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产前分子诊断研究进展
产前诊断是预防出生缺陷、提高人口质量的重要技术手段.产前分子诊断能有效提高产前诊断的准确率和特异性.荧光原位杂交技术、荧光定量PCR技术、多重连接依赖探针扩增技术等己广泛应用于产前分子诊断的临床实践工作中.近几年来,染色体芯片分析和下一代测序技术正快速进入产前分子诊断领域,并有望成为产前分子诊断中的一线诊断试验.将高通量基因组分析技术与传统分子诊断技术进行有机整合并应用于产前分子诊断,将积极推动产前诊断的快速发展.
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孕妇血浆游离胎儿DNA中缺失型α-地中海贫血的检测
本研究旨在建立一种孕早期、简便、快速且无创伤性的检测胎儿常见缺失型α-地中海贫血突变的单管多重PCR技术,用于α-地中海贫血的产前诊断.选择50例妊娠14-20周的贫血孕妇,采用gap-PCR方案设计4组PCR引物单管多重PCR体系,快速地检测孕妇血浆游离胎儿DNA中缺失型α-地中海贫血.结果表明:在50例贫血孕妇血浆的游离胎儿DNA中检出5例α-地中海贫血,其中3例为东南亚型缺失--SEA,2例为右侧缺失-α3.7.结论:采用单管多重PCR检测技术能快速准确地检测出3种常见缺失型α-地中海贫血,对于防止α-地中海贫血患儿出生、提高人口素质、减轻社会负担有重要意义.
关键词： 缺失型α-地中海贫血 α-地中海贫血 游离胎儿DNA 单管多重PCR 孕妇血浆 -
孕妇血浆游离胎儿DNA中地中海贫血突变的基因诊断
本研究旨在建立一种妊娠早期、简便、快速且无创伤性的检测胎儿常见地中海贫血突变的导流杂交技术,用于地中海贫血的产前诊断.采用PCR技术与低密度基因芯片导流杂交技术相结合,设计6组PCR引物单管多重PCR体系及29种DNA探针,快速检测60例妊娠5-17周贫血孕妇血浆游离胎儿DNA中缺失型α-地中海贫血及β-地中海贫血.结果表明:60例贫血孕妇血浆的游离胎儿DNA中,检出缺失型α-地中海贫血胎儿4例,β-地中海贫血胎儿3例,α及β混合型-地中海贫血胎儿1例.结论:采用本检测方法能快速准确地检测出3种常见的缺失型α-地中海贫血及17种常见β-地中海贫血的突变.
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改良PCR技术检测孕妇血浆中胎儿性别相关基因SRY的研究
目的 利用改良式PCR 技术检测孕妇血浆游离胎儿DNA,探讨无创性产前性别鉴定的可行性.方法 选择孕龄为14～38周产前诊断或引产的孕妇25名,抽取外周静脉血2ml,采用柱分离法提取DNA,用改良式PCR 技术检测其胎儿SRY 基因.同时采集脐血或羊水,经细胞培养后行脐血或羊水染色体核型分析鉴定胎儿性别.结果 25例孕妇血浆标本经改良式PCR 技术检测游离胎儿DNA,以脐血或羊水染色体核型分析鉴定的性别为标准,17例男性胎儿孕妇血浆标本有15例出现SRY 基因扩增带;8例孕女性胎儿孕妇血浆标本均未出现SRY 基因扩增带.检测总符合率为92%.结论 利用孕妇血浆中游离胎儿DNA 和改良式PCR 技术可以快速简便地进行无创伤性产前性别鉴定,对性连锁遗传性疾病的产前诊断具有重要意义.
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无创性产前诊断单基因病的研究进展
经过十余年的发展,利用母体外周血游离胎儿DNA 进行无创性产前诊断的技术正逐步面向临床.目前无创性产前诊断单基因病正得到越来越多的研究及关注.本文综述了无创性产前诊断单基因病的思路及研究进展,着重阐述了游离胎儿DNA 富集技术、基因突变位点的扩增及检测技术等研究热点.
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基于孕妇外周血浆游离胎儿DNA的地中海贫血无创产前基因诊断研究进展
地中海贫血是我国长江以南各省发病率高、影响大的单基因遗传病,目前尚无有效的治疗方法.在地贫高发地区有效开展婚前、孕前筛查以及对夫妻双方携带同种地贫基因的孕妇进行产前诊断是预防重度患儿出生的首选方法.目前胎儿地贫基因检测基于有创性手术获得胎儿DNA进一步基因诊断,有一定的流产和宫内感染的风险.我们迫切需要找到安全、无创、准确、简便、早期诊断的方法,cffDNA的发现开启了无创产前诊断的新篇章,且基于二代测序平台的NIPT技术无创产前诊断胎儿唐氏综合征已广泛应用于临床,其准确性可达99％,这为地贫无创产前诊断研究提供了新的思路.本文旨在综述基于孕妇外周血浆胎儿游离DNA的地中海贫血无创产前诊断技术研究进展.
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无创性产前诊断单基因病的研究进展
经过10余年的发展,利用母体外周血游离胎儿DNA 进行无创性产前诊断的技术正逐步面向临床.目前无创性产前诊断单基因病正得到越来越多的研究和关注.本文综述了无创性产前诊断单基因病的思路及研究进展,着重阐述了游离胎儿DNA 富集技术、基因突变位点的扩增及检测技术等研究热点.
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无创产前诊断单基因病的研究策略及进展
发现母体外周血游离胎儿DNA已20年,无创产前诊断领域取得了重大突破,改变了现有的产前筛查模式.无创产前诊断单基因病已得到越来越多的关注及研究.一些单基因遗传病的无创产前诊断已经应用于临床实践,其他常见单基因遗传病无创产前诊断也得到了发展.本文针对目前无创性产前诊断常见单基因病的思路、研究现状及进展进行综述.
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母体血浆中游离胎儿DNA研究进展
母血浆中游离胎儿DNA是无创伤性产前诊断中胎儿信息的主要来源之一.近年对游离胎儿DNA的来源、生物学特点以及临床应用的研究倍受关注.现已开展胎儿性别鉴定、RhD基因检测、STR遗传标记检测、胎儿非整倍体检测等应用研究.母血浆中游离胎儿DNA提取方法的发展和高灵敏度检测技术的应用.为母血浆中游离胎儿DNA的研究开辟了新前景.就母血中胎儿DNA来源、生物学特点,分析方法、基础性研究及临床应用的进展情况综述.
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母体循环中游离胎儿DNA的起源及诊断潜力研究进展
有关母体循环中游离胎儿DNA的研究一直是热点.胎儿核酸以惊人的稳定性存在于母体循环中,可能由于凋亡体中存在某些保护机制,游离胎儿DNA在母体循环中大量产生和快速变化更为妊娠过程提供了动力学依据.综合各学科理论和现有数据,认为母体循环中游离胎儿核酸主要来源于胎盘,其次也有部分来自胎儿造血细胞系统.由于母体循环中胎儿DNA的相对容易检测,胎儿非整倍体病、子痫前期、胎儿RhD基因型和一些单基因遗传病的诊断与鉴别手段应运而生.有关非性别依赖基因多态性、外遗传标志物以及循环mRNA序列研究的进展终将使此类技术不受胎儿性别限制而推广应用.
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选择性扩增孕妇血浆中游离胎儿DNA在21-三体综合征诊断中的效果及临床价值
目的 探讨选择性扩增孕妇血浆中游离胎儿DNA在21-三体综合征中的检测效果及临床价值.方法 选取2013年1-12月在该院进行孕检的健康孕中期孕妇42例(对照组)以及21-三体综合征高危孕妇21例(观察组),选择性扩增孕妇血浆中游离胎儿DNA,对比两组研究对象的检测结果.结果 21-三体综合征高危孕妇的3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)均值是(3.08±1.67) ×10 copy/ml,孕周相同健康孕中期孕妇的GAPDH均值是(4.28±1.36) ×10 copy/ml,21-三体综合征高危孕妇显著低于健康孕中期孕妇(P＜0.05);血浆DNA含量对比方面,与对照组比较,21-三体综合征高危孕妇胎儿的DNA拷贝数以及相对含量显著上升,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 选择性扩增孕妇血浆中胎儿游离DNA在检测21-三体综合征方面的灵敏度以及特异性较为理想.
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两种提取孕妇血浆游离胎儿DNA方法的比较
目的 分别应用两种方法进行血浆游离胎儿DNA的提取,判定及筛选佳的血浆游离胎儿DNA的提取方法,为后续试验提取游离胎儿DNA的方法提供参考依据.方法 收集30例健康妊娠孕妇血浆,用离心柱法和磁珠法进行血浆游离DNA的提取,经甲基化敏感限制性内切酶BstUI酶切后使用微量紫外分光光度计测量所提取的游离胎儿DNA的含量及纯度,再使用实时荧光定量PCR扩增方法测定扩增效率,进行统计学分析.结果 离心柱法所提取的游离胎儿DNA的测定结果为:含量(43.27±21.01)ng/μl;纯度A260/A280 (0.999 7±0.084 42);扩增效率为94％;而磁珠法提取的游离胎儿DNA的测定结果为:含量(31.74±12.25) ng/μl:纯度A260/A280 (0.878 3±0.052 66);扩增效率为87％.两组方法提取游离DNA的浓度、纯度比较,差异有统计学意义(均P＜0.05).结论 离心柱法比磁珠法操作更简便、快捷.经测定提取的DNA的浓度及纯度,扩增效率后可判断离心柱法所提取的游离胎儿DNA的浓度、纯度及扩增效率都远远优于磁珠法;离心柱法比磁珠法更适用于后续无创产前诊断研究试验.
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高通量测序技术在无创性检测胎儿染色体非整倍性中的应用
目的 探讨应用高通量测序技术对孕妇血浆胎儿游离DNA进行无创性胎儿染色体非整倍性检测的可行性和准确性.方法 采用高通量基因测序技术检测母体血浆胎儿游离DNA,分析胎儿染色体的非整倍性信息.同时行羊水常规染色体核型分析.统计分析两种方法检测结果的一致性.结果 100名孕妇中,母体血浆游离DNA平行测序技术检测出8例胎儿染色体非整倍性高风险.采集的100份羊水标本均培养成功,成功率为100％.共检测出7例胎儿染色体核型异常,其中染色体非整倍体异常6例(3例47,XN,+21;1例47,XN,+18;1例47,XN,+13;1例47,XXY;1例47,XXX);嵌合体1例(46,XN[2]/47,XN,+13[33]/47,XN,+13,add(15) (p12) [15]).无创基因检测与羊水染色体核型分析两种方法的κ=0.928(P ＜0.05),检测结果具有一致性.无创基因检测技术的假阳性率1.01％,灵敏度100％,特异度98.9％,阳性预测值87.5％.结论 应用高通量测序技术在染色体非整倍性无创性检测具有很高的灵敏性,假阳性率很低,在胎儿染色体非整倍性疾病的产前检测中具有广泛的应用前景.
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孕妇血浆中游离胎儿DNA的检测与分析
目的 建立不依赖于胎儿性别和父本DNA、可适用于染色体数目异常和单基因遗传病的无创性产前诊断方法.方法 应用降落PCR和二次PCR扩增技术,联合检测41例正常孕妇(其中孕龄7 w 1例,14～20 w 39例,32 w 1例)血浆中游离胎儿DNA的SRY基因和D17S1293、D21S11、DXS8377等3个短串联重复序列(short tandem repeat,STR)位点.SRY基因扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,STR位点扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色.结果 41例孕妇血浆DNA中均检出非母源性等位基因条带;联合SRY基因和X-STR位点鉴定胎儿性别,38例判断明确,3例不能明确判断性别.结论 检测孕妇血浆中的游离胎儿DNA,可快捷地获得男性胎儿和女性胎儿的父源性DNA信息,不仅适用于性连锁遗传疾病,而且适用于常染色体遗传疾病等的产前基因诊断.
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母血浆中游离胎儿 DNA 检测在染色体非整倍体筛查中的应用
目的：母血浆中游离胎儿DNA检测在染色体非整倍体的无创产前诊断中的实用价值及临床意义。方法选择孕中期血清学筛查高风险、高龄妊娠等因素，孕龄在15～26周之间，且拒绝行侵入性产前诊断的孕妇。进行母血浆中游离胎儿DNA的高通量测序，阳性结果孕妇，通过羊膜腔穿刺、羊水细胞培养、染色体核型分析确定染色体非整倍体情况。结果1269例孕妇血浆样本经高通量基因测序检测到22个结果异常，羊水染色体核型分析10例21-三体、3例18-三体、性染色体异常6例，3例性染色体误诊。无创胎儿21-三体、18-三体综合征检出正确率达100％，但胎儿性染色体检测准确率较低，约为66.7％。结论高通量基因组测序技术具有无创性，且与传统羊水染色体核型分析相比，诊断胎儿21-三体、18-三体综合征的特异性有较高的一致性。
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胎儿染色体非整倍体无创产前基因检测技术在周口市的临床应用分析
目的 探讨胎儿染色体非整倍体无创产前基因检测(non-invasive prenatal testing,NIPT)技术在周口市胎儿染色体非整倍体疾病筛查中的临床应用.方法 选取2014年1月-2015年11月间,在周口市中心医院进行唐氏综合征筛查结果提示高风险(RISK>1/275)、高龄孕妇(孕龄≥35岁)、有既往不良孕产史以及超声检查提示胎儿异常的共计829例孕妇,进行胎儿染色体非整倍体无创产前基因高通量测序分析,结果提示高风险的孕妇手术抽取羊水后核型分析.结果 612例唐氏筛查高风险孕妇组经外周血胎儿游离DNA检测结果提示高风险者共计7例(6例21-三体、1例18-三体);169例高龄孕妇组共检出1例18-三体结果高风险者;7例既往不良孕产史孕妇组检出1例21-三体结果高风险者;41例超声检查提示胎儿异常孕妇组共检出2例结果高风险(1例21-三体、1例13-三体).NIPT结果提示21、18、13-三体异常高风险孕妇分别为8例、2例、1例,进一步行染色体核型分析的确诊例数分别为:8例、2例、1例,结果证实NIPT用于检测胎儿21-三体、18-三体、13-三体的敏感度为100%,特异度为100%,准确率100%,与染色体核型分析结果一致.结论 周口市孕妇外周血游离胎儿DNA高通量测序分析可用于胎儿常见染色体非整倍体疾病的筛查,敏感度高、特异度强、准确率高应推广临床应用.
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孕妇外周血中ERG基因甲基化状态及定量研究
目的：：探讨ERG基因作为孕妇外周血中胎儿特异性标记物的可行性。方法：随机选取健康未妊娠妇女5例、正常妊娠孕妇65例、产后3天妇女20例的外周血样本，以及早期妊娠行人流的绒毛组织样本10例。应用甲基化敏感限制性内切酶 PCR ( MSRE-PCR)及荧光定量PCR方法检测样本中ERG基因甲基化状态，并进行相对定量分析。结果：(1)健康未妊娠妇女、顺产后3天妇女外周血浆及孕妇血细胞中均未检出甲基化的ERG基因；(2)绒毛组织样本中甲基化的ERG基因检出率100%；(3)正常妊娠孕妇外周血浆中甲基化ERG基因检出率为76.9%，中期、晚期妊娠ERG基因的含量分别是早期妊娠的3.18倍和5.46倍。结论：甲基化的ERG基因是可靠的胎儿特异性标记；正常妊娠孕妇的外周血浆中甲基化的ERG基因的检出量随孕周增加而增加。
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利用母体血浆游离胎儿DNA进行胎儿SRY基因定量检测
目的 探讨胎儿游离DNA在无创性产前诊断中的应用价值.方法 行产前诊断的孕妇87例,分为中期妊娠(16～24周)61例(中孕组)和早期妊娠(11～14周)26例(早孕组),采用实时荧光定量PCR方法,利用Taqman探针对妊娠早、中期孕妇血浆游离的胎儿Y染色体性别决定基因(sex-determining region of Y-chromosome,SRY)进行扩增和定量分析.结果 孕13周后的样本均得到特异性扩增,特异度和灵敏度均为100％；中孕组男性胎儿SRY检测的平均DNA浓度为155.46 copies/mL血浆,实测范围为43.6～326.8 copies/mL血浆；早孕组平均浓度为26.42 copies/mL 血浆,实测范围为14.3～73.3 copies/mL血浆.结论 采用荧光实时定量PCR在妊娠早、中期可稳定检测到胎儿游离DNA,可作为孕期性连锁遗传性疾病研究或产前诊断的有效补充手段.
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高通量测序技术在胎儿染色体非整倍体检测中的临床应用
目的 探讨高通量测序技术行孕妇外周血浆中游离DNA检测胎儿染色体非整倍体的可行性.方法 选择2011年11月-2014年7月,在浙江省温州市中心医院接受孕妇外周血中游离胎儿DNA检测的孕妇共3 447例,孕周为12周～33周,对检测结果阳性者行介入性穿刺及胎儿染色体分析,对检测结果阴性者随访.结果 38例均行介入性产前诊断,其中21-三体检测阳性者22例,诊断符合率为100％;18-三体检测阳性者3例,均行羊膜腔穿刺,核型均为47,XN,+18;13-三体检测阳性者1例,与核型分析相符.结论 高通量测序技术行胎儿染色体非整倍体检测,敏感性、特异性高,可作为二次筛查方法,减少介入性产前诊断的压力.
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利用孕妇外周血浆小片段游离胎儿DNA检测Y染色体性别决定区基因
目的 探索从孕妇外周血浆中提取小片段游离胎儿DNA(cffDNA)提高检测胎儿Y染色体性别决定区(SRY)基因准确率的方法,评估利用小片段cffDNA进行无创性产前诊断可行性.方法 收集117例孕妇外周血,利用柱吸收方法提取其血浆cffDNA,经琼脂糖凝胶电泳分离富集小片段cffDNA,使用二重PCR反应(dulex-PCR)检测SRY基因和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因.结果 来源于66例孕男胎孕妇血浆标本小片段cffDNA均检出SRY和GAPDH基因,来源于50例孕女胎孕妇血浆标本小片段cffDNA仅检出GAPDH基因.与绒毛/羊水标本检测结果相符.特异性和敏感性均为100%.结论 利用琼脂糖凝胶电泳,切胶回收,可选择性富集孕妇外周血小片段cffDNA,相对提高胎儿DNA水平,结合二重PCR扩增SRY基因技术可用于无创性产前性连锁遗传疾病和单基因突变疾病产前诊断.
关键词： 游离胎儿DNA Y染色体性别决定区基因 二重聚合酶联反应
