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AFP启动子与胸苷激酶基因治疗肝癌的实验研究
目的:探讨AFP启动子与胸苷激酶疗法对肝癌的作用.方法:采用含tk基因与潮霉素磷酸转移酶hy基因融合基因的真核表达载体及仅含潮霉素磷酸转移酶hy的空载体,以脂质体为介导,将这两种质粒分别转染肝癌细胞系HEPG2.潮霉素 B药物敏感实验筛选HEPG2,不同浓度丙氧鸟苷分别作用于 HEPG2,HEPG2-AFP-hytk 及 HEPG2-hy.结果:潮霉素B药物敏感实验筛选HEPG2,12天时HEPG2全部死亡的低浓度为60μg/ml,30μmol/L丙氧鸟苷可大限度杀死HEPG2-AFP-hytk.杀伤效应随时间而增强,作用24小时后开始出现毒性作用,至96小时死亡率>80%.仅含有18%的HEPG2-AFP-hytk 就可使周围20% 的HEPG2细胞死亡,总死亡率为38%.结论:60μg /ml潮霉素是筛选 HEPG2-AFP-hytk及 HEPG2-hy 阳性克隆的佳剂量.30μmol/L 丙氧鸟苷是作用于HEPG2-AFP-hytk的佳剂量.HSV-tk/GCV系统大于18%HEPG2-AFP-hytk开始具有旁观者效应,可提高疗效.
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子宫内膜癌患者血清TK1检测的临床意义
目的:探讨血清细胞质胸苷激酶1(TK1)检测在子宫内膜癌诊治中的临床价值.方法:利用免疫印迹增强化学发光法(ECLA)检测154例子宫内膜癌患者血清TK1的含量,同时检测130例子宫内膜良性疾病和121名健康人血清中的TK1含量.结果:子宫内膜癌患者TK1水平[3.14(1.87-3.95)pmol/L]显著高于子宫内膜良性疾病组[1.31(0.95-1.63)pmol/L]和正常对照组[1.24(0.62-1.49)pmol/L] (P＜0.01);而子宫内膜良性疾病组和正常对照组之间差异无统计学意义(P＞0.05).154例子宫内膜癌患者手术后血清TK1水平明显下降.子 宫内膜癌患者血清TK1阳性率(61.7%)远高于其他生殖道肿瘤标 志物[癌胚抗原(CEA)(15.6%)]、糖抗原[CA199(14.5%),CA125(17.9%)].结论:血清TK1检测在子宫内膜癌诊断、预后判断、疗效监测等方面具有一定的临床应用价值.
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血清胃癌相关抗原联合胸苷激酶检测在胃癌诊断中的临床价值
目的：评价血清胃癌相关抗原（MG7- Ag）联合胸苷激酶（TK1）检测对胃癌患者的临床诊断价值。方法：选取2011年9月-2013年7月期间在青岛市城阳区人民医院就诊的胃病患者130例和健康查体者30例，分别检测 MG7- Ag 和 TK1在各受试者血清中的水平。结果：胃癌组血清 MG7- Ag 和 TK1含量及阳性检出率均明显高于健康对照组和胃良性病变组（P ﹤0.01），二者联合检测阳性率高为75.0%。结论：血清MG7- Ag 和 TK1的联合检测对胃癌的诊断具有极高的临床价值。
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自杀基因系统HSV1-TK/GCV对MEC-1细胞的体外杀伤及诱导凋亡作用
目的:探讨HSV-TK/GCV系统对MEC-1细胞的体外作用.方法: 用脂质体介导将含有HSV1-TK 全长cDNA的真核表达质粒G1NATK转染人黏液表皮样癌细胞系MEC-1,经G418筛选,挑选阳性克隆,用PCR及RT-PCR检测目的基因的整合及mRNA转录;分别用MTT及细胞记数法检测TK阳性细胞对GCV的体外敏感性及旁观者效应;用倒置显微镜、HE染色、活细胞荧光染色及TUNNEL染色观察GCV作用下MEC-1/TK的形态学变化.结果: PCR及RT-PCR分别从G418阳性克隆中成功扩增出404 bp 的特异性基因片段,将此G418抗性克隆命名为MEC-1/TK;IC50MEC-1/TK为0.7 μg/ml, 而MEC-1为1 000 μg/ml以上;当将TK阳性细胞和TK阴性细胞以不同比例混合,TK阳性细胞只占10%时,即有90%的细胞被杀死;形态学观察表明,经GCV作用,MEC-1/TK细胞变圆、脱壁、漂浮,部分细胞呈现核浓缩、核碎裂等特征,TUNNEL染色核阳性着色细胞明显增多.结论: HSV-TK/GCV系统在体外能明显杀伤MEC-1细胞,对GCV的敏感性比未转染的亲本细胞提高1 000倍以上,并显示较强的旁观者效应;GCV可诱导部分MEC-1/TK细胞发生凋亡.
关键词： HSV-单纯疱疹病毒属 胸苷激酶 更昔洛韦 基因疗法 人黏液表皮样癌细胞系 旁观者效应 -
HSV-TK基因和几IL-12基因治疗裸鼠鼻咽癌的实验研究
目的:研究腺病毒介导的KDR启动子-单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)系统(AdKDR-tk)联合白细胞介素12基因对裸鼠鼻咽癌的治疗作用.方法:建立鼻咽癌裸鼠模型,将36只成瘤鼠随机分成IL-12基因组、AdKDR-tk/GCV组、IL-12基因+AdKDR-TK/GCV组和生理盐水/GCV组(对照组),每组9只.采用瘤内注射分别给予相对应的重组腺病毒液及生理盐水,24 h后重复注射1次.次日起连续10 d每天ipGCV 1次,100 mg/kg.治疗结束后处死裸鼠,检测肿瘤质量、组织形态学变化及肿瘤微血管密度.结果:IL-12基因组裸鼠鼻咽癌瘤体质量(1.82±0.78)g及肿瘤微血管密度(15.54±3.46)个/mm3和AdKDR-tk/GCV组[分别为(1.61±0.61)g,(10.69±4.12)个/mm3与IL-12基因+AdKDR-TK/GCV组[分别为(1.04±0.52)g,(6.53±1.61)个/mm3]相比差异有显著性(P<0.05);IL-12基因组,AdKDR-tk/GCV组及IL-12基因+AdKDR-TK/GCV组与生理盐水/GCV组[分别为(2.52±1.18)g,(22.78 ±5.12)个/mm3]比较也存在显著差异(P<0.05).结论:HSV-TK基因和IL-12基因治疗可抑制裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤的生长,提高机体的抗肿瘤免疫应答,两者联合运用可产生协同效应,为鼻咽癌的治疗提供新的方法.
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腺病毒介导KDR启动子的胸苷激酶基因对血管内皮细胞的靶向杀伤作用
目的: 体外实验评估腺病毒介导KDR启动子-胸苷激酶系统(HSV-tk)杀伤血管内皮细胞的作用. 方法:采用新型AdEasy系统,构建受KDR启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子调控并可表达HSV-tk基因的AdKDR-tk和AdCMV-tk,在293细胞中包装、扩增后,体外分别感染表达KDR的人脐静脉血管内皮细胞株(HUVEC)和不表达KDR的人鼻咽癌细胞株CNE-2,用丙氧鸟苷(GCV)处理受染细胞,并以MTT法检测其细胞增殖情况. 结果:病毒滴度均为1×1013 pfu/L. 在感染复数(MOI)为100的条件下,GCV浓度由0增至50 mg/L时感染含AdKDR-tk的HUVEC细胞和CNE-2细胞存活率从(89.4±4.6)%和(91.5±4.4)%分别下降至(22.9±4.7)%和(71.4±2.9)%(P＜0.01),而感染AdCMV-tk的HUVEC细胞和CNE-2细胞存活率从(89.9±6.2)%和(90.8±5.7)%分别下降至(12.8±2.6 )%和(18.8±6.1)%(P＞0.05). 结论:腺病毒介导KDR启动子-胸苷激酶系统具有特异性杀伤血管内皮细胞作用.
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HSV-tk/GCV系统对高转移性粘液表皮样癌细胞系M3SP2的抑制作用
目的: 探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)/丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统对高转移性粘液表皮样癌细胞系M3SP2的作用.方法: 采用阳离子脂质体介导法将含HSV-tk基因复制缺陷型逆转录病毒载体(pBabe/tk)导入M3SP2细胞,嘌呤霉素筛选抗性克隆.用MTT比色法测定HSV-tk/GCV对tk阳性M3SP2细胞(M3SP2/tk)生长的影响及旁观者效应;用流式细胞术分析HSV-tk/GCV对M3SP2/tk细胞周期的影响.结果: M3SP2/tk细胞对GCV的敏感性显著增加,细胞生长受到抑制,在GCV(0.1～1000 mg *L-1)作用6 d时,M3SP2/tk细胞存活率为62.3%-14.5%, IC50值为0.68 mg*L-1,而转空载体细胞和亲本细胞IC50值大于1000 mg*L-1.M3SP2/tk细胞在GCV(1～10 mg *L-1)作用48 h 时,明显阻滞于S期.10% tk阳性的M3SP2/tk细胞与90% tk阴性的亲本细胞M3SP2混合培养, 10 mg*L-1的GCV仍可杀伤54.4%的细胞.M3SP2/tk细胞含GCV (1, 10 mg *L-1)培养上清液仍能影响tk阴性的舌癌细胞系TbpTL的生长.结论: HSV-tk/GCV具有显著抑制涎腺粘液表皮样癌细胞体外生长的作用,其作用机制与细胞周期进程停滞和旁观者效应有关.
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腺病毒介导KDR启动子的胸苷激酶基因治疗小鼠人鼻咽癌模型
目的: 研究腺病毒介导的KDR启动子-单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)系统(AdKDR- tk)结合丙氧鸟苷(GCV)对裸鼠人鼻咽癌的治疗作用. 方法: 建立人鼻咽癌裸鼠模型, 将36只成瘤鼠随机分成AdKDR-tk/GCV组、AdCMV-tk/GCV组和生理盐水/GCV组,每组12只. 采用瘤内注射分别给予重组腺病毒及生理盐水,24 h后重复注射1次. 次日起连续10 d每日ip GCV 1次,100 mg/kg. 治疗结束后处死裸鼠,检测肿瘤质量、组织形态学变化及肿瘤微血管密度. 结果: AdCMV-tk/ GCV组裸鼠鼻咽癌瘤体质量(1.81±0.84)g及肿瘤微血管密度(11.54±1.56)个/mm3、AdKDR-tk/ GCV组[分别为(1.48±0.88)g,(9.87±2.18)个/mm3]与生理盐水/GCV组[分别为(2.53±1.21)g,(17.78±2.12)个/mm3]相比差异有显著性 (P<0.05). AdCMV-tk/ GCV组与AdKDR-tk/ GCV组比较也存在显著差异(P<0.05). 结论: 癌灶内注射AdKDR-tk对裸鼠人鼻咽癌生长具有明显抑制作用,为鼻咽癌的治疗提供新的方法.
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TK/GCV、CD/5-Fc双自杀基因系统治疗结肠癌的实验研究
目的 观察胸苷激酶/丙氧鸟苷(TK/GCV)、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-Fc)双自杀基因系统对结肠癌的治疗效果,并结合研究结果进行作用机理的分析.方法 采用培养细胞移植法,将人结肠癌细胞系SW480接种于裸鼠背部皮下,建立裸鼠人结肠癌移植瘤模型.将32只裸鼠随机分为4组:空白对照组,TK/GCV治疗组,CD/5-Fc治疗组,TK/GCV+CD/5-Fc联合治疗组,每组8只.TK/GCV+CD/5-Fc采用逆转录病毒介导,采用瘤体内直接注射法,同时腹腔注射GCV、5-Fc治疗,观察各组小鼠的生存状况及肿瘤体积、瘤重、肿瘤生长抑制率、常规病理、生存期等指标,比较观察各治疗组的治疗效果及对荷瘤裸鼠存活的影响.结果 各治疗组裸鼠人结肠癌移植瘤的生长均受到显著抑制,治疗后各组体积数增加(P＜0.05),治疗组裸鼠存活期显著延长,TK/GCV+CD/5-Fc联合治疗组效果好,疗效q值=1.675＞1.15,即TK/GCV、CD/5-Fc有交互协同作用.结论 TK/GCV与CD/5-Fc对人结肠癌SW480细胞有明显抑制作用,TK/GCV、CD/5-Fc双自杀基因系统效果更强.
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重组腺病毒介导疱疹病毒胸苷激酶基因在昆明小鼠体内分布行为研究
目的:开展重组腺病毒-胸苷激酶基因制剂(adenovirus-mediated delivery of herpes simplex virus thymidine kinase gene,ADV-tk)局部或静脉用药后于动物体内的分布行为的研究.方法:分别采用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和原位杂交法检测分析重组腺病毒及胸苷激酶于肝脏、脾脏、淋巴结、肠系膜、肾上腺、胸腺、肾脏、甲状腺、前列腺、卵巢等组织分布的情况.结果判断采用免疫组织化学评分法(immuno-histochemical scores,IHS),并结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱2个方面进行评价.结果:(1)3种不同给药途径的组织分布特征具有相似性,ADV或tk阳性表达的组织脏器从强到弱分布依次为:肝脏、脾脏、淋巴结、肠系膜、肾上腺、胸腺、肾脏、甲状腺、前列腺、卵巢.ADV或tk mRNA的丰度具有一致性.但不同给药途径在组织分布丰度上有明显区别,由强至弱分别为:局部注射＞腹腔注射＞静脉注射,在组织分布特征上具有一致性.(2)小鼠腹腔注射后,ADV及tk的各组织分布动态变化上具有一致性,腹腔注射后1 d ADV及tk即具有高表达,7d表达强,14 d下降60％左右,21 d残留20％左右,32 d基本消失.(3)随着ADV-GFP给药剂量的增强,ADV的组织分布表现为剂量依赖性逐步增强.剂量为病毒颗粒数每1 kg为6.7×108时,ADV主要分布于肝脏、脾脏、淋巴结和肠系膜,分布较低.当剂量达到病毒颗粒数每1 kg为6×109时,ADV在10个器官的分布以肝脏、脾脏、淋巴结、肠系膜和肾上腺分布增加为明显.当剂量增加到病毒颗粒数每1 kg为1×1012时,ADV在10个器官的分布继续增加;在病毒颗粒数每1 kg为1×1013的大剂量病毒剂量情况下,肝脏的转染效率增加不太显著,但在其他阳性器官的分布增加.结论:本实验提示,采用每周用药1次,病毒颗粒数每1 kg为1×1012,局部或局部血管用药的给药方案可以得到肝脏有效转染强度,有望为今后指导制定临床的佳给药方案提供借鉴与参考.
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TK基因在垂体腺瘤治疗中的作用
目的 探讨胸苷激酶(TK)基因在垂体腺瘤治疗中的作用及其机制.方法 应用免疫印迹法,检测AdGHTK质粒转染GH3细胞后TK基因的表达情况;使用非放射性细胞增殖检测法,测定不同感染复数(MOI)AdGHTK转染后的GH3细胞对更昔洛韦的敏感性;将转染AdGHTK的GH3细胞和未转染细胞以不同比例混合,观察旁观者效应.结果 TK基因可转染入GH3细胞并成功表达;即使在低MOI下,转染组细胞成活率也随更昔洛韦浓度的增加而降低;存在旁观者效应.结论 将TK基因导入GH3细胞并经更昔洛韦处理,可明显降低肿瘤细胞存活率,为垂体腺瘤的治疗提供了可靠的理论依据.
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血清MG7-Ag联合TK1在胃癌诊断的临床价值
目的 探讨血清胃癌相关抗原MG7-Ag和胸苷激酶TK1联合检测对胃癌患者的临床诊断价值.方法 分别检测60例胃癌患者(胃癌组)、35例胃良性疾病患者(胃良性疾病组)及30例健康对照者(健康对照组)血清MG7-Ag和TK1水平.结果 胃癌组患者血清MG7-Ag和TK1含量分别高于健康对照组及胃良性疾病变组(均P<0.05);胃癌组MG7-Ag、TK1阳性检出率均明显高于胃良性疾病组及健康对照组(均P<0.05);血清MG7-Ag和TK1两项联合检测的敏感性、准确性均高于两项指标单独检测(均P<0.05).结论 血清MG7-Ag、TK1对胃癌具有较高的诊断价值,两者联合检测有助于提高胃癌诊断的敏感性和准确性.
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CD、TK双自杀基因对消化道肿瘤细胞的体外抑制作用
目的用粘粒法构建含有胞嘧啶脱氨酶(CD)、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)双自杀基因的腺病毒载体,检测双自杀基因对不同消化道恶性肿瘤细胞的体外抑制作用.方法利用重组腺病毒载体介导的CD、HSV-tk融合基因感染人结肠腺癌细胞系LoVo、胃癌细胞系SGC-7901、肝癌细胞系BEL-7402,通过MTT法测定细胞存活率,通过细胞集落形成实验分析GCV(丙氧鸟苷)、5-FC(5-氟胞嘧啶)双前药(double prodrugs)对肿瘤细胞的杀伤作用和旁观者效应的大小.结果 Western Blot检测分析融合基因的表达,显示重组腺病毒介导的双自杀基因可以在3种肿瘤细胞中高效表达.使用前药GCV和5-FC后,各组肿瘤细胞的集落形成和细胞存活率显著低于对照组.感染细胞在混合细胞中比例较低时,就能获得明显的旁观者效应.联合两种前药能获得大的细胞抑制作用,并且CD/5-FC系统对于消化道肿瘤细胞的杀伤作用强于HSV-tk/GCV系统.结论 CD、TK融合基因联合双前药治疗对消化道肿瘤有显著的体外抑制作用.
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伊马替尼—糖尿病患者的福音?
伊马替尼,通用名甲磺酸伊马替尼,属于小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI),它竞争性抑制三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)与胸苷激酶(thymidine kinase,TK)受体如Kit的结合位点,阻滞TK磷酸化,从而抑制信号传导,抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡.越来越多的证据表明伊马替尼不仅可以用于治疗慢性粒细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)、胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)等疾病,还可以通过抵抗胰岛β细胞凋亡、促进胰岛素的产生以及提高机体对胰岛素敏感性等途径改善糖尿病患者的治疗疗效及预后.
