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PML-RARα系列重组质粒在BALB/c小鼠体内表达分析
目的 检测PML-RARα融合基因疫苗在小鼠体内的转录和表达.方法 用成功构建的重组质粒(PML-RARα-hIL-2)免疫小鼠,于第0周、2周、4周在双侧股四头肌各注射1次,分离注射部位肌肉,用RT-PCR检测目的基因在小鼠骨骼肌中的转录;应用免疫组织化学染色法检测重组质粒蛋白表达.结果 小鼠注射部位肌肉中检测到PML-RARα及hIL-2基因的转录.并可检测到hIL-2蛋白的表达.结论 所构建的PML-RARα系列重组质粒可以在小鼠体内有效地表达基因产物,具有DNA疫苗的基本特性.
关键词： PML-RARα hIL-2 急性早幼粒细胞白血病 DNA疫苗 -
PML-RARα-hIL2 DNA疫苗免疫BALB/c小鼠后胸腺初始T细胞水平变化
目的 了解PML-RARα-hIL-2基因疫苗免疫小鼠后胸腺初始(na(I)ve)T细胞变化情况.方法 利用实时定量PCR检测小鼠胸腺组织DNA中T细胞受体删除DNA环(TRECs)的水平,从而评价小鼠胸腺中na(I)ve T细胞含量.结果 利用PML-RARα-hIL-2 DNA疫苗免疫小鼠后胸腺中所含的TRECs拷贝数明显高于单个基因疫苗PML-RARα或hIL-2组及对照组.结论 所构建的PML-RARα-hIL-2双表达质粒可诱导小鼠胸腺产生na(I)ve T细胞数量增加,可能与产生更强的细胞免疫应答有关.
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pIRES-PML-RARα-hIL-2重组质粒的构建和表达研究
目的 构建PML-RARa融合基因与人白介素-2(hIL-2)基因真核双表达质粒.方法 利用RT-PCR技术从NB4细胞的RNA中扩增出PML-RARα融合点附近的部分基因片段,通过RT-PCR扩增Jurkat细胞中的hIL-2基因,并分别将两基因片段连接到pIRES质粒的多克隆位点(MCS)A和B中,构建真核双表达质粒.利用酶切和序列分析方法验证所构建质粒的正确性.将构建成功的重组质粒转染A549细胞,通过RT-PCR检测重组质粒在真核细胞中的转录情况,利用点杂交、EUSA检测目的蛋白的表达情况.结果 Nhe I/Mlu I和Sal I/Not I双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARa基因片段及hIL-2基因,序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确.将所构建的pIRES-PML-RARα-hIL-2质粒转染A549细胞后经RT-PCR鉴定表明,插入到重组质粒中的PML-RARα和hIL-2基因能够在真核细胞中进行正常转录.经点杂交和ELISA检测显示重组质粒在真核细胞中可表达hIL-2蛋白.结论 成功构建了pIRES-PML-RARa-hlL-2质粒,该重组质粒能够在真核细胞中正常转录并表达PML-RARd和hIL-2蛋白.
关键词： PML-RARct hIL-2 急性早幼粒细胞白血病 DNA疫苗 -
PML-RARα-hIL-2 DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的细胞和体液免疫应答
目的 分析PML-RARα融合基因疫苗诱导小鼠特异体液和细胞免疫应答情况.方法 用成功构建的重组质粒(pIRES-PML-RARα-hIL-2)免疫小鼠后,分别利用ELISA法检测小鼠血清中INF-γ生成情况;LDH释放法检测小鼠脾细胞特异性CTL细胞针对APL细胞株NB4的杀伤率;用间接免疫荧光法检测血清中抗PML-RARa抗体.结果 免疫后第7周时,小鼠血清中INF-γ含量、抗PML-RARα抗体及脾脏CTL细胞针对NB4的杀伤率均高于对照组.结论 所构建的pIRES-PML-RARα-hIL-2重组质粒可诱导小鼠产生了特异性体液和细胞免疫应答.
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PML-RARα245-hIL-2双基因表达载体的构建和表达研究
目的:采用长度为245 bp的PML-RARα融合基因片段构建一种新的PML-RARα融合基因与人白介素-2(hIL-2)基因真核双表达质粒.方法:利用RT-PCR从NB4细胞的RNA中扩增出包含PML-RARα基因融合点的长度为245 bp的基因片段,通过RT-PCR从Jurkat细胞中扩增hIL-2基因,并将两基因片段分别克隆到pIRES质粒中,通过酶切和测序验证重组质粒的正确性.将重组质粒转染A549细胞,通过RT-PCR检测该质粒在真核细胞中的转录情况,利用点杂交和ELISA技术检测目的蛋白的表达.结果:Nhe L/Mlu Ⅰ和Sal Ⅰ/Not Ⅰ双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα融合基因片段和hIL-2基因,测序结果证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确.将构建的pIRES-PML-RARα245 -hIL-2质粒转染A549细胞后经RT-PCR鉴定表明,插入到重组质粒中的PML-RARα和hIL-2基因能够在真核细胞中进行正常转录并翻译出相应蛋白.结论:成功构建了含有245 bp的PML-RARα基因与hIL-2基因的真核双表达载体,该载体能够在真核细胞中正常转录并翻译出PML-RARα和hIL-2蛋白,为利用DNA疫苗治疗急性早幼粒细胞白血病提供了更丰富的资料.
关键词： PML-RARα融合基因 hIL-2 急性早幼粒细胞白血病 DNA疫苗 -
HIV-1中国流行株gag与hIL-2在重组痘苗病毒中的共表达及其与核酸疫苗的实验免疫研究
目的:将HIV-1中国流行株B亚型gag基因、gag和hIL-2基因在天坛株痘苗病毒中进行共表达,以期获得重组痘苗病毒,观察细胞因子的佐剂作用,与核酸疫苗混合免疫,评价免疫效果,为新型艾滋病疫苗研制开发打下基础.方法:将HIV-1中国流行株gag基因、gag和hIL-2基因片段插入到pJ38载体启动子下游,经同源重组和血凝素阴性空斑筛选重组痘苗病毒,SDS-PAGE、Western blot检测目的蛋白.以重组病毒和核酸疫苗免疫Balb/c小鼠,进行淋巴细胞转化实验、CTL、CD4+、CD+T细胞数目以及血清抗体的细胞免疫和体液免疫指标检测.结果:获得了重组痘苗病毒vJ38gag和vJ38gag-IL-2.与vJ38-gag相比,vJ38gag-IL-2,具有更好的免疫原性,重组痘苗病毒免疫3次的效果好于重组病毒免疫2次,以2rVV-DNA混合免疫效果好.结论:重组痘苗病毒vJ38gag和vJ38gag-IL-2能够表达外源蛋白并诱导机体产生细胞免疫和体液免疫.细胞因子IL-2发挥了免疫佐剂的作用.
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腺病毒介导hIL-2基因转染膀胱上皮的体内研究
目的:探讨腺病毒介导人IL 2基因转染鼠膀胱移行上皮细胞及其表达的可行性,为膀胱癌的免疫治疗提供实验依据.方法:通过膀胱灌注的方法将重组腺病毒AdhIL-2灌入大鼠膀胱内,分不同时间段获取大鼠膀胱黏膜组织,利用RT PCR的方法检测hIL-2基因在膀胱移行上皮细胞中的表达.结果:腺病毒介导hIL-2在膀胱移行上皮细胞中得到有效表达,基因表达持续时间达到7天.结论:腺病毒是一种有效介导基因的工具,hIL-2在膀胱上皮细胞中的持续表达为膀胱癌免疫治疗提供新的方法.
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融合基因mGM-CSF/hIL-2在肝癌细胞瘤苗特异性免疫治疗中的作用
背景与目的:手术切除是治疗肝癌的主要方法,但对其术后的复发转移却无更好的办法.近年来,免疫学的发展使肝癌的治疗有了更好的治疗方法.本研究旨在通过制备人白细胞介素2(hIL-2)与鼠粒.单核细胞集落刺激因子(mGM-csr)融合基因修饰的H22肝癌瘤苗,观察其特异性抗肿瘤免疫作用.方法:用含hIL-2与mGM-CSF融合基因的真核表达载体,在体外转染H22细胞,制成疫苗,皮下接种小鼠,同时建立荷瘤小鼠模型.用51Cr释放法测定瘤苗免疫组、空载组、未转染组小鼠脾细胞对亲本H22细胞的杀伤活性.取血检测血清中IL-10、IFN-у水平.观察小鼠存活期.结果:成功制备了含有hIL-2与mGM-CSF融合基因的H22肝癌瘤苗.免疫小鼠脾细胞体外对H22细胞的杀伤率为38.3%.显著高于对S180细胞的9.1%,以及空载组和未转染组的13.6%和7.5%(P＜0.05).转基因瘤苗免疫组血清IFN-у为(12.83±0.75)pg/mL,较空载瘤苗组的(7.83±0.65)pg/mL明显升高(P＜0.01),血清IL-10[(4.58±0.34)pg/mL]较空载瘤苗组的(8.15±0.28)pg/mL明显降低(P＜0.01).同时,转基因瘤苗免疫组小鼠存活期为(40±6)d,较对照组[空载瘤苗组(30±3)d,未转染组(19±4)d]明显延长.结论:转染hIL-2与mGM-CSF融合基因的同系肿瘤细胞瘤苗可激发特异性细胞介导的免疫反应,改善抗肿瘤免疫反应.延长荷瘤小鼠存活期.
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IL-2和IL-12联合基因治疗小鼠肝癌的实验研究
目的探讨瘤内注射共表达mIL-12和hIL-2质粒DNA抗小鼠肝癌皮下移植瘤的作用.方法构建pDC511hIL2-mIL12、pDC511mIL-12、pDC511hIL-2真核表达质粒载体;ELISA方法检测各组质粒在真核细胞的表达;小鼠肝癌H22皮下移植瘤瘤内注射各组质粒DNA后,检测不同时间血清中细胞因子浓度;观察各组小鼠存活时间,肿瘤大小变化;并检测各组小鼠脾脏细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)活性.对各治疗组在质粒DNA注射后一月进行瘤体组织学观察.结果酶切鉴定各组质粒载体,均示构建成功,并能在真核细胞内高效表达相应细胞因子.瘤内注射各组质粒载体后,pDChIL2-mIL12组在不同时间表达的hIL2和mIL12分别与pDC511hIL2 组(F=71.11,P<0.01)、pDC511mIL12组 (F=30.70,P<0.05)比较有显著性差异.mIL-12基因和hIL-2基因联合治疗组,肿瘤生长明显受抑制,疗效显著优于各单独治疗组和对照组(P<0.05),并且小鼠脾细胞CTL杀伤活性增强.双基因联合治疗组,病灶内肿瘤细胞坏死明显,炎性细胞广泛浸润.结论 IL-12、IL-2基因治疗可抑制小鼠肝癌H22皮下移植瘤的生长,提高机体的抗肿瘤免疫应答,两者联合运用可产生协同效应.为进一步运用高效基因导入技术进行肝癌基因治疗研究提供初步的实验依据.
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重组免疫毒素的纯化及鉴定
目的 构建能特异性杀伤银屑病皮损中T淋巴细胞的重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1.方法 应用PCR扩增目的基因片段hIL2-Luffin P1,然后克隆到表达载体pET32a(+)中,并对重组质粒进行酶切鉴定及基因测序.测序正确的重组质粒转化到表达菌BL21中,进行诱导表达.诱导表达正确的蛋白,经过蛋白的纯化、复性、脱盐、肠激酶酶切、再纯化,后用兔抗人IL-2多克隆抗体对目的蛋白进行Western blot鉴定.结果 构建了pET32a (+)-hIL-2-Luffin P1表达载体.后得到了表达正确的hIL2-Luffin P1蛋白.结论 重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1的成功构建为银屑病的治疗奠定了实验基础.
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HIV-1中国流行株gag-hIL-2重组痘苗病毒与pIRES-gag-hIL-2核酸疫苗联合免疫的实验研究
目的将HIV-1中国流行株B亚型gag和hIL-2基因在天坛株痘苗病毒中进行共表达,与核酸疫苗联合免疫,评价免疫效果,为新型艾滋病疫苗开发研制奠定基础.方法将HIV-1中国流行株gag-hIL-2基因片段插入到痘苗病毒载体pJ38启动子下游,经同源重组和血凝素阴性空斑筛选重组痘苗病毒,SDS-PAGE、Western blot检测目的蛋白.以重组病毒和核酸疫苗免疫BALB/c小鼠,进行淋巴细胞转化实验及血清抗体的细胞免疫和体液免疫指标检测.结果获得了重组痘苗病毒vJ38gag-IL-2,具有更好的免疫原性,3rVV效果好于2rVV,以2rVV-DNA混合免疫效果好.结论重组痘苗病毒vJ38gag-IL-2能够表达外源蛋白并诱导机体产生细胞免疫和体液免疫.
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重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-hIL-2的构建及病毒滴度测定
目的:构建重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-hIL-2,并测定病毒滴度.方法:从Jurkat细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-2基因全编码区序列.将测序正确的片段用Bgl II和Pme I双酶切定向插入到pAdBM5-GFP腺病毒载体中.通过磷酸钙共沉淀法将线性化重组质粒和腺病毒骨架共转染HEK293A细胞,扩增纯化重组腺病毒,TCID50法测定重组腺病毒滴度.结果:成功构建出表达hIL-2基因的重组腺病毒载体(pAdBM5-GFP-hIL-2),获得了高滴度表达hIL-2基因的重组腺病毒.结论:重组腺病毒表达载体(pAdBM5-GFP-hIL-2)的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肝癌的转基因治疗研究.
关键词： hIL-2 重组腺病毒载体 病毒滴度 pAdBM5-GFP
