和酶切鉴定;将该质粒转染BHK-21细胞,经G418筛选出携带该质粒的载体细胞株BHK-21/TK,在辅助病毒的参与下包装成重组病毒rAAV2/HSV1-TK;用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法和高效液相色谱(HPLC)法检测重组病毒rAAV2/HSV1-TK的纯度,用斑点杂交法检测重组病毒的滴度;重组病毒rAAV2/HSV1-TK转染兔晶状体上皮细胞N/N1003A,用PCR和RT-PCR检测HSV1-TK基因的整合和表达.结果:经PCR和酶切鉴定重组质粒pSNAV2.0-TK构建成功;成功制备了重组病毒rAAV2/HSV1-TK,病毒滴度达1×1012v.g./mL;重组病毒转染N/N1003A细胞后,PCR和RT-PCR检测显示HSV1-TK基因在细胞中整合并且有效表达.结论:成功构建了含HSV1-TK基因的重组腺相关病毒载体质粒,制备了高滴度重组病毒rAAV2/HSV1-TK,HSV1-TK基因在转染该病毒的晶状体上皮细胞中可有效表达.
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恶性人脑胶质瘤的HSV-Tk/GCV自杀基因治疗系统的构建及应用研究
目的 构建恶性人脑胶质瘤细胞株TJ899的单纯疱疹病毒的胸腺激酶/丙氧鸟苷(HSV-Tk/GCV)自杀基因治疗系统,探讨该体系在脑胶质瘤治疗中的作用.方法 采用PCR、RT-PCR、融合PCR、酶切、连接等技术构建由自杀基因pcDNA3.1(-)CMVTK表达载体;用脂质体介导法将pCMVTK质粒转染进入TJ899恶性人脑胶质瘤细胞,并用MIT法检测感染后细胞对(GCV)的敏感性.结果 pCMVTK质粒经测序证实含有TK目的基因;脂质体介导Pcmvtk质粒成功转染了TJ899细胞,并在体外实验研究中显示很好的治疗效果.结论 建立了作用于恶性人脑胶质瘤细胞株TJ899的HSV-Tk/GCV自杀基因治疗系统,为脑胶质瘤的临床研究打下了基础.
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半乳糖基多聚赖氨酸携带HSV1-TK对HepG2细胞体外效应研究
目的 为肝癌的自杀基因治疗寻找新的靶向分子.方法 通过还原氨化法进行乳糖 (Lac)与聚赖氨酸(PLL)共价连接;经Sephadex G-10柱分离纯化;以苯酚-硫酸比色法测定n值;与真核表达质粒r-pAs16Dr按比例混匀,得到GlanPLL-r-pAs16Dr基因转移系统;分别转染不同的细胞株进行体外效应研究:人肝癌细胞株HepG2、人肺癌细胞株549,观察报告基因红色荧光蛋白能否在肝细胞中表达;RT-PCR检测HSV-tk基因的表达情况;观察给予不同浓度的更昔洛韦(GCV)后随时间延长细胞改变情况,用MTT法检测GCV对不同细胞的杀伤作用.结果 化学合成得到34个半乳糖基的PLL;转染后48 h在HepG2可见红色荧光蛋白表达,A549细胞未见红色荧光蛋白表达;RT-PCR证实HSV-tk仅在HepG2细胞中表达;体外杀伤实验显示:经GlanPLL-r-pAs16Dr基因转移系统处理的两种细胞对GCV表现出不同的敏感性.HepG2细胞对GCV很敏感,低浓度的GCV(1 mg/L)处理3 d,即可使细胞生长抑制率达到70.5%,A549对GCV不敏感.结论 半乳糖基多聚赖氨酸能够与ASGPR有效的结合,合成配体来源丰富、制备简单,适合于作为自杀基因HSV-tk肝靶向运送的导向配体.
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单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因治疗肿瘤机制研究进展
1 HSV1-TK基因定义、分子结构 HSV1-TK基因即单纯疱疹病毒I型胸腺嘧啶核苷激酶基因（herpes simplex virus-I type thymidine kinase gene,HSV1-TK ),早在1979年就有人克隆了HSV1-TK基因序列［1］ ，基因 转录部分约1 300个核苷酸，蛋白质编码区长为1 128个核苷酸，编码376个密码子，基因中 没有内含子，其转录起始部（mRNA5'端）有107个核苷酸的非翻译区。
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胸苷激酶1在白血病患者化疗过程中的临床意义探讨
目的 利用免疫印迹增强化学发光法检测白血病患者化疗过程中血清胸苷激酶1(sTK1)水平,分析sTK1在评估白血病患者治疗效果以及时治疗方案的指导价值. 方法 分别对22例血肿瘤治疗未缓解患者,20例治疗部分缓解患者,8例治疗完全缓解患者和29例健康人sTK1水平进行测定. 结果 未缓解组sTK1平均水平为(4.10±1.32)pmol/L,部分缓解组sTK1平均水平为(1.73±0.54)pmol/L,完全缓解组sTK1平均水平为(0.96±0.45)pmol/L,健康人对照组为(O.79±0.47)pmol/L.治疗未缓解患者组sTK1平均水平与完全缓解及部分缓解组有显著差异(P<0.01,P<0.01),且明显高于健康人组.完全缓解组肿瘤患者sTK1水平与健康对照组sTK1水平相差不大(P>0.05). 结论 sTK1的含量可用于血液肿瘤化疗效果的评估,以及指导临床进行化疗方案的调整.
关键词： 胸苷激酶 细胞增殖标志物 免疫印迹增强化学发光法 -
双自杀基因HSV-tk/CD对胆管癌体内体外旁观者效应的研究
目的研究双自杀基因HSV-tk/CD的体内外旁观者效应.方法在体外将tk/CD阳性的胆管癌QBC939细胞与亲本细胞按不同的比例混合,并与单自杀基因组对照,观察给予前体药物后对混合细胞的生长抑制情况.建立荷瘤裸鼠模型,在瘤体内注入不同数量的tk/CD阳性胆管癌细胞,观察给予前药后的旁观者效应.结果融合基因组在体外产生明显强于单基因组的BSE,tk组的BSE出现较晚,阳性细胞的比例需达到40%,而CD组和融合基因组中,阳性细胞仅占20%时,就可观察到明显的BSE.体内实验也观察到BSE,强度与注入阳性细胞数有关(P＜0.05);本研究没有观察到"远处旁观者效应".结论腺病毒介导的双自杀基因HSV-tk/CD在体外和体内均可产生旁观者效应.
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9L-rIL12-TK大鼠胶质瘤基因免疫疫苗的安全可控性体内实验研究
目的 评估9L-rIL12-TK脑胶质瘤基因免疫活细胞疫苗在体内的安全可控性.方法 将40只裸鼠随机分成3组,分别于右侧腋部皮下接种9L-rIL12-TK细胞(n=14)、9L-TK细胞(n=14)和9L细胞(n=12),7 d后将各组裸鼠分成两、匝组,实验组(n=8,8,6)给予更昔洛韦(GCV)干预实验,对照组(均n=6)给予生理盐水注射,连续7 d;观察裸鼠瘤体生长情况和生存时间,60 d后取瘤结节及全身脏器行组织学检查(苏木精-伊红染色).结果 [1]给予GCV干预后7 d,9L-rIL12-TK实验组及9L-TK实验组裸鼠瘤体平均体积较相应对照组及9L组显著性缩小(均JP＜0.05).60 d时,8只9L-rIL12-TK实验组裸鼠瘤体均完全消退,且均无复发;8只9L-TK实验组裸鼠中,瘤体完全消退3只,瘤体缩小后再次增大5只;余亚组瘤体均呈增大趋势.[2]GCV干预后.9L-rIL12-TK实验组和9L-TK实验组与相应对照组比较,生存时间明显延长(P＜0.05).[3]9L-rIL12-TK实验组和9L-TK实验组无瘤裸鼠接种部位无异型性肿瘤细胞,余裸鼠瘤体内均见异型性肿瘤细胞;所有裸鼠相关脏器病理学检查均未见肿瘤远处转移征象.结论 9L-rIL12-TK大鼠胶质瘤细胞基因免疫疫苗在裸鼠体内可得到安全有效的控制,使制备免疫原性强且安全有效的胶质瘤基因免疫活细胞疫苗策略成为可能;其基因免疫治疗效应有待进一步研究.
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胸苷激酶基因治疗恶性肿瘤的研究进展
胸苷激酶基因(thymidine kinase gene)即药物敏感基因(drug sensitive gene),是近年来研究较多的基因之一.胸苷激酶基因转染肿瘤细胞后,通过产生胸苷激酶提高肿瘤细胞对药物的敏感性而使肿瘤细胞自杀死亡.因为胸苷激酶基因编码的酶类,催化对真核细胞无毒或低毒的药物,使无活性的药物前体转变为具有抑制核酸合成的抗代谢药物,阻止肿瘤细胞DNA合成,选择性地杀死快速增殖的肿瘤细胞.这样不但可大幅度地降低药物剂量,而且不对正常的组织细胞产生毒副作用或毒副作用极小,更为重要的是周围未转染的肿瘤细胞因为受到细胞毒性杀死作用引起旁观者效应也自杀死亡,从而大大提高了自杀效率.由于胸苷激酶基因疗法特有的旁观者效应,在一定程度上弥补了靶基因载体转染率不高的问题,提高了抗肿瘤效果,显示出良好的应用前景及发展潜力,所以在1998年世界肿瘤会议上,胸苷激酶基因治疗肿瘤被当选为治疗肿瘤中有前途和希望的方法.目前胸苷激酶基因治疗肿瘤的研究已成为肿瘤基因治疗的热点[1～4],有鉴于此,本文对胸苷激酶基因治疗恶性肿瘤的研究进展综述如下.
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单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对人结肠癌 细胞动物致瘤能力的影响
本研究用携带单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV-tk)基因的重组逆转录病毒感染结肠细胞系 SW480，观察 HSV-tk/GCV(丙氧鸟苷 )系统对结肠癌细胞的体内外抑制作用。 1 材料与方法 1.1 材料 分子生物学试剂为市售进口产品， pIC19R/MC1-TK质粒由美国匹兹堡大学 Huang L.教授惠赠，内含 1.7kb的 HSV-tk cDNA片段。 1.2 方法 1.2.1 质粒构建：将 HSV-tk cDNA克隆入 pBluescript质粒并测序。将 tk基因定向克隆入逆转录病毒载体 pDOR-neo中，构建 pDORtk质粒并酶切鉴定 [1]。 1.2.2 病毒包装及转染：用 Lipofect AMINE将 pDORtk转入 PA317包装细胞，经 G418筛选获得稳定表达株 PA317/tk。取其细胞上清液感染 SW480细胞，用 G418(800 μ g/ml)筛选获得抗性细胞克隆 SW480/tk。 1.2.3 斑点杂交 (dot blot)实验：分别提取 SW480/tk和野生型 SW480细胞基因组 DNA和细胞总 RNA，用 HSV-tk cDNA双链探针，分别行细胞基因组 DNA及细胞总 RNA斑点杂交。
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抗病毒药物这几十年
20世纪70年代末期,研究发现开环核苷类似物,尤其是阿昔洛韦,能够抑制单纯疱疹病毒(HSV)的DNA复制,而且发挥作用的浓度远低于其影响细胞DNA合成的浓度,由此开创了抗病毒药物治疗的一个新时代.为什么阿昔洛韦能够特异性地被HSV编码的胸苷激酶活化?虽然答案还不得而知,但是却由此开拓出了一条通过病毒酶开发抗病毒药物的道路.之后,研究证明了阿昔洛韦对HSV-1和HSV-2感染的疗效.
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腺病毒介导融合双自杀基因治疗膀胱癌
目的探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对膀胱癌治疗作用并与单基因系统作比较.方法利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒作载体,PCR检测CD、TK及E1基因.建立C57BL/6同系膀胱癌Mb49皮下移植瘤模型,观察肿瘤注射腺病毒联合丙氧鸟苷(GCV)或/和5-氟胞嘧啶(5-FC)治疗后肿瘤体积及组织学变化.结果PCR可检测到腺病毒DNA中含CD及TK基因、无E1基因.腺病毒注射联合GCV、5-FC、GCV+5-FC治疗后,肿瘤体积与对照组相比明显缩小(P=0.00),腺病毒注射联合GCV+5-FC有协同作用(P=0.04),优于腺病毒注射联合GCV以及腺病毒注射5-FC.基因治疗后肿瘤细胞大片坏死,对照组细胞形态无变化.结论腺病毒介导CD-TK融合双自杀基因联合GCV或/和5-FC能有效治疗膀胱癌,融合双自杀基因CD-TK/(GCV+5-FC)系统对膀胱癌治疗有协同作用,其效果优于CD-TK/GCV或CD-TK/5-FC系统.
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HSV1-TK逆转录病毒载体构建及表达
目的构建含TK基因逆转录病毒载体并检测其在转染细胞中的表达,为肺癌基因治疗积累实验资料.方法从PHSV106质粒中切下约2.4kb TK基因片段,插入逆转录病毒载体PLXSN多克隆位点,酶切筛选正、反向连接质粒.正向连接子电穿孔法转化肺癌细胞A549,用PCR、细胞原位杂交法分别检测TK基因整合和表达.结果经酶切鉴定得到正向连接子,电穿孔法转导A549细胞,经G418筛选出了转基因细胞,TK基因已整合在转染细胞中并阳性表达.结论成功构建了含TK基因逆转录病毒载体,转导该载体的肺癌细胞可表达TK基因.
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Epstein-Barr病毒胸苷激酶（TK）基因表达质粒的构建
目的：构建高效表达EBVTK的重组克隆体系。方法：以pUC8X为模板，5’-CTGAATTCATGGCTGGATTTCC-3’及5’CAACTGCAGCCTAGTCCCGATT-3’为引物，用PCR技术扩增出EBV tk基因的DNA片段。EcoR I／Pst I 双酶切PCR产物和载体pBV220，T4连接酶使目的基因tk定向克隆至选定质粒pBV220中。结果：重组质粒pBV220-tk经EcoR I／Pst I双酶切后得两条电泳带分别位于1．8 kb、3．6 kb处；以pBV220-tk为模板，两引物同上进行PCR扩增，产物电泳带于1．8 kb处。结论：目的基因tk已定向克隆至质粒pBV220中
