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花粉变应原的分离与鉴定
花粉变应原的分离与鉴定是研究花粉变应原性的基础,同时也是建立变应原标准定量方法以实现花粉变应原制剂标准化的前提.在花粉症的其他防治研究中,花粉变应原的分离与鉴定可为分子诊断方法的建立、低致敏性重组变应原疫苗、肽段疫苗及DNA疫苗的研究奠定良好的基础,也有利于特异性免疫治疗机制的阐明.因此,花粉变应原的分离和鉴定对花粉症及其防治研究具有重要意义.
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多聚赖氨酸预处理花生DNA疫苗对花生蛋白诱导变态反应的作用
目的 探讨经多聚赖氨酸预处理的花生DNA疫苗对花生蛋白诱导变态反应的预防作用.方法 以编码花生蛋白Arah2的质粒DNA (pArah2)、经多聚赖氨酸(PLL)预处理的质粒DNA( PLL-pArah2)、磷酸盐缓冲液(PBS)和PLL对照皮内注射免疫Balb/c小鼠,1次/周,连续3周,再经腹腔注射纯化的Arah2蛋白免疫小鼠.在不同时间点收集各组小鼠血清,用酶联免疫吸附法检测血清中Arah2特异性IgG1、IgG2a抗体以及血清总IgE抗体水平,分析DNA疫苗免疫对蛋白诱导小鼠变态反应的影响.结果 pArah2及PLL-pArah2质粒DNA免疫后,小鼠血清Arah2特异性IgG1和IgG2a升高,但血清总IgE抗体未见升高.Arah2蛋白免疫后,不同处理组血清总IgE 、Arah2特异性IgG1和IgG2a抗体水平均升高,但pArah2组血清总IgE和Arah2特异性IgG1抗体水平明显低于PBS对照；PLL-pArah2组血清总IgE和Arah2特异性IgG1、IgG2a抗体水平不仅明显低于PBS和PLL对照,且明显低于单纯pArah2组.结论 经多聚赖氨酸预处理的Arah2 DNA免疫能够更好地抑制之后蛋白免疫产生的变态反应应答,为DNA疫苗治疗过敏性疾病提供了新的思路.
关键词： 花生过敏 DNA疫苗 多聚赖氨酸 花生蛋白 Ara h2 -
减毒沙门菌为载体的PspA优势抗原组合DNA疫苗对肺炎链球菌定植的防御作用评价
目的 评价以减毒沙门菌为载体携带PspA不同家族亚类优势抗原的肺炎链球菌DNA疫苗对不同侵袭性肺炎链球菌定植的防御作用,探讨优化肺炎链球菌DNA疫苗增强鼻咽部黏膜免疫的策略.方法 应用分子克隆技术,在前期研究基础上,制备携带PspA不同家族亚类优势抗原(PspA-Fam1-Clade1和PspA-Fam2-Clade3)的减毒沙门菌为宿主菌的非抗性基因筛选的真核质粒-宿主致死平衡系统,应用RT-PCR和免疫印迹技术检测优势抗原的表达情况,并在含或不含DAP的SOB培养基中传代培养,抽提质粒PCR检测疫苗携带抗原的稳定性.以PBS为对照,口服免疫接种BABL/c小鼠,ELISA检测鼻咽部sIgA的水平；应用小鼠鼻咽部定植模型检测疫苗对不同侵袭性肺炎链球菌定植的防御作用.结果 成功构建出携带PspA不同家族亚类优势抗原(PspA-Fam1-Clade1和PspA-Fam2-Clade3)的减毒沙门菌为宿主菌的非抗性基因筛选的真核质粒-宿主致死平衡系统,且稳定性好；免疫小鼠鼻咽部抗PspA-Fam1-Clade1和PspA-Fam2-Clade3的特异性sIgA的水平显著高于对照组(P＜0.01)；免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌定植模型的菌落计数较对照组明显减少(P＜0.01).结论 以减毒沙门菌为载体携带PspA不同家族亚类优势抗原是增强肺炎链球菌DNA疫苗鼻咽部黏膜免疫的优化策略.
关键词： 肺炎链球菌表面蛋白A DNA疫苗 鼻咽部定植 黏膜免疫 减毒沙门菌 -
联合注射自身胰岛细胞瘤相关抗原2基因疫苗预防NOD小鼠自身免疫性糖尿病
目的 探讨自身抗原基因疫苗胰岛素瘤相关蛋白-2(pIA-2)以及分子免疫佐剂白细胞介素-4/单核细胞趋化因子-1(pIL-4/MCP-1)对糖尿病前期NOD小鼠发生自身免疫性糖尿病的预防作用.方法 利用分子克隆技术构建pIA-2自身抗原基因疫苗,将4～5周龄NOD小鼠分为pIA-2治疗组(n=5)、pIL-4/MCP-1治疗组(n=5)、联合治疗组(n=5)及对照组(n=5),分别注射pIA-2、pIL-4/MCP-1、pIA-2联合pIL-4/MCP-1、增强型绿色荧光蛋白(pEGFP),免疫结束后观察24周,比较各组糖尿病发病情况和胰岛炎的程度,并用RT-PCR方法和免疫组化法检测质粒在注射部位和胰岛的表达.两样本间均数的比较用t检验,率的比较用x2检验进行统计.结果 单用pIA2或pIL-4/MCP-1治疗的NOD小鼠发病与对照组相比无显著改善;联合应用该两种质粒的NOD小鼠在观察期内未发病.RT-PCR检测结果显示免疫结束后2周,注射部位肌细胞中均有胰岛细胞瘤相关抗原2(IA-2)及白细胞介素-4(IL-4)表达.免疫组化法发现,免疫结束后2周,pIA-2注射组小鼠胰岛的IA-2表达量增加;IL-4在胰岛上可见少量表达.免疫结束后观察24周,检测各组的胰岛炎发生率,对照组、pIA2组、pIL-4/MCP-1组、pIA2+pIL-4/MCP-1组中无胰岛炎的发生率分别为4.2%(1/24)、5%(1/20)、0(0.0)、62.5%(15/24),外周性胰岛炎发生率分别为12.5%(3/24)、10%(2/20)、5%(1/20)、29%(7/24),中心性胰岛炎发生率(＜50%、＞50%)分别为[50%(12/24),33.3%(8/24)]、[40%(8/20),45%(9/20)]、[45%(9/20),50%(10/20)]、[4.2%(1/24),4.2%(1/24)].和对照组相比,联合治疗组中不发生胰岛炎的比率显著升高(x2=18.38,P＜0.01),发生中心性胰岛炎的比率显著降低(x2=11.68,P＜0.001),其余各组和对照组相比胰岛炎的发生比率无显著差异.以免疫组化法检测NOD小鼠胰岛内IA-2、IL-4的表达,显示免疫注射组IA-2、IL-4表达较对照组增强.结论 联合应用pIA-2及pIL-4/MCP-1基因疫苗提前免疫胰岛炎前期的NOD小鼠可抑制和延缓糖尿病的发生.
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丙型肝炎病毒包膜E2蛋白DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体研究
目的 探讨HCV包膜E2蛋白DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体的可行性.方法 分别构建HCV E2蛋白全长表达质粒pcDNA3.1-1a746、截除疏水性羧基末端的表达质粒pcDNA3.1-1a661以及同时截除疏水性羧基末端和高变区1(HVR1)的表达质粒pcDNA3.1-1a661Δ,转染293T细胞,以Western blot和ELISA法检测细胞内和培养上清中的HCV E2蛋白,将3种表达质粒以及空载体分别肌注免疫 BALB/c小鼠,检测小鼠血清的E2及HVR1抗体,以HCV假病毒模型分析小鼠血清的中和活性.结果 3种E2表达质粒均能有效表达HCV E2蛋白,其中pcDNA3.1-1a746质粒的表达产物不能分泌,而pcDNA3.1-1a661和pcDNA3.1-1a661Δ均能分泌表达E2蛋白.分泌表达E2蛋白可显著增强小鼠的抗体应答,pcDNA3.1-1a661免疫血清对HCV假病毒颗粒(HCVpp)的中和活性明显高于pcDNA3.1-1a661Δ免疫血清.pcDNA3.1-1a661免疫血清中的HVR1抗体量仅占总E2抗体的一小部分,却是中和抗体的重要成分.结论 表达E2蛋白的DNA疫苗能有效诱导HCV中和抗体的产生,HVR1不仅是重要的中和抗体表位,而且能增强E2蛋白其他抗原表位的抗体应答.
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HPV58型复合DNA疫苗抗肿瘤免疫效果的初步观察
目的 初步观察PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合DNA疫苗的抗肿瘤免疫效果.方法 在检测该复合疫苗的免疫效果前,自行构建了稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16-HPV58E6E7成瘤细胞系,表达并纯化了HPV58E6E7-GST融合蛋白作为抗原.将该疫苗免疫C57BL/6小鼠(免疫组)后,通过抗肿瘤移植保护实验和肿瘤生长抑制实验观察该疫苗对小鼠负荷的B16-HPV58E6E7移植瘤的防治效果；通过特异性抗体检测、酶联免疫斑点检测、特异性杀伤实验观察该疫苗在被免疫小鼠体内诱发的体液和细胞免疫反应.以单纯抗原PVAX1-HPV58mE6E7 Fc免疫小鼠作为单纯抗原组.结果 抗肿瘤移植保护实验显示,经PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗免疫的小鼠成瘤率仅为9/15,但成瘤时间长[为(13.6±1.7)d],且肿瘤生长慢.在肿瘤生长抑制实验中,疫苗组小鼠的肿瘤生长抑制率达81.4％.体液免疫检测显示,该疫苗和单纯抗原均能在小鼠体内诱发特异性抗体,高滴度分别为1∶25 600和1∶12 800,两组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；但在细胞免疫检测中,疫苗组激活的特异性T淋巴细胞数[(219±34)个/4×105个脾淋巴细胞]约为单纯抗原组[(55±25)个/4×105个脾淋巴细胞]的4倍,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；且该疫苗诱发的特异性针对B 16-HPV58 E6 E7细胞的杀伤率(高为43.3％)也明显高于单纯抗原组(杀伤率高为31.3％),两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合DNA疫苗能有效激发特异性的体液和细胞免疫反应,显著抑制B16-HPV58E6E7肿瘤细胞的生长,在细胞免疫上优于单纯抗原,可作为HPV58阳性相关肿瘤及其癌前病变免疫治疗的候选疫苗.
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PML-RARα系列重组质粒在BALB/c小鼠体内表达分析
目的 检测PML-RARα融合基因疫苗在小鼠体内的转录和表达.方法 用成功构建的重组质粒(PML-RARα-hIL-2)免疫小鼠,于第0周、2周、4周在双侧股四头肌各注射1次,分离注射部位肌肉,用RT-PCR检测目的基因在小鼠骨骼肌中的转录;应用免疫组织化学染色法检测重组质粒蛋白表达.结果 小鼠注射部位肌肉中检测到PML-RARα及hIL-2基因的转录.并可检测到hIL-2蛋白的表达.结论 所构建的PML-RARα系列重组质粒可以在小鼠体内有效地表达基因产物,具有DNA疫苗的基本特性.
关键词： PML-RARα hIL-2 急性早幼粒细胞白血病 DNA疫苗 -
PML-RARα-hIL2 DNA疫苗免疫BALB/c小鼠后胸腺初始T细胞水平变化
目的 了解PML-RARα-hIL-2基因疫苗免疫小鼠后胸腺初始(na(I)ve)T细胞变化情况.方法 利用实时定量PCR检测小鼠胸腺组织DNA中T细胞受体删除DNA环(TRECs)的水平,从而评价小鼠胸腺中na(I)ve T细胞含量.结果 利用PML-RARα-hIL-2 DNA疫苗免疫小鼠后胸腺中所含的TRECs拷贝数明显高于单个基因疫苗PML-RARα或hIL-2组及对照组.结论 所构建的PML-RARα-hIL-2双表达质粒可诱导小鼠胸腺产生na(I)ve T细胞数量增加,可能与产生更强的细胞免疫应答有关.
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pIRES-PML-RARα-hIL-2重组质粒的构建和表达研究
目的 构建PML-RARa融合基因与人白介素-2(hIL-2)基因真核双表达质粒.方法 利用RT-PCR技术从NB4细胞的RNA中扩增出PML-RARα融合点附近的部分基因片段,通过RT-PCR扩增Jurkat细胞中的hIL-2基因,并分别将两基因片段连接到pIRES质粒的多克隆位点(MCS)A和B中,构建真核双表达质粒.利用酶切和序列分析方法验证所构建质粒的正确性.将构建成功的重组质粒转染A549细胞,通过RT-PCR检测重组质粒在真核细胞中的转录情况,利用点杂交、EUSA检测目的蛋白的表达情况.结果 Nhe I/Mlu I和Sal I/Not I双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARa基因片段及hIL-2基因,序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确.将所构建的pIRES-PML-RARα-hIL-2质粒转染A549细胞后经RT-PCR鉴定表明,插入到重组质粒中的PML-RARα和hIL-2基因能够在真核细胞中进行正常转录.经点杂交和ELISA检测显示重组质粒在真核细胞中可表达hIL-2蛋白.结论 成功构建了pIRES-PML-RARa-hlL-2质粒,该重组质粒能够在真核细胞中正常转录并表达PML-RARd和hIL-2蛋白.
关键词： PML-RARct hIL-2 急性早幼粒细胞白血病 DNA疫苗 -
血液肿瘤DNA疫苗研究进展
DNA疫苗能够诱导机体产生特异性体液和细胞免疫反应,基于血液肿瘤抗原而设计的DNA疫苗,有可能促进机体的抗肿瘤免疫应答能力,而消除微小残留病变,预防复发和延长无病生存期.
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PML-RARα-hIL-2 DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的细胞和体液免疫应答
目的 分析PML-RARα融合基因疫苗诱导小鼠特异体液和细胞免疫应答情况.方法 用成功构建的重组质粒(pIRES-PML-RARα-hIL-2)免疫小鼠后,分别利用ELISA法检测小鼠血清中INF-γ生成情况;LDH释放法检测小鼠脾细胞特异性CTL细胞针对APL细胞株NB4的杀伤率;用间接免疫荧光法检测血清中抗PML-RARa抗体.结果 免疫后第7周时,小鼠血清中INF-γ含量、抗PML-RARα抗体及脾脏CTL细胞针对NB4的杀伤率均高于对照组.结论 所构建的pIRES-PML-RARα-hIL-2重组质粒可诱导小鼠产生了特异性体液和细胞免疫应答.
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基因枪介导的neu基因DNA疫苗抗肿瘤作用的实验研究
目的探讨DNA疫苗pWRG-neu的皮内免疫,对高表达neu基因的小鼠移植瘤生长和转移的抑制作用.方法向小鼠黑色素瘤B16F10细胞系转染pcDNA-neu,用有限稀释法筛选一株高表达neu基因的细胞株B16F10-neu.在基因枪介导下,向C57BL/6小鼠导入DNA疫苗pWRG-neu,通过观察免疫动物的生存期,评价DNA疫苗的抗肿瘤作用.分离免疫动物脾细胞,经自体淋巴细胞混合培养实验,分析DNA疫苗体内免疫后机体的CTL应答.结果筛选到一株高表达neu基因的B16F10-neu细胞株,转基因过程和外源基因的表达没有改变细胞系的增殖特性.用基因枪轰击,进行DNA疫苗pWRG-neu皮内免疫,对小鼠黑色素瘤B16F10-neu进行预防、治疗和抗转移的实验研究,结果表明,DNA疫苗的免疫能够明显推迟移植瘤的生长,延长小鼠生存期,获得明显的抗肿瘤效果.DNA疫苗免疫后可诱导小鼠脾淋巴细胞CTL活性.结论基因枪介导的DNA疫苗pWRG-neu经皮内免疫,能够有效的诱导机体的细胞免疫应答,预防和治疗小鼠移植瘤的发生,并有一定的预防肿瘤肺转移的作用.
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胃癌MG7-Ag模拟表位口服DNA疫苗的研制
目的利用减毒鼠伤寒沙门氏菌研制胃癌MG7-Ag模拟表位的口服DNA疫苗,并观察其对小鼠的免疫效能及保护作用.方法构建MG7-Ag模拟表位和通用性辅助性T细胞表位融合基因的真核表达载体.将真核表达载体转入减毒鼠伤寒沙门氏菌得到模拟表位的口服DNA疫苗.以1×108 cfu 疫苗菌口服免疫C57BL/6J小鼠,以携带空载体的沙门氏菌和PBS口服作为对照.以ELISA法检测小鼠血清中抗MG7-Ag抗体的滴度,以H-TDR掺入法检测小鼠脾淋巴细胞对人工合成的MG7-Ag抗原肽刺激的增殖能力.同时,用表达MG7-Ag的小鼠艾氏腹水瘤细胞进行肿瘤攻击,观察疫苗对小鼠的保护作用.结果口服疫苗可诱导小鼠产生MG7抗体,但各组小鼠脾淋巴细胞体外刺激增殖实验差异无显著性.肿瘤攻击2周后,疫苗免疫组7只小鼠中有2只未见肿瘤形成,而对照组4只小鼠则全部成瘤.结论胃癌MG7-Ag模拟表位的口服DNA疫苗具有免疫原性,可以诱导小鼠产生抗肿瘤免疫,并具有一定保护作用.
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白细胞介素-2基因佐剂对单纯疱疹病毒糖蛋白D DNA疫苗的免疫增强作用
目的探讨白细胞介素-2(IL-2)基因佐剂对单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)糖蛋白D(gD)DNA疫苗的免疫调节作用.方法将表达HSV-Ⅰ gD基因的DNA疫苗质粒IRES-gD 以及HSV-Ⅰ gD与IL-2 基因共表达的重组质粒IRES-gD-IL-2分别注入BALB/c 鼠股四头肌,检测特异性抗体和中和抗体的产生情况,并于第3次注射后14 d用滴度100组织培养半数感染量(TCID50)的HSV-1病毒感染小鼠,观察小鼠的生存情况.结果 IRES-gD 组和IRES-gD-IL-2组均可刺激小鼠产生抗HSV-Ⅰ gD 的特异性抗体和中和抗体,抗体滴度随免疫次数增加而升高,IRES-gD-IL-2组小鼠产生的抗体及中和抗体滴度明显高于IRES-gD 组,两组小鼠的生存率差异无统计学意义 .结论 IL-2基因佐剂可促进HSV-Ⅰ gD DNA 疫苗诱导抗体的产生,并具有免疫增强作用.
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补体C3d-p28对阿尔茨海默病DNA疫苗的免疫增强作用
目的 探讨补体C3d-p28作为分子佐剂,在阿尔茨海默病DNA疫苗基因免疫中的作用.方法 在第1、8、22、43、64、85、106、127天,将重组质粒p(Aβ3-10)10、p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3和pcDNA3.1(+)肌肉注射于APP/PS1双转基因鼠后腿股四头肌内.疫苗接种前 、自第2次注射开始每次接种后7天取鼠眶静脉血共8次,以ELISA法检测抗Aβ 抗体的滴度和分型;第8次(后1次)眶静脉取血后进行6 d的Morris水迷宫实验,通过定位航行和空间探索实验评估小鼠空间学习记忆能力.水迷宫实验结束后处死小鼠,以ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清液中白细胞介素4(IL-4)和干扰素 γ(IFN-γ)水平,免疫组化染色法检测小鼠脑内Aβ 斑的表达.结果 p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组抗Aβ 抗体水平高于p(Aβ3-10)10组〔(55.03±8.93)μg/mL vs.(27.32±7.69)μg/mL,t=-4.455,P<0.05〕,p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组抗体类型主要是IgG1型〔(50.64±6.96)μg/mL〕,明显高于p(Aβ3-10)10组〔(14.15±3.16)μg/mL,P<0.05〕.与p(Aβ3-10)10组比较,p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组Morris水迷宫实验平均逃避潜伏期变短 、穿越平台次数和穿越平台所在象限停留的时间比例明显增多(均P<0.05);脾细胞培养上清液中IL-4水平增高〔(110.22±18.12)pg/mL vs.(170.12±22.16)pg/mL,P<0.05〕 、IFN-γ 水平减低〔(800.12±80.11)pg/mL vs.(640.12±70.53)pg/mL,F=6.152,P<0.05〕;脑内沉积的Aβ 斑块明显减少(P<0.05).结论 补体C3d-p28分子佐剂使p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3抗Aβ 抗体的产生增加 、Th2型免疫反应增强,转基因鼠空间学习记忆能力提高.
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空肠弯曲菌多价DNA疫苗对周围神经的安全性和保护性
目的 评价空肠弯曲菌多价DNA疫苗对周围神经的免疫安全性和保护性.方法 以空肠弯曲菌HS:19全菌抗原免疫为阳性对照组,将不同效价的空肠弯曲菌DNA疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠,采用ELISA法检测免疫后小鼠血清抗GM1抗体水平;采用组织病理学检查观察免疫后小鼠坐骨神经组织结构改变.将上述小鼠免疫后4周的血清注射于健康BALB/c小鼠坐骨神经外膜下,4周后观察被注射坐骨神经组织病理学改变;在此基础上,采用空肠弯曲菌HS:19重复攻击方式进行灌胃攻击,以对该疫苗的免疫保护作用进行评价.结果 空肠弯曲菌HS:19全菌抗原经鼻免疫小鼠后诱发了周围神经显著的免疫性损伤,坐骨神经原纤维病变发生率高达66.3%,主要表现为广泛的轴索变性,同时伴有血清抗GM1抗体增高,末次免疫后第4周其P/N值达8.13;将免疫后的小鼠血清注射于健康小鼠坐骨神经外膜下后发生了更加严重的免疫性损伤.而空肠弯曲菌多价DNA疫苗却不能诱导血清抗GM1抗体增高,以其免疫后的血清行神经外膜下注射亦无明显周围神经免疫性损伤发生;另外,其诱导的特异性免疫应答可有效保护小鼠免遭空肠弯曲菌感染,显著降低被攻击小鼠周围神经组织病变的发生率.结论 空肠弯曲菌多价DNA疫苗对周围神经具有安全无毒性和免疫保护作用.
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HIV-1CN54合成gp120基因(syngp120)的DNA疫苗鼻内免疫小鼠诱导全身的和粘膜的免疫应答
目的初步探讨HIV-1CN54合成gp120基因的DNA疫苗(pcDNA3.1-syngp120)鼻内接种小鼠是否诱发免疫应答.方法DNA疫苗免疫后,制备脾和肠系膜淋巴结(MLN)淋巴细胞,在体外测其增殖应答和CD+8 CTL应答.间接ELISA法测血清和粘膜洗液抗原-特异的IgG和IgA抗体滴度.中和实验测免疫血清和阴道洗液是否中和HIV-1SF33.结果在DNA疫苗末次免疫后,小鼠第1周检测到脾和MLN CD8+CTL应答较弱,而第5周未检测到.另外,在末次免疫后的第1、5周检测到MLN而未检测到脾淋巴细胞发生增殖应答.并且检测到特异的血清IgG抗体和粘膜的(包括粪便和阴道洗液)IgA抗体,但未检测到血清的IgA抗体和粘膜的(包括粪便和阴道洗液)IgG抗体.中和实验发现末次免疫后第5周的血清能中和实验室毒株HIV-1SF33(B亚型),而阴道洗液则没有.结论该DNA疫苗鼻内免疫小鼠可诱导粘膜免疫应答,包括MLN淋巴细胞增殖应答和CD8+CTL应答,同时诱导较弱的粘膜IgA抗体应答.此外,能诱导脾CD+8CTL应答和血清IgG抗体应答.免疫血清中和HIV-1S F33,而阴道洗液不能.
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通过T-A克隆技术构建含免疫刺激序列CpG基序的抗SBR DNA疫苗
目的:构建含免疫刺激序列、能够阻止变形链球菌在牙面粘附的防龋DNA疫苗.方法:根据原核表达质粒pSBR-CTA2B基因序列,设计针对编码变形链球菌表面蛋白抗原AgⅠ/Ⅱ分子中唾液蛋白结合区段(SBR)的特异性PCR引物,利用PCR技术由质粒pSBR-CTA2B扩增目的DNA片断;通过T-A克隆技术将目的DNA片段克隆于中间载体pMD18-T,鉴定插入方向后,选择插入方向正确的克隆,将目的DNA从中间载体释放,再克隆至含有CpG免疫刺激序列的真核表达载体pcDNA3.1.结果:通过对重组质粒pcDNA3.1-SBR进行酶切图谱分析和DNA序列测定分析,证明真核表达重组质粒pcDNA3.1-SBR构建成功、开放阅读框架正确.结论:利用T-A克隆等技术可成功将编码SBR的DNA片段克隆到含有免疫刺激序列CpG的真核表达载体pcDNA3.1的适当部位,构建出真核表达重组质粒pcDNA 3.1-SBR作为有效防龋的DNA疫苗.
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以恒河猴为模型的霍乱毒素B亚基与疟原虫多表位构建的DNA疫苗的免疫保护作用
目的:研究以霍乱毒素B亚基(CTB)为载体的重组疟疾多价抗原(AWTE)表位的DNA疫苗在恒河猴中的免疫原性及对相应疟原虫感染的免疫保护作用.方法:以恒河猴为模型,肌肉途径免疫编码CTB-AWTE基因的质粒,免疫间隔为15 d,免疫3次,免疫剂量为每种质粒每次500 μg/只.结果:DNA疫苗组免疫2次后即产生了较高水平的细胞免疫和体液免疫,免疫后91 d用1.25×108个猴疟原虫攻击,对照组5只动物在攻击后14 d左右全部感染,感染持续34 d以上;DNA疫苗组的5只动物在攻击后60 d没有感染.结论:这种鸡尾酒式的抗原表位组合构建的DNA疫苗具有很好的免疫原性,同时也说明DNA疫苗在抗疟感染中起着举足轻重的作用.
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密码子优化和蛋白加强免疫对SARS-CoV N基因重组质粒免疫原性的影响
目的:观察密码子优化的SARS-CoV N基因的重组质粒,以及DNA初始免疫-蛋白加强免疫方式诱导小鼠的体液免疫应答水平,探讨提高SARS-CoV DNA免疫原性的途径.方法:SARS-CoV BJ01株N基因和密码子优化N基因分别通过从病毒RNA中RT-PCR扩增和人工合成获得,并克隆至pVAX1载体.将重组质粒DNA以100 μg/只的剂量肌肉注射免疫BALB/c小鼠,于第20天同剂量再免疫1次后,于第40天再用50 μg/只剂量的N蛋白加强免疫.每次免疫后于第10天采集血清,用ELISA检测血清中抗SARS-CoV N蛋白特异性抗体效价.同时设单纯重组质粒DNA免疫组和重组N蛋白免疫组作为对照.结果:密码子优化的N基因的重组质粒DNA免疫可诱导小鼠产生高水平体液免疫应答;而采用DNA初始免疫-N蛋白加强免疫的方式则可使抗体效价提高至少10倍.结论:密码子优化和DNA初始免疫-蛋白加强免疫这两种途径均可提高SARS-CoV N基因重组质粒DNA在小鼠中的体液免疫应答水平.
