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结核病DNA疫苗的研究进展
结核病是由结核分枝杆菌感染引起的世界性传染病.我国是世界上结核病发病率高的22个国家之一,结核病患病人数仅次于印度,位居第二.卡介苗是目前唯一应用于结核的预防性疫苗,但对于成人肺结核的保护效力十分有限,再加上自身的不足以及外界因素的变化,研制新型的结核疫苗迫在眉睫.该文将对结核病传统和新型的单价DNA疫苗的研究进展进行综述.
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疫苗的研究与应用
疫苗研制技术的飞速发展在人类预防多种传染性疾病方面发挥了至关重要的作用.经历了传统疫苗和新型疫苗两个阶段.随着生物技术在生物医药领域中的不断深化和发展,相信疫苗的应用前景会越来越广泛.
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抗肿瘤DNA疫苗的构建及其免疫效果的研究
抗肿瘤DNA疫苗是一种全新的肿瘤疫苗,在肿瘤防治中发挥越来越重要的作用.本文就抗肿瘤DNA疫苗的构建,影响其免疫效果的因素及安全性等问题做简单的概述.
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小鼠对结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫反应
目的 研究结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫原性.方法 将40只BALB/c小鼠随机分成4组,NS组、BCG组、pcDNA-HspX组和pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX组,每组10只.BCG组只在0周时皮内注射卡介苗1次.NS组、pcDNA-HspX组及融合基因组分别于0、2、4周肌肉注射生理盐水和重组质粒DNA,共免疫3次.在免疫的第2周,4周及后一次免疫后2周检测体血清中的总IgG水平.同时,后一次免疫后2周,取脾细胞检测细胞免疫反应.结果 构建的融合基因重组质粒DNA免疫动物后能产生针对结核杆菌特定抗原的特异性细胞免疫和体液免疫应答,具有较强的免疫原性.结论 结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因可作为DNA疫苗进行保护作用的研究.
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人乳头瘤病毒16型E6E7基因协同共激活分子B7-1基因免疫诱导的特异性免疫反应
目的利用突变修饰后的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(humsan papillomavirus type 16,HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7),研究治疗HPV16感染相关疾病的DNA疫苗,并进一步探索利用共激活分子B7-1基因,研究更加活化细胞免疫的加强疫苗.方法将用PCR法扩增获得fmE6E7基因插入真核表达质粒pVR1012中获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光组织化学法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠肌肉内进行pVR1012-fmE6E7单独免疫,或与小鼠共激活分子B7-1基因真核表达质粒(pcDNA3.1-B7-1)联合免疫.51Cr释放法分析免疫小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)活性,间接ELISA法检测小鼠血清中E7特异性抗体.用5×105个C3细胞皮下接种C57BL/6小鼠,分析小鼠体内诱发的特异性抗瘤免疫水平.结果修饰后的E6E7基因免疫可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,小鼠B7-1基因与fmE6E7联合免疫可显著提高特异性CTL活性,并可保护33%(2/6)的小鼠免受C3肿瘤细胞的攻击,而单独fmE6E7基因免疫则不能抑制C3瘤细胞的生长,联合B7-1基因免疫对诱发的抗体水平无加强作用.结论中国山东地方株E6E7融合基因可用于DNA疫苗的构建,B7-1基因协同免疫可提高疫苗的细胞免疫水平,利用B7-1基因作为HPV16 DNA疫苗的协同因子具有重要价值.
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CD40L融合改造后的人乳头瘤病毒16型E7基因DNA疫苗的构建及其免疫原性测定
目的 研究针对人乳头瘤病毒(HPV)16型的DNA疫苗,测定其免疫原性,用于治疗HPV16感染及感染相关恶性肿瘤.方法 联合采用基因切割重排、定点突变及密码子优化等策略改造HPV16的转化基因E7,基因合成法获得改造后的E7基因(mE7);PCR法将mE7基因与CD40L胞外区编码序列融合,然后以pVR1012为载体构建pVR1012-mE7(mE7)及pVR1012-mE7/CD40L(mE7/CD40L)表达质粒;经肌肉免疫C57BL/6小鼠;ELISA法检测E7特异性血清抗体水平,ELISPOT法分析E749-57(H-2b)特异性分泌IFN-γ的CD8+T细胞活化水平,胞内染色-流式细胞检测分析E7特异性CD4+ Th细胞活化水平;并在C57BL/6小鼠体内进行疫苗抗瘤活性检测.结果 与野生型E7基因(wE7)相比,mE7基因诱发产生的E7特异抗体水平(P＜0.01)、分泌IFN-γ的CD8+T细胞数目(P＜0.01)及CD4+ Th细胞活化水平(P＜0.05)均显著提高;与mE7基因相比,mE7/CD40L融合基因可进一步显著提高E7特异性分泌IFN-γ的CD8+T细胞数目(P＜0.01),但对E7特异性抗体产生及CD4+ Th细胞活化水平没有明显影响.疫苗小鼠体内预防性免疫实验中,经wE7免疫的小鼠接种瘤细胞后2周内全部形成移植瘤,而所有经mE7及mE7/CD40L免疫的小鼠在瘤细胞攻击后第7周仍未见移植瘤形成;疫苗体内治疗性免疫实验中,小鼠在接种wE7后第8天左右全部形成移植瘤,并呈渐进性生长,而接种mE7的小鼠移植瘤清除率为30%,接种mE7/CD40L的小鼠移植瘤清除率增高至45%.对移植瘤的组织学检查结果显示,mE7/CD40L及mE7免疫组小鼠瘤细胞间及瘤组织周围可见大量淋巴细胞浸润,而wE7组小鼠的瘤细胞呈编织状紧密排列,未见有淋巴细胞浸润.结论 HPV16型mE7/CD40L融合基因疫苗免疫小鼠后可诱发较强的E7特异性细胞免疫及体内抗瘤活性,具有较强的免疫原性.
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白介素2基因佐剂协同单纯疱疹病毒1型糖蛋白D核酸疫苗免疫诱导的特异性免疫应答
目的研究白介素2(IL-2)cDNA协同单纯疱疹病毒1型(HSV-1)gD核酸疫苗免疫对机体体液免疫和细胞免疫应答的影响,以及在HSV-1病毒角膜攻击时的保护效果.方法利用pcDNA3.1载体分别构建HSV-1糖蛋白D和IL-2的真核表达质粒pgD和pIL-2,体外鉴定其表达.动物实验分为pcDNA3.1空载体对照组、pgD单独免疫组和pgD+pIL-2联合免疫组3组,具体为通过肌肉免疫接种BALB/c小鼠3次,间隔2周,每次接种质粒100μg,第3次免疫后2周,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体滴度并做亚型分析,利用3H-TdR掺人法进行Th细胞增殖实验,ELISA试剂盒检测Th细胞分泌的IL-2、IFN-γ和IL-10水平,耳廓肿胀实验检测迟发型超敏反应(DTH)反应;HSV-1病毒角膜攻击后,裂隙灯显微镜观察角膜上皮病变.结果与pgD单独免疫组相比,pIL-2的协同免疫可以显著提高IgG2a抗体滴度、Th细胞增殖反应和DTH反应,Th细胞分泌IL-2和IFN-γ水平也显著提高,IL-10水平明显下降.在动物保护实验中,pIL-2的协同免疫明显增强了pgD疫苗在病毒攻击时对角膜的保护效果.结论IL-2 cDNA的协同免疫可以显著提高pgD核酸疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫应答水平,增加核酸疫苗的免疫保护效果.
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单纯疱疹病毒I型糖蛋白D核酸疫苗的构建及初步研究
目的构建、制备I型单纯疱疹病毒糖蛋白D重组质粒DNA疫苗,初步检测其诱导机体产生体液免疫应答的效果,为研制HSV-1新型疫苗奠定基础.方法用PCR的方法从HSV-1病毒基因组中扩增糖蛋白D(glycoprotein D,gD)基因,利用基因重组技术构建重组质粒;将重组质粒体外转染真核细胞COS-7,Westernblotting检测表达产物;于BALB/C小鼠后腿胫前肌注射免疫,0、2周各免疫1次,100μg/次.初次免疫后0、2、4、6周眼眶采血,ELISA间接法检测抗体.结果重组质粒酶切出相应大小片段,经测序证实为HSV-1gD序列.Western blotting证实能够在体外真核细胞中表达.免疫小鼠后,产生特异性抗体,抗体滴度1:2000.结论HSV-1gD重组质粒DNA有可能作为HSV-1的DNA疫苗,用于防治HSV-1感染及其相关疾病.
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突变型与野生型HPV16 DNA疫苗的免疫原性
目的评价突变人乳头瘤病毒16(HPV16)E7锌指结合区后HPV16E7 DNA疫苗的免疫原性.方法将构建的野生型(pcDNA3.1/16E7)和突变型(pcDNA3.1/16ME7)DNA疫苗经肌肉免疫C57BL/6小鼠,分离脾单个核细胞,用E7特异性多肽刺激后,测定E7特异性白介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)的水平及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应.同时以未加E7多肽组作对照组.结果经E7特异性多肽刺激后,pcDNA3.1/16ME7产生IL-2的斑点数明显高于pcDNA3.1/16E7、pcDNA3.1和空白对照组.pcDNA3.1/16ME7的斑点数是pcDNA3.1/16E7的5倍多,两组间差异有显著性(P＜0.05);pcDNA3.1/16ME7产生的IFN-γ是pcDNA3.1/16E7的2倍,差异有显著性(P＜0.05);LDH结果显示在E:T为45:1时,pcDNA16/E7、pcDNA16/ME7、pcDNA3.1及未经免疫的小鼠4组之间CTL细胞杀伤率分别为(28.7±1.2)%、(55±2.2)%、(12.5+2.0)%和(11.5±1.2)%,前两组与后两组中任一组之间差异均有显著性,前2组之间差异亦有显著性(P＜0.05).而未加E7多肽组,各组间差异均无显著性(P＞0.05).结论突变HPV16E7锌指结合区能显著增强DNA疫苗的免疫原性,是提高DNA疫苗免疫原性的策略之一.
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质粒pcDNAL1诱发C57BL/6小鼠产生特异性细胞免疫反应
目的利用重组HPV16 L1 DNA真核表达质粒免疫C57BL/6小鼠探讨DNA疫苗的免疫效果.方法实验动物C57BL/6随机分为实验组(pcDNAL1)和对照组(pcDNA3.1和PBS),用免疫原共免疫三次,间隔三周,末次免疫后10-14天行足垫肿胀试验检测DTH反应;之后,拉颈处死,尸检观察.行脾细胞抗原特异性增殖反应和CD4/CD8,IFN-γ+或IL10+细胞FACS分析.内脏用于组织学检查.结果质粒pcDNAL1组脾细胞增殖指数、足垫肿胀程度、CD8+IFN-γ+细胞均高于对照组.整个免疫过程中动物无行为异常,尸检未见异常病变.结论裸pcDNAL1 质粒免疫C57BL/6小鼠能诱发特异性细胞免疫反应,且安全性较高.这将为其进一步临床试验奠定牢固的理论和实践基础.
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分子佐剂在DNA疫苗中的应用
如何增强和提高DNA疫苗的免疫效果是新一代DNA疫苗分子设计和研究的关键问题,其中之一就是应用分子佐剂来优化DNA疫苗.分子佐剂可将以基因方式传递的免疫刺激分子与DNA疫苗共免疫,在体内表达相应的蛋白,增强T、B细胞对疫苗成分的体液及细胞免疫应答.目前研究较多的分子佐剂有:细胞因子如干扰素(IFN)、白细胞介素2(IL-2)、IL-12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等;共刺激分子如B7-2、CD40L等;补体佐剂如C3;免疫刺激序列如CpG、寡核苷酸(ODN)等.分子佐剂在体内与疫苗基因共表达,改善抗原的周边微环境,提高疫苗的免疫效果.因此,分子佐剂是目前DNA疫苗研究中的热点问题之一.
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T细胞受体β独特型抗原决定簇DNA疫苗诱导抗淋巴瘤抗体的研究
目的观察T细胞受体(TCR)β不同独特型抗原决定簇DNA疫苗诱导BALB/c小鼠抗人类CEM淋巴瘤细胞免疫反应的情况.方法RT-PCR扩增CEM细胞特异性重排的TCR β基因片段,克隆至真核表达载体pcDNA3中,然后以此为模板,扩增编码不同抗原决定簇的基因片段,分别克隆到pcDNA3中作为DNA疫苗.肌肉注射法免疫小鼠,间接免疫荧光法检测小鼠血清中抗体生成情况.结果CEM细胞TCRβ共包含5个抗原决定簇,其DNA疫苗免疫的6只小鼠全部产生了特异性抗独特型抗体(高滴度l:480);含4个抗原决定簇的DNA疫苗免疫的6只小鼠中有4只产生了特异性抗独特型抗体,但滴度均较低(高滴度1:80);仅含2个抗原决定簇的DNA疫苗未能使小鼠产生特异性抗独特型抗体.结论包含TCRβV区全长,共有5个抗原决定簇的独特型DNA疫苗可以诱导小鼠产生抗淋巴瘤细胞的独特型特异性抗体;含有4个抗原决定簇的DNA疫苗仍可诱导特异性抗体的生成,但这种反应较弱;而仅含有2个抗原决定簇的DNA疫苗则不能诱导小鼠产生抗淋巴瘤的特异性抗体.
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日本血吸虫DNA疫苗的研究现状与展望
运用基因工程的技术,将编码某种蛋白的外源性基因直接导入动物细胞,这种导入的核酸既是载体,又是具有免疫原性的抗原,故称核酸疫苗.目前研究多的为DNA疫苗.1994年5月,WHO全球疫苗和免疫规划等机构联合召开核酸疫苗会议,充分肯定了核酸疫苗的潜在应用价值,并强调其研究方向与用一种疫苗预防多种疾病的长远目标相一致[1].
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艾滋病DNA疫苗动物研究有效
科学家首次证明,单次剂量HIV DNA疫苗接种可以使其他灵长类动物产生持久的免疫反应,这一结果在HIV疫苗开发中具有重要意义.
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IL-2、IFN-γ和GM-CSF基因佐剂对pcDNA3/MDC-VP1 DNA疫苗免疫作用的影响
目的:观察IL-2、IFN-γ和GM-CSF重组质粒对pcDNA3/MDC-VP1 DNA疫苗免疫的免疫增强效果.方法:将50只4～6周龄雄性BALB/c小鼠随机分成pcDNA3 组、pcDNA3/MDC-VP1组、pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/hIL-2组、pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/m IFN-γ组、pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mGM-CSF组,每组10只.均每3周接种1次,共3次.每次接种的第20 d内眦静脉采血,用微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)检测血清中和抗体效价.第3次免疫后3周,每组取3只小鼠脾脏制备淋巴细胞悬液,检测淋巴细胞增殖活性与特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性.结果:各组血清中和抗体滴度随免疫次数增加而提高(P＜0.05);第3次免疫后pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mGM-CSF组的血清中和抗体滴度、脾脏淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性均高于其他组(P＜0.05 ).结论:三种细胞因子基因佐剂均能增强pcDNA3/MDC-VP1的免疫效果,GM-CSF基因佐剂的免疫效果优于IL-2和IFN-γ.
关键词： 柯萨奇病毒B组3型 DNA疫苗 佐剂 巨噬细胞源趋化因子(MDC) -
DNA疫苗预防和治疗呼吸道过敏性疾病的进展
呼吸道过敏性疾病发病率一直居高不下,目前临床上治疗该病的方法效果均不够理想,DNA疫苗的Th1型免疫应答诱导能力和它在多种水平调节免疫反应的能力使它成为一种很有前途的过敏性疾病预防和治疗措施.本文综述了目前DNA疫苗预防和治疗呼吸道过敏性疾病的进展、DNA疫苗的优缺点以及相应的改进措施.
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应用结核病DNA疫苗治疗小鼠耐多药结核病的研究
目的 研究结核分枝杆菌Ag85A质粒DNA疫苗单独或联合药物治疗小鼠耐多药结核病的效果,为建立耐多药结核病的免疫治疗新策略和新方案奠定基础.方法 用结核分枝杆菌高耐利福平、低耐异烟肼临床分离株HB361尾静脉注射17～19 g的6～8周龄雌性BALB/C小鼠后,将小鼠随机分为6组,每组10只.感染后第2天开始,分别用pVAX1载体(A组)、利福平(B组)、吡嗪酰胺(C组)、Ag85A质粒DNA疫苗(D组)、Ag85A质粒DNA疫苗联合利福平(E组)、Ag85A质粒DNA疫苗联合吡嗪酰胺(F组)治疗60 d.治疗结束后4周,分别取肺、肝和脾观察病理改变,称取重量,做菌落计数.结果 小鼠感染4周后,肺内菌量达到1.5×107 CFU,脾内菌量达到1.1×106 CFU.A、B组小鼠死亡率均为10%,其余各组小鼠均存活.治疗结束后4周,肺组织病理显示,各治疗组肺组织病变均有不同程度减轻,病变局限,可见正常的肺泡结构,肺泡轮廓相对清晰.与A组比较,C、D、E、F组肺组织菌落数分别减少了1.18、1.35、1.38、1.08 logs,脾脏菌落数分别减少了0.91、1.00、1.26、1.03 logs(P＜0.01).结论 结核分枝杆菌Ag85A质粒DNA疫苗单独或联合药物治疗小鼠耐多药结核病均有显著疗效.Ag85A质粒DNA疫苗与抗结核药物联合治疗是治疗耐多药结核病的有前途的免疫策略.
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日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗不同免疫途径免疫保护效果研究
目的:观察本室所构建日本血吸虫大陆株31kDa组织蛋白B DNA疫苗在BALB/c小鼠体内的不同免疫途径的免疫保护效果.方法:用纯化的空白质粒载体VR1012、重组质粒VR1012-Sj31免疫BALB/c鼠,将36只6～8周龄BALB/c鼠随机分为3组,每组12只,对照组(A组)肌肉注射空白质粒载体VR1012,实验组(B组)皮下注射重组质粒VR1012-Sj31,C组肌肉注射重组质粒VR1012-Sj31.质粒剂量均为100μg,每隔2w免疫1次,共免疫3次,第3次免疫后第21d,每只鼠经腹部感染10条尾蚴,42d后剖杀计数各小鼠成虫数和每克肝卵数,观察诱导产生的减虫和减卵效果,并用ELISA分析小鼠血清中的抗体.结果:ELISA分析表明,第3次免疫后小鼠出现特异性IgG抗体.与空白质粒对照组比较,2个实验组的减虫率分别为15.0%(P＞0.05)和25.0%(P＜0.05),减卵率分别为38.22%和54.90%(P＜0.001).与皮下免疫组相比,VR1012/Sj31肌肉免疫组的减卵率分别为26.99%(P＜0.001).结论:DNA疫苗VR1012-Sj31能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用,肌肉注射的保护效果大于皮下注射.
关键词： 日本血吸虫 VR1012-Sj31 组织蛋白酶B DNA疫苗 免疫保护效果 -
DNA疫苗的转运途径及其安全性研究进展
目的总结DNA疫苗主要转运途径及其安全性的研究现状，探讨DNA疫苗的不同转运途径在动物实验和人类试验中的应用。方法应用Medline、PubMed及CNKI期刊全文数据库检索系统，以“DNA疫苗、电穿孔、基因枪、直接注射、喷雾、脂质体包裹”等为关键词，检索2008-2011年的相关文献，总共检索到英文文献97条。纳入标准：①DNA疫苗的一般特性；②DNA疫苗电传孔转运途径；③DNA疫苗基因枪注射途径；④DNA疫苗直接注射途径；⑤DNA疫苗黏膜免疫途径。根据纳入标准，符合分析的文献33篇。结果DNA疫苗自偶然被发现以来，显示出了无法比拟的优越性，一举成为第三代疫苗。使用合适的转运途径能增加DNA疫苗在体内的免疫原性和转染效率。然而，转染效率的增加，使得人们对基因整合等安全性问题的担心更甚。结论DNA疫苗通过合适的转运途径能够增加其在体内的免疫原形和转染效率，各种转运途径均是安全的。在不久的将来，DNA疫苗将能应用于人类，造福世界。但是在实验或临床试验中还是要关注并防止DNA疫苗安全性问题的发生。
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核酸疫苗的研究现状
核酸疫苗(nucleicacid vaccine)是指将含有编码某种抗原蛋白的外源基(DNA或RNA)序是质粒载体作为疫苗,直接导入到动物细胞内,通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原核酸疫苗又称应答,以达到预防和治疗疾病的目的.
