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不同DNA疫苗联合接种可有效增强免疫效果
选择乙型肝炎(乙肝)病毒核心抗原(HBcAg)、e抗原(HBeAg)及单纯疱疹病毒gD抗原(HSV-1-gD)基因为目的基因,进行DNA疫苗联合免疫的研究.通过对不同基因片段的表达研究,选择了能在哺乳动物细胞中高效表达乙肝病毒核心抗原、e抗原和单纯疱疹病毒gD抗原的质粒DNA免疫Balb/c小鼠.结果显示:表达乙肝病毒核心抗原和单纯疱疹病毒gD抗原的DNA疫苗单独免疫,能有效刺激机体产生体液免疫和细胞免疫,二者的联合免疫明显加强了这种免疫效果,并可以使乙肝核心抗体提前出现.但表达乙肝病毒e抗原和单纯疱疹病毒gD抗原的DNA疫苗联合免疫则加强作用不明显.这些结果表明:不同DNA疫苗的适当组合有可能在获得多价疫苗的同时,提高DNA疫苗的免疫效果.
关键词： DNA疫苗 免疫增强 多价疫苗:HBcAg HBeAg HSV-1-gD -
免疫刺激复合物(ISCOM)介导的传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因免疫的研究
将传染性法氏囊病病毒(IBDV)ZJ2000株的多聚蛋白(VP2/VP4/VP3)基因插入pCI质粒的CMV启动子下游,构建了真核表达质粒pCI-VP2/VP4/VP3,在Lipofectin介导下转染Vero细胞进行了多聚蛋白的瞬时表达.以免疫刺激复合物(ISCOM)为佐剂制备DNA疫苗,进行不同免疫剂量间、不同免疫途径间、一次免疫和二次免疫间的效果对比试验.结果表明:以肌内和皮内联合免疫法效果好,而口服和点眼等途径未能诱导足够的免疫反应;大于200μg的剂量DNA疫苗才能产生良好的免疫力;二次免疫的效果明显优于一次免疫.与常规的弱毒疫苗B87和D78相比,DNA疫苗产生中和抗体的潜伏期长、效价相对较低,对强毒攻击的保护率相当.本试验还证实,免疫刺激复合物具有明显提高DNA疫苗免疫效果的作用.DNA疫苗能诱导产生保护性反应,为今后IBD疫苗的研究开创了一条新的途径.
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Semliki森林病毒衍生的DNA疫苗与常规DNA疫苗的比较
比较Semliki森林病毒(SFV)衍生的复制型DNA疫苗载体(复制型载体)和常规非复制型DNA疫苗载体(非复制型载体)的导入效率、表达效率、诱导凋亡率和免疫效果,从而评价其作为DNA疫苗载体的应用前景.使用等量SFV载体和常规DNA载体同等效率转染细胞后,复制型载体表达强度比非复制型载体高约3倍,其诱导凋亡的能力是非复制型载体的11倍;以不同剂量的SFV载体和常规DNA载体分别转染BHK21细胞,复制型载体各剂量组载体的表达量均高于非复制型载体.复制型载体在1μg组出现峰值,而非复制型载体则出现在4μg组.体内免疫的结果表明,SFV载体pSCA-SS1免疫的各组小鼠中,低剂量1μg组小鼠的总抗体滴度高于10μg和100μg剂量组;1μg pSCA-SS1免疫的小鼠产生的总抗体滴度与CTL水平,分别与pcDNA3-SS1免疫的小鼠中10μg和100μg组相当.但10μg、100μg组pSCA-SS1免疫小鼠的总抗体及CTL水平,都低于pcDNA3-SS1免疫的小鼠的10μg、100μg组.结果提示:SFV衍生的复制型DNA疫苗载体,在低剂量组时即可诱生与常规DNA疫苗载体高剂量组相近的免疫效果.
关键词： DNA疫苗 Semliki森林病毒 复制子 凋亡 -
IL-12增强HBV融合抗原DNA疫苗在小鼠诱导的细胞免疫应答
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)极易形成慢性感染,主要机制在于感染者不能产生强有力的细胞免疫应答以清除病毒[1].慢性HBV感染者体内虽然存在HBV抗原特异性T淋巴细胞,但对HBV抗原的反应性较低.研究发现,增强这类T淋巴细胞的反应性,可以促进HBV的清除[2].
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人巨细胞病毒DNA疫苗免疫效果的初步研究
人巨细胞病毒(HCMV)是广泛感染人类的重要病原体之一,在人群中有较高的感染率,胎儿、婴儿、器官移植及免疫缺陷者等更易感染.现有的抗HCMV药物治疗及被动免疫由于毒性大、价格昂贵及短效性等原因,应用大受限制,为此研制安全、有效的疫苗即成为防治HCMV疾病的重要手段.HCMV具有潜在的致癌作用,不宜发展活疫苗或含完整病毒DNA的死疫苗;亚单位疫苗虽然比较安全,但所用抗原不能在宿主细胞内表达,只能诱导体液免疫,这对于胞内感染的HCMV预防效果较差;通过新佐剂的应用,虽可引发细胞免疫,但免疫原性较差,且成本较高.因此,目前倾向于研制具有免疫原性的HCMV DNA疫苗.
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分泌型CTLA-4融合恶性疟原虫核酸疫苗联合GM-CSF增强小鼠免疫反应
目的 研究分泌型细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)融合恶性疟原虫核酸疫苗联合粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)免疫对小鼠体液免疫和细胞免疫反应的影响.方法 将疟原虫抗原编码序列与小鼠CTLA-4胞外区序列拼接构建真核表达载体VR1012-sES312-CTLA,用Western blot检测转染HEK293细胞上清液蛋白表达.VR1012-sES312-CTLA和小鼠GM-CSF的真核表达载体共同电穿孔法免疫 Balb/c小鼠,ELISA检测疟疾疫苗特异性抗体IgG效价以及ELISPOT方法分析细胞因子IFN-γ和IL-4的表达水平.结果 疟疾DNA疫苗体系中引入CTLA-4分子以及GM-CSF佐剂能显著增强疫苗的特异性免疫反应.VR1012-sES312-CTLA+GM-CSF联合免疫小鼠,抗体滴度比单纯的疟疾DNA疫苗VR1012-ES312相比提高190倍(P<0.001).结论 将疟疾DNA疫苗改造为树突细胞靶向型,并在免疫体系中引入GM-CSF分子佐剂,显著增强了小鼠体液和细胞免疫效力.此结果为有效提高疟疾DNA疫苗免疫应答水平提供了新的思路.
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人乳头瘤病毒16型修饰后E6E7基因免疫原性增强
利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus type 16, HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7), 研制治疗HPV16 相关疾病的DNA疫苗.用PCR扩增fmE6E7基因后,插入真核表达质粒获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠后腿肌肉进行裸DNA免疫,51Cr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性(cytotoxic T lymphocyte, CTL),间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体.研究表明修饰后的中国地方株E6E7融合基因可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,与单独野生型E7基因免疫相比,E6E7融和基因可更好的活化CTL反应.表明修饰后消除转化活性的中国地方株E6E7融合基因可作为HPV16治疗性DNA疫苗的靶基因.
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埃博拉病毒包膜蛋白GP基因DNA疫苗诱导小鼠产生高滴度中和抗体
目的 探讨埃扎伊尔-埃博拉病毒(Zaire Ebolavirus)包膜蛋白(GP)DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体的特性及研制埃博拉病毒DNA疫苗的可行性.方法 构建埃博拉病毒包膜蛋白GP真核表达质粒Peak13CD5LGP,采用100μg剂量的质粒免疫小鼠,以纯化的埃博拉病毒包膜蛋白亚单位融合蛋白(GP1-Fc)作为抗原,通过ELISA检测及Western blot验证测定血清抗体滴度及特异性.结果 100μg质粒免疫小鼠3次后,小鼠血清中GP中和抗体滴度达到1:2 000.结论 编码埃博拉病毒包膜蛋白GP的DNA疫苗(pEAK13CD5LGP)能够诱导小鼠产生高滴度和持久的中和抗体,作为埃博拉病毒疫苗具有潜在的应用价值.
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治疗性HPV DNA疫苗的研究进展
HPV感染与宫颈癌的发生密切相关.治疗性HPV DNA疫苗可以治疗HPV感染,进而阻断由HPV引起的宫颈癌前病变.基于HPV及DNA疫苗的深入研究,研究者通过不同方法来改进治疗性HPV DNA疫苗,以期在不久的将来能应用于临床.
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热休克蛋白70融合肿瘤抗原基因的DNA疫苗研究进展
在抗肿瘤免疫治疗中,已经发展了多种形式的热休克蛋白70(HSP70)相关治疗性疫苗,这些疫苗主要包括蛋白疫苗、肽疫苗、细胞疫苗及DNA疫苗等,其中HSP70融合DNA疫苗凭借其自身的优势引起人们的关注.它不但可诱导高效、持久的抗肿瘤免疫应答,而且可以维持免疫记忆.本文就HSP70在肿瘤治疗性DNA疫苗中的作用和应用作一综述.
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日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗的免疫保护效果研究
目的:观察已构建日本血吸虫大陆株31kDa组织蛋白酶B DNA疫苗VR1012-Sj31及VR1012-SjGST-Sj31在BALB/c小鼠体内的免疫保护效果.方法:用纯化的空白质粒载体VR1012、重组质粒VR1012-Sj31及VR1012-SjGST-Sj31于股四头肌注射免疫BALB/c鼠:将36只6～8周龄BALB/c鼠随机分为3组,每组12只,对照组(A组)注射空白质粒载体VR1012,B组注射重组质粒VR1012-Sj31,C组注射重组质粒VR1012-SjGST-Sj31.质粒剂量均为100 μg,每隔2周免疫1次,共免疫3次,第3次免疫后第21天,每只鼠经腹部感染10条尾蚴,42天后剖杀计数各小鼠成虫数和每克肝卵数,观察诱导产生的减虫和减卵效果,并用ELISA分析小鼠血清中的抗体.结果:ELISA分析表明,第3次免疫后小鼠出现特异性IgG抗体.与空白质粒对照组比较,2个实验组的减虫率分别为25.0%及30.0%(P<0.05),肝组织减卵率分别为54.90%及69.74%(P<0.001),每雌肝减卵率分别为47.96%、54.62%(P<0.001).与B组相比,C组的肝组织减卵率为32.92%(P<0.001),每雌肝减卵率为12.79%(P<0.05).结论:DNA疫苗VR1012-Sj31和VR1012-SjGST-Sj31能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用,二价疫苗的保护效果要大于单价疫苗.
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弓形虫gra14基因真核表达载体的构建及其免疫保护性研究
构建弓形虫致密颗粒蛋白14 (GRA14)的真核表达质粒,研究其对小鼠的免疫保护力.扩增弓形虫RH强毒株gra14基因并构建pVAX1-gra 14真核表达质粒,免疫BALB/c小鼠.60只小鼠随机分成4组,实验组小鼠肌肉注射100 μg pVAX1-gra14质粒,对照组分别注射PBS(100 μL/只)和pVAX1空质粒(100μg/只),空白对照不作处理.共免疫3次,每次间隔14d.ELISA法检测免疫后IgG、亚型抗体和细胞因子水平.攻击实验后比较小鼠生存率,分析pVAX1-gra 14的免疫保护作用.结果显示成功扩增gra14基因并构建真核表达载体,Western blot结果显示目的基因成功表达并具有反应原性,pVAX1-gra14免疫后小鼠的IgG抗体水平显著升高,IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的表达量分别为652.47±14.55、455.53±7.88、228.13±14.51和252.13±14.20 pg/mL,同时免疫后实验组小鼠的生存时间相比对照组显著延长,平均生存时间为14.1 ±1.3 d.以上结果表明,pVAX1-gra14能够诱导特异细胞免疫和体液免疫反应,产生一定的免疫保护作用.
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猪囊虫DNA疫苗pEP1的生物安全性研究
猪囊虫核酸疫苗pEP1能在猪体内产生较高滴度的保护性抗体,具有较高的免疫保护率,本研究就核酸疫苗pEP1的生物安全性问题进行了深入探讨.首先,将核酸疫苗pEP1以肌注方式免疫仔猪,分别于接种后1天、7天、4周、8周分离各组织,提取组织总DNA,利用PCR技术分析质粒DNA在各组织的分布.研究发现,在疫苗接种后第1天几乎所有组织都能检测到质粒DNA,随着时间的延续,仅在注射部位检测到质粒的存在,说明肌注DNA疫苗在注射部位以外组织中很快被清除.其次,对残存质粒的注射部位组织进行细胞基因组整合可能性分析,并未发现质粒DNA整合入宿主细胞基因组中.同时采集猪舍周围样品,PCR法分析DNA疫苗上的CMV启动子基因、抗性基因和抗原表位基因在环境中发生转移和扩散的可能性,结果显示疫苗质粒并没有转化整合环境细菌.因而我们认为该猪囊虫核酸疫苗对猪体和环境都是安全的,具有很好的应用前景.
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微小隐孢子虫Cpgp40/15基因DNA疫苗表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达
将微小隐孢子虫Cpgp40/15基因定向克隆到真核表达载体pVAX1中多克隆位点XbaⅠ和PstⅠ之间,经酶切鉴定,构建真核表达重组质粒pVAX1-Cpgp40/15,用脂质体介导法将其转染Hela细胞,并用G418加压筛选,后经SDS-PAGE和Western blot方法检测外源基因Cpgp40/15的表达情况,得到预期大小的蛋白带,表明该重组质粒能够在哺乳动物细胞中较好地表达.
关键词： 微小隐孢子虫 Cpgp40/15基因 DNA疫苗 -
日本血吸虫DNA疫苗proVAX/GMCSF-SjFer的构建及免疫保护性效果的观察
目的 构建日本血吸虫铁蛋白proVAX/GMCSF-SjFer DNA疫苗,观察其诱导小鼠产生抗攻击感染的免疫保护性效果. 方法 小量制备pGMC/SjFer重组质粒DNA,PCR扩增GMCSF-SjFer基因,将此目的 片段亚克隆到真核表达载体proVAX中,构建重组真核表达质粒proVAX/ GMCSF-SjFer.雌性昆明鼠随机分为对照组、免疫组和空质粒组.空质粒组小鼠股四头肌注射proVAX,免疫组同法注射重组质粒proVAX/GMCSF-SjFer,对照组注射生理盐水.按0、2、6周设计接种3次.末次接种后第2周,感染血吸虫尾蚴(40±2)条/鼠.感染后第42 d剖杀小鼠,灌注法冲虫,计数虫荷和克肝卵数.免疫前和免疫后2周留取小鼠血清,用ELISA法检测抗血吸虫成虫抗体水平. 结果 经PCR和双酶切鉴定,获得1条约为960 bp的目的 片段和2条酶切片段.免疫组小鼠的减虫率及减卵率分别为22.46%和29.40%,空质粒对照组分别为3.11%和7.79%,差异有统计学意义(P<0.05).ELISA检测免疫组小鼠血清特异性IgG抗体水平增高. 结论 构建的DNA疫苗proVAX/GMCSF-SjFer能诱导小鼠产生一定水平的保护性免疫.
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约氏疟原虫SAP1重组DNA疫苗的构建及鉴定
目的 构建含有约氏疟原虫SAP1(sporozoite asparagine-rich protein 1)截短基因的重组DNA疫苗,并进行鉴定. 方法 应用生物学信息软件预测分析并扩增SAP1截短基因,将该基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达载体pcDNA3.1(+)/SAP1.将重组载体转染COS-7细胞,进行体外瞬时表达并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定. 结果 成功扩增SAP1截短基因并构建含有该基因的真核表达载体pcDNA3.1 (+)/SAP1,其体外瞬时表达产物能与多克隆抗血清发生特异性结合反应. 结论 构建的重组DNA疫苗可在哺乳动物细胞中瞬时表达,表达的蛋白具有免疫反应性,其免疫保护作用有待进一步研究.
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恶性疟原虫复合抗原DNA疫苗诱导小鼠的细胞免疫及体液免疫应答
目的观察用恶性疟原虫复合抗原基因HGFSP构建的DNA疫苗pc-HGFSP免疫小鼠诱导的细胞及体液免疫应答. 方法用pc-HGFSP肌注免疫C57BL/6小鼠并加强免疫2次,取小鼠脾淋巴细胞及血清测定:脾淋巴细胞增殖活性(MTT法);NK细胞活性和CTL活性(LDH法);脾脏CD4+及CD8+T细胞亚群(免疫荧光法);血清pc-HGFSP抗原特异性抗体(ELISA法)及一氧化氮(NO)含量. 结果与pcDNA3对照比较,pc-HGFSP免疫小鼠脾淋巴细胞增殖活性增高24%～37%;NK细胞活性增高38%～90%;CTL活性增高65%～153%;CD8+ T细胞亚群增加.免疫血清产生HGFSP抗原特异性IgG抗体;NO含量也有所增高. 结论恶性疟DNA疫苗pc-HGFSP有一定的诱导小鼠细胞免疫和体液免疫应答的作用.
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弓形虫多表位抗原基因DNA疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护性研究
目的 以弓形虫多表位抗原基因DNA疫苗免疫小鼠,评价该疫苗对弓形虫感染产生的免疫保护作用.方法 利用PCR 技术和亚克隆技术,构建弓形虫多表位抗原基因真核表达重组质粒pcDNA3-MAG,以质粒纯化试剂盒大量制备质粒,同时分别以载体质粒pcDNA3和PBS液为空质粒对照和空白对照,与lipofectin按5∶2的比例混合后,经股四头肌注射免疫小鼠,间隔两周,连续免疫3次,通过检测小鼠血清中特异的IgG抗体、IFN-γ和IL-4含量,评价疫苗产生的体液免疫和细胞免疫水平.以强毒型RH株弓形虫感染免疫小鼠,统计小鼠的存活时间,评价疫苗产生的免疫保护性.结果 经双酶切及DNA 测序鉴定,所构建的重组质粒pcDNA3-MAG读码框架正确.与免疫前及载体质粒和空白对照组相比,小鼠免疫后产生特异性IgG抗体,并引发高水平IFN-γ.攻虫后,实验组较对照组小鼠存活时间明显延长.结论 弓形虫多表位抗原基因DNA能诱导BALB/c系小鼠产生特异的细胞免疫和体液免疫,对弓形虫感染可产生一定的免疫保护性.
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HCMV融合表达载体免疫效果的初步研究
目的 探讨含人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)AD169株gB680糖蛋白基因和突变的pp65基质蛋白基因(pp65m)DNA疫苗(pVAX1/gB680+pp65m)的免疫效果.方法 重组质粒pVAX1/gB680+pp65m转染COS-7细胞,用RT-PCR法和Western blot法检测瞬时表达产物;经碱裂解法大量提取质粒pVAX1/gB680+pp65m,经Sepharose 4FF柱层析纯化后免疫BALB/c小鼠(SPF),并通过ELISA法和脾淋巴细胞转化实验检测小鼠的体液免疫和细胞免疫应答效果. 结果 重组质粒pVAX1/gB680+pp65m能够在真核细胞中表达,表达蛋白的分子质量单位约为124 ku,且能被抗HCMV血清识别.用该重组质粒第2次免疫后第3 d受试小鼠开始产生抗HCMV抗体,第2次免疫后第8周,淋巴细胞转化试验SI值为1.951±0.112,对照组为1.095±0.060,差异有统计学意义. 结论 含HCMV AD169株gB680糖蛋白基因和突变pp65蛋白基因的DNA疫苗能诱导BALB/c小鼠产生一定强度的体液免疫和细胞免疫应答.
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结核分枝杆菌复苏因子D-DNA疫苗在小鼠抗感染中的免疫保护作用初探
目的 探讨结核分枝杆菌复苏因子D(RpfD)-DNA疫苗在BALB/c小鼠抗H37Rv感染中产生的免疫原性.方法 将90只SPF级BALB/c小鼠随机分为3组(每组30只),即RpfD疫苗免疫组、BCG免疫组、生理盐水对照组,分别以RpfD-DNA疫苗、BCG和生理盐水于0、3、6周共3次免疫小鼠,于第9周用结核分枝杆菌气雾感染小鼠.于第17周采集小鼠血清,应用ELISA方法检测RpfD抗体效价、IFNγ水平,ELISA检测脾淋巴细胞培养上清诱导的IFNγ、IL-12水平,采用CCK-8检测淋巴细胞增殖指数,LDH方法检测淋巴细胞CTL杀伤效应,并对小鼠肺组织菌荷量计数. 结果 RpfD疫苗免疫组小鼠血清RpfD抗体水平和IFNγ水平均显著高于生理盐水组对照组及BCG组(P＜0.05或P＜0.01).RpfD体外刺激培养小鼠脾淋巴细胞释放IFNγ水平RpfD疫苗免疫组显著高于其他组(P＜0.05);IL-12水平3组间差异无统计学意义(P＞0.05).RpfD疫苗免疫组淋巴细胞增殖指数和脾特异性CTL杀伤性显著高于其他组(P＜0.05).RpfD疫苗免疫组小鼠肺组织结核分枝杆菌CFU显著低于其他组(P＜0.05). 结论 RpfD-DNA疫苗可诱导小鼠产生免疫应答,具有免疫原性.
