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TgMAPK1核酸疫苗对小鼠的免疫保护性研究
目的 构建重组质粒pEGFP-MAPK1,制备弓形虫MAPK1核酸疫苗(DNA疫苗),评价该疫苗在小鼠体内引起的免疫效应以及在抗弓形虫感染过程中的保护作用. 方法 以弓形虫RH 株cDNA作为PCR的模板扩增目的基因TgMAPK1,与真核表达载体pEGFP-C1连接,构建重组质粒pEGFP-MAPK1.pEGFP-MAPK1转染HEK293T细胞,通过荧光显微镜观察及Western blot检测其在真核细胞内的表达情况.将BALB/c雌性小鼠随机分成3组(PBS对照组、pEGFP-C1对照组和pEGFP-MAPK1实验组),大提质粒并免疫接种每组小鼠,ELISA检测每组小鼠在免疫接种前后血清抗体和脾细胞培养上清中细胞因子的变化.将弓形虫速殖子经腹腔注射入小鼠体内并每天记录小鼠的存活时间,评价该疫苗诱导产生的免疫保护效果. 结果 PCR扩增出约1 599bp的目的基因片段,重组真核质粒pEGFPMAPK1构建成功.重组质粒和空质粒转染的细胞在荧光显微镜下均可观察到绿色荧光,提取的细胞总蛋白经Western blot检出能与相应抗体反应的分子质量单位约为58×103 的目的蛋白.pEGFP-MAPK1免疫组小鼠较对照组能诱导产生更高水平的IgG(A值0.75～0.79)、IgG2a(A值0.65～0.71)和IFN-γ(725.67±23.25)pg/ml,差异有统计学意义(P ＜0.05),而IgG1、IL-4和IL-10各组间差异无统计学意义(P＞0.05).与对照组(6d)相比,pEGFP-MAPK1组小鼠(18 d)感染弓形虫后的存活时间显著延长(P＜0.05). 结论 TgMAPK1核酸疫苗能诱导小鼠产生较强的体液免疫反应和Th1型细胞免疫反应,表明该疫苗具有一定的抗弓形虫感染免疫保护作用,TgMAPK1蛋白可作为弓形虫疫苗候选抗原.
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编码弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)质粒DNA免疫小鼠诱导抗弓形虫感染的保护性
目的构建真核表达质粒pcGRA1,并观察其免疫小鼠的保护性. 方法经PCR从cDNA克隆中扩增出GRA1编码基因,定向克隆入pcDNA3的EcoRⅠ/XhoⅠ位点,从而获得pcGRA1.用限制性内切酶消化、PCR及序列测定对该重组质粒进行鉴定.将100 μg质粒于小鼠左后腿DNA肌注,于注射后2周和4周各加强1次;分别观察小鼠体内的特异性抗体滴度、GRA1基因在小鼠体内的分布、GRA1在肌细胞的表达以及免疫小鼠对弓形虫强毒株RH速殖子攻击后的保护性. 结果 DNA序列测定结果表明,将573 bp的GRA1编码阅读框定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ/XhoⅠ位点,成功构建了重组质粒pcGRA1;免疫小鼠血清中检测到特异性IgG;不同组织DNA为模板特异地扩增出GRA1编码基因;IFA检测pcGRA1免疫鼠肌细胞呈阳性反应;弓形虫RH株速殖子攻击感染pcGRA1免疫鼠,其存活时间长于对照组. 结论重组质粒pcGRA1免疫小鼠可诱导特异性免疫反应,对弓形虫强毒株的攻击感染具有一定的保护性.
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几种SARS DNA疫苗对BALB/c小鼠重要器官影响的组织病理学研究
目的用组织病理学方法观察几种SARS DNA疫苗对BALB/c小鼠重要器官的影响,为研制安全有效的SARS DNA疫苗奠定基础. 方法用RT-PCR的方法从SARS冠状病毒(SARS-CoV)基因组中扩增出M片段、E片段、N片段和S基因的两个主要片段S1, S2,然后将这些基因片段分别亚克隆至pVAC真核表达载体,制备出几种SARS DNA疫苗pVAC-S1、 pVAC-S2、 pVAC-M、 pVAC-E、pVAC-N.用这些疫苗分别或联合免疫BALB/c小鼠后,取小鼠重要器官心、肝、脾、肺、肾,观察其组织病理学改变. 结果鼠心、脾和肾未见明显的组织病理学异常,但部分小鼠的肝和肺表现出下列病理变化:肝:出现片状肝细胞染色加深和肝细胞核固缩等凋亡早期改变,部分还可见到肝细胞水变性和肝窦变窄甚至消失等病变.肺:肺泡隔增厚,肺泡轮廓消失,或肺组织淤血水肿,甚至出现支气管肺炎改变.同时,在pVAC空质粒对照组也可见个别小鼠出现上述肝、肺病变. 结论由于对肝、肺产生组织病理学异常改变,制备高效、安全的SARS DNA疫苗还有待进一步研究和完善,载体的选择和质粒的用量也是必须加以考虑的问题.
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弓形虫主要表膜抗原SAG2 DNA疫苗的免疫保护作用研究
目的观察弓形虫pVAX1-SAG2真核重组质粒的免疫保护作用,为弓形虫病的免疫预防提供理论及实验依据. 方法大量制备重组质粒,免疫小鼠,3周后同量加强免疫1次, 5周后无菌取小鼠脾脏,制备脾细胞,用MTT法测定淋巴细胞转化率;用免疫荧光法测定CD4+、CD8+细胞.用弓形虫RH株速殖子经皮下注射攻击感染,每只鼠接种0.1 ml (约含1000个虫体) ,观察小鼠存活情况. 结果对小鼠的脾脏T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+进行分析,与对照组比较,免疫组小鼠CD4+细胞显著增多(P<0.05);而CD8+细胞数各组之间差异无显著性(P>0.05);淋巴细胞转化率各组间差异无显著性(P>0.05);攻击感染后, pVAX1-SAG2免疫组小鼠平均存活(7.8±1.8) d,与对照组比较显著延长(P<0.05). 结论弓形虫pVAX1-SAG2真核重组质粒能在组织内表达,并诱导小鼠产生细胞免疫反应.
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日本血吸虫Rho GTPase DNA疫苗及重组蛋白疫苗免疫保护机制初探
目的初步探讨日本血吸虫中国大陆株pcDNA3.1-SjRho GTPase DNA疫苗、重组蛋白疫苗以及联合疫苗免疫的保护机制. 方法将pcDNA3.1-SjRho GTPase DNA疫苗、重组蛋白疫苗分别及联合疫苗免疫昆明鼠后,分不同时间采集血清,以ELISA法测定总抗体及IgG亚类. 结果重组蛋白疫苗及联合疫苗诱导产生的抗体效价较高,DNA疫苗及联合疫苗诱导产生的抗体以IgG2a为主,重组蛋白疫苗诱导产生的抗体以IgG1为主. 结论 Sj-Rho GTPase基因DNA疫苗及联合疫苗主要诱生Th1型细胞免疫应答,重组蛋白疫苗主要诱生Th2型体液免疫应答.
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乙型脑炎疫苗研究概况
乙型脑炎是由乙型脑炎病毒引起的具有高致死率的疾病,其病原体是黄病毒科黄病毒属成员,它感染的脊椎动物物种广泛.人类感染乙型脑炎病毒后严重影响中枢神经系统的疾病.本文着重概述了乙型脑炎病毒的分子生物学结构特点及其当前分子生物学技术条件下乙型脑炎疫苗的研究进展.
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结核新疫苗研究进展
结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引起的一种人畜共患传染病.近年来随着结核分枝杆菌多重耐药性菌株(MDR)的增多和艾滋病的流行,结核病死灰复燃,如何有效控制和预防结核病的发生显得尤为重要.卡介苗(BCG)仍是目前人类普遍使用的抗结核疫苗,但其免疫预防效果不甚理想,因此研究新型结核疫苗迫在眉睫,本文就近年来抗结核新疫苗研究的新进展作一综述.
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弓形虫病核酸疫苗研究进展
弓形虫病防制策略之一是研制安全有效的疫苗.弓形虫速殖子表面膜蛋白、棒状体蛋白、致密颗粒蛋白和微线体蛋白是重要的弓形虫抗原,这些抗原物质与弓形虫的侵袭性有关,且能诱导宿主的免疫反应.本文就近年来弓形虫病核酸疫苗研究现状作一综述.
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人B细胞淋巴瘤独特型DNA疫苗诱导抗肿瘤免疫反应的实验研究
本研究目的在于探讨含人B细胞淋巴瘤免疫球蛋白重链可变区基因片段的DNA疫苗诱导小鼠抗肿瘤免疫反应的情况,为人B细胞淋巴瘤疫苗的应用提供基础实验研究资料.本研究通过PCR方法获得人B细胞淋巴瘤细胞系Namalwa膜表面免疫球蛋白重链可变区(VH)基因片段,同时克隆小鼠单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3)作为免疫佐剂分子,进一步以重组PCR的方法获得MCP-3和VH基因的融合基因片段,构建DNA疫苗重组质粒.在体外以瞬时转染的方法证实以融合基因片段作为抗原基因的DNA疫苗质粒能够在真核细胞中正确表达.DNA疫苗质粒大量提取后免疫小鼠,用流式细胞术检测小鼠抗体生成情况,并用LDH释放法测定CTL活性以检测抗独特型细胞免疫.结果表明,从接种疫苗第8周开始小鼠体内特异性抗独特型抗体明显升高,并且抗体滴度可维持高水平至少至第20周.在DNA疫苗免疫组中5只免疫小鼠有3只产生抗体.所诱导的抗体只特异性识别肿瘤细胞表面独特型抗原,而不识别人A549对照细胞.用乳酸脱氢酶释放法未测到明显CTL反应的产生.结论:以MCP-3与VH的融合作为抗原基因构建的DNA疫苗能够诱导小鼠体内产生抗淋巴瘤细胞的特异性抗独特型抗体,为DNA疫苗临床用于人B细胞淋巴瘤治疗提供了初步实验支持.
关键词： B细胞淋巴病 DNA疫苗 免疫球蛋白重链可变区(VH) 抗肿瘤免疫反应 -
DNA疫苗非病毒载体的研究进展
DNA疫苗(DNA vaccine)又称为核酸疫苗或基因疫苗,是将编码特异性抗原的基因构建在表达性质粒中,经某种方法导入体内后,利用宿主细胞表达系统合成相应的病原体蛋白,诱导机体产生免疫应答以达到预防和治疗疾病的目的.DNA疫苗自1990年发现以来,因具有良好的安全性及可诱导广泛的体液免疫和细胞免疫,已越来越受到人们的关注,是继减毒疫苗、基因工程疫苗之后的第三代疫苗,在人和动物的各种细菌性疾病、病毒性疾病、寄生虫病及肿瘤性疾病等领域发挥作用.
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表达HIV-1 gag-pol△和gp 140 TM蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及免疫效果研究
目的构建表达人免疫缺陷病毒Ⅰ型gag-pol△和gp140TM基因的非复制型重组腺病毒.方法首先将HIV-1的gag-pol△和gp140TM基因插入穿梭载体,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E.coli BJ5183,获得重组子.转化293细胞后获得重组病毒.重组腺病毒与DNA疫苗联合免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清中的抗体.结果获得两株重组腺病毒vAd-gag-pol△和vAd-gp140TM,能正确表达Gp140TM、Gag蛋白以及经剪切加工的P24蛋白,与DNA疫苗联合免疫小鼠后能产生高滴度的HIV-1特异性的抗体.结论成功构建了表达HIV-1结构基因的重组腺病毒,能有效诱导HIV-1特异性抗体.
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壳聚糖-pJME/GM-CSF纳米免疫原肌注BALB/c鼠所致树突状细胞分布与功能变化
壳聚糖是一种来源广泛、价格低廉、具有良好生物相容性及降解性、安全无毒的阳离子天然高分子聚合物,以纳米颗粒或微球形式与DNA结合后形成聚电解质复合体,后者可优化DNA疫苗的免疫效果.研究证实壳聚糖是一种有效介导DNA疫苗进行皮肤及黏膜免疫的载体物质.
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HPV16型E7C亚基因与共激活分子B7-1协同诱导E7特异性CTL研究
目的 利用去除E7的转化活性而保留其抗原性的E7C亚基因研制防治HPV16相关疾病的疫苗,并进一步探索利用B7-1研制更佳活化细胞免疫的加强疫苗. 方法 用PCR方法扩增获得E7C后,插入真核表达质粒获得pLNCE7C,体外真核细胞中证实其具有表达能力后,在C57BL/6小鼠后腿肌肉内直接进行裸DNA接种免疫,或与pLNCmB7-1联合免疫接种,用51Cr释放法体外分析经免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性. 结果 经免疫小鼠获得较好的E7特异性CTL活性;若E7C与小鼠B7-1的表达质粒联合接种,则活性明显得到加强. 结论 E7C可以用于HPV16 DNA疫苗研制,B7-1具有推广应用价值.
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ICAM-1基因修饰的日本脑炎DNA疫苗诱导BALB/c鼠脾脏树突状细胞功能的研究
细胞间黏附分子-1( intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)在基因疫苗方面已有研究报道，有学者研究表明ICAM-1能提供给T细胞共刺激信号，并且证实该刺激信号通路独立于CD86介导的T细胞活化的第二信号通路。
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细胞因子GM-CSF对犬透明带3 DNA疫苗免疫小鼠抗生育效果的研究
目的 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)作为免疫佐剂,能够影响犬透明带3(CZP3) DNA疫苗的免疫效果,有助于研制有效降低流浪犬生育的犬透明带3 DNA疫苗.方法 采用RT-PCR和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,分析GM-CSF对小鼠肌肉注射部位的抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APCs)成熟和富集的影响.然后通过电脉冲刺激小鼠肌肉,将分子佐剂pcDNA3-GM-CSF与DNA疫苗pcDNA3-CZP3单独或联合免疫接种雌性BALB/c小鼠.ELISA方法检测了小鼠血清和生殖道中抗体IgG和sIgA(secretary IgA)的水平以及血清中IL-4和IFN-γ的含量,MTT方法检测小鼠脾脏T细胞的增殖,间接免疫荧光验证血清中CZP3抗体与小鼠卵细胞结合的能力,抗生育实验分析免疫不育效果.结果 GM-CSF与pcDNA3-CZP3共免疫小鼠能够显著促进CD80、CD83和CD86的表达,促进pcDNA3-CZP3免疫接种小鼠血清中IgG和生殖道中sIgA抗体水平的显著升高(P<0.01).免疫小鼠的IL-4和IFN-γ的含量均显著增加(P<0.05),MTT法证明脾脏T细胞增殖显著(P<0.05),间接免疫荧光结果表明小鼠卵细胞表面的荧光强度和致密度与免疫组血清中抗体的水平成正相关,抗生育实验表明GM-CSF显著性(P<0.05)地降低DNA疫苗pcDNA3-CZP3免疫小鼠的产仔数目.结论 GM-CSF作为免疫佐剂能够显著增强犬透明带3 DNA疫苗的免疫不育效果,可以作为增强犬透明带3 DNA免疫不孕疫苗的有效佐剂.
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重组Derp2变应原诱导小鼠变态反应气道炎症动物模型的建立
目的建立重组屋尘螨Derp2变应原(rDerp2)诱导的小鼠变态反应气道炎症动物模型. 方法在大肠杆菌中诱导表达Derp2重组蛋白,用镍亲和柱层析法提纯重组蛋白;32只BALB/c小鼠随机分为屋尘螨粗浸液组(A组)、屋尘螨粗浸液+rDerp2组(B组)、rDerp2组(C组)、对照组(D组).分别观察肺组织病理变化与支气管肺泡灌洗液(BLAF)中细胞学变化,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定BLAF中和脾细胞培养上清IL-4与INF-γ变化,ELISA测定血清中IgE、IgG1与IgG2a 抗体变化. 结果成功表达、纯化Derp2重组蛋白;A、B、C组肺部病理改变呈现明显的变态反应性炎症;A、B、C组小鼠BALF中的细胞总数、淋巴细胞、中性粒细胞数和EOS计数显著高于D组(P＜0.01);A、B、C组BALF中IL-4含量分别为(109.35±16.46) pg/ml、(88.87±5.66) pg/ml、(85.59±6.05) pg/ml,与D组(23.17±2.67) pg/ml相比差异有统计学意义(P均＜0.01).A、B、C组抗原特异性IgE抗体分别为0.49±0.04、0.41±0.02、0.37±0.04,与D组(0.03±0.01)相比差异有统计学意义(P均＜0.01);A、B、C组小鼠脾细胞分泌IL-4分别为(266.20±19.18) pg/ml、(252.72±15.81) pg/ml、(243.62±19.07) pg/ml,与D组(15.99±1.56) pg/ml相比差异有统计学意义(P均＜0.01). 结论用rDerp2能成功建立小鼠变态反应气道炎症动物模型.
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新疆出血热病毒糖蛋白Gc不同区段抗原DNA疫苗诱导小鼠的免疫应答
目的 构建新疆出血热病毒(Xinjiang hemorrhagic fever virus,XHFV)糖蛋白两个区段抗原的DNA疫苗,并观察其免疫应答效果.方法 分别将XHFV YL04057株糖蛋白Gc上的两个抗原区段GcⅠ(1 229~1 349 aa)和GcⅡ(1 443~1 566 aa)编码的DNA序列插入真核表达载体pVAX1中,构建真核质粒pVAX1-GcⅠ和pVAX1-GcⅡ;经酶切和测序鉴定,质粒免疫小鼠,通过T细胞增殖试验、细胞因子含量测定和ELISA法检测抗体对其诱导的免疫应答效果进行评价.结果 经双酶切鉴定和测序证实重组质粒构建正确;实验组小鼠IgG产生水平与pVAX1对照组相比有明显升高;pVAX1-GcⅠ和pVAX1-GcⅡ免疫组小鼠血清中的抗体效价均高于1:3 200;pVAX1-GcⅡ免疫组的小鼠脾脏T淋巴细胞增殖明显,IFN-γ的表达水平也高达160.27 pg/ml,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01).结论 成功构建XHFV糖蛋白两个区段抗原DNA疫苗,靶抗原在体内可有效表达;各免疫组均激起了较强的体液免疫及细胞免疫应答,pVAX1-GcⅡ实验组免疫原性和免疫效果较好,可将其作为新疆出血热病毒的候选疫苗.
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HIV-1C亚型nef基因构建的DNA质粒诱导小鼠免疫反应的研究
目的 构建表达中国流行株HIV-1C亚型调控nef基因的重组质粒pVAX-nef,并免疫BALB/c小鼠,观察其免疫效果,为探索新型HIV DNA疫苗提供数据.方法 利用分子生物学技术,将nef基因克隆到pVAX,并在体外进行表达与鉴定.以纯化的Nef蛋白作为包被抗原,用ELISA检测其体液免疫反应,用ELISPOT检测其细胞免疫反应.结果 重组质粒pVAX-nef成功构建.接种小鼠后2周,ELISPOT结果显示产生了针对HIV特异的CD4和CD8细胞抗原表位的免疫应答,且与免疫剂量存在一定的正相关性.ELISA实验诱导产生了抗HIV-1特异性抗体,其中40 μg免疫组诱导的抗体水平高.结论 重组质粒pVAX-nef免疫小鼠后可有效地诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应.
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登革1～4型病毒prM-E基因的双价和四价重组质粒DNA在小鼠中的免疫原性观察
目的在鼠模型中观察登革(DEN)病毒双价和四价重组质粒DNA的免疫原性,为登革多价DNA疫苗的研究奠定基础.方法采用可去除内毒素的试剂盒大量提取质粒DNA.将双价质粒DNA及将它们配伍后再与鼠源GM-CSF进行联合免疫,免疫途径采用肌肉注射,并加以电刺激,以提高质粒DNA的摄入效率.于初次免疫后第2和4周各加强免疫1次.然后在小鼠中分别测定针对登革1～4型病毒的体液和细胞免疫应答水平.采用间接免疫荧光法和中和试验测定血清抗体效价,细胞免疫应答水平通过测定脾淋巴细胞的增殖指数和其分泌的IFN-γ浓度进行评价.细胞浸润实验通过对免疫部位的肌肉进行HE染色确定.结果小鼠在初次免疫后第4周即开始产生针对DEN1～4型病毒的抗体,随着时间的延长,抗体效价逐渐上升.第14周中和抗体效价高达1∶32.淋巴细胞的刺激指数及其分泌IFN-γ的浓度均显著高于对照组.GM-CSF对体液免疫应答有促进作用,但对细胞免疫应答无显著的促进作用.结论本研究所构建的双价和四价重组质粒DNA在鼠模型中具有较好的免疫原性,这为登革多价DNA疫苗的研究奠定了基础.
关键词： 登革病毒 DNA疫苗 免疫原性 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 -
修饰后中国山东地方株HPV16 E6E7基因的转化活性检测及免疫原性研究
目的利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6E7基因, 研制HPV16 DNA疫苗. 方法定点突变E6的终止密码,并保证E7读码框架不变;定点突变E7蛋白的Rb结合区中对其转化活性维持起关键作用的第24位氨基酸.突变修饰后的基因命名为fmE6E7.PCR扩增fmE6E7,重组入pLNCX载体,脂质体法转染3T3细胞,免疫荧光组织化学及Western blot检测转染细胞蛋白的表达.经软琼脂集落培养法和BALB/c裸鼠皮下接种法检测fmE6E7的转化活性.然后PCR扩增fmE6E7,构建pVR1012-fmE6E7真核表达质粒,于C57BL/6小鼠肌肉内直接进行裸DNA免疫,51Cr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性,间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体. 结果测序证实获得了预期的突变结果.pLNCX-fmE6E7转染细胞体外软琼脂培养3周未见集落形成;裸鼠皮下接种2月后未见移植瘤形成(0/3).免疫鼠获得了较好的E7特异性的抗体E和抗原特异性的CTL. 结论修饰后E6E7基因可融合表达,转化活性消除的同时还可诱发特异的细胞免疫和体液免疫,表明中国山东地方株的E6E7基因可作为HPV16治疗性DNA疫苗的靶基因.
