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河南及上海患者的HIV-1 gag基因p24蛋白编码序列及亚型初步分析
目的了解河南及上海地区人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者p24蛋白编码区的基因变异性以及亚型的分布状况.方法收集37份HIV-1感染患者的血浆标本,河南25份,感染途径主要是有偿供血;上海12份,主要是血制品感染及性接触感染.采用逆转录和套式聚合酶链反应(PCR)扩增并直接测序,然后进行序列比对及进化树分析.结果83.8%(31/37)为B亚型,河南患者中23例为B亚型,2例为A亚型;上海患者中8例为B亚型,1例为A亚型,2例为CRF01-AE亚型,1例为CRF02-AG亚型.与国际共享序列相比,B亚型p24编码区中发生核苷酸改变的位点比例河南为1.6%～4.2%,平均3 2%;上海为2.0%～3.8%,平均3.4%.在所有变异位点中均未发现连续G-＞A的高度突变.两组B亚型内平均基因离散率分别为3.7%和3.5%,B亚型与其他亚型之间的基因离散率则为11.1%～12.5%.河南及上海地区B亚型共享序列与国际共享序列进行比对,氨基酸变异的比例均为2.2%(5/231),其中有3个变异位点相同,分别为A14P、191V及E180D,而这两个共享序列之间的差异仅为0.9%(2/231).进化树分析亦表明所有样本中大多为B亚型,且与源自泰国的B'亚型相距较近.结论河南及上海地区的B亚型之间有较高的同源性,p24蛋白有共同的氨基酸变异位点.
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人类免疫缺陷病毒-2 gag重组鸡痘病毒疫苗的构建及实验免疫研究
目的 构建并探讨人类免疫缺陷病毒(HIV)-2 gag重组鸡痘病毒(FPV)在小鼠体内的免疫应答,为开发HIV-2基因重组活载体疫苗提供实验依据.方法 将HIV-2结构基因gag插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7.5×20下游,构建出鸡痘病毒重组转移质粒pUTA2-gag;经转染和BrdU加压筛选,以基因组聚合酶链反应(PCR)和Western blot法鉴定重组病毒;将获得的重组病毒大量制备并纯化后,肌内注射免疫Balb/c小鼠,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠血清HIV-2抗体,流式细胞仪测定CD4+、CD8+T淋巴细胞亚类数量,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性.结果 构建出重组鸡痘病毒转移质粒pUTA2-gag;从重组病毒的基因组中可扩增出大小为766 bp的目的基因,其表达产物可与人HIV-2阳性血清发生反应,目的蛋白的相对分子质量约为55 000;重组病毒免疫组小鼠的血清出现HIV-2抗体,脾T细胞亚类的数量增加,并产生针对HIV-2靶细胞的特异性CTL杀伤活性.结论 获得一株重组鸡痘病毒,该病毒可稳定表达HIV-2结构蛋白Gag,并能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答.
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2011-2013年柳州市部分HIV-1毒株gag基因测定及亚型分析
目的 了解2011-2013年柳州市人类免疫缺陷病毒1(human immunodeficiency virus 1,HIV-1)亚型分布、流行毒株情况.方法 从2011-2013年柳州市HIV-1毒株样本中采用单纯随机抽样方法抽取120株作为研究对象,将120份样本从血浆中抽提核酸RNA,扩增HIV-1 gag基因片段,送至北京六合华大基因科技股份有限公司测序.合格序列利用数据库分析亚型以及利用MEGA5构建系统进化树.结果 得到合格的gag基因片段98条序列.来自gag基因片段的序列分析重组流行毒株(circulate recombinant forms,CRFs)的重组亚型CRF01 _AE占95.9％ (94/98),异性传播比例为79.8％ (75/94);重组亚型CRF07_BC占4.1％(4/98).样本1LZ022和1LZ032,1LZ025和3LZ029的bootstrap值分别为99.0％,100.0％,两两之间传播途径不同.结论 2011-2013年,柳州市HIV-1以重组亚型CRF01 _AE为主.柳州市重组亚型CRF01_AE从吸毒人群向异性接触感染人群蔓延.利用系统进化关系结合传播途径,便于分析传染源,为艾滋病干预措施提供有力佐证.
关键词： HIV-1 基因 Gag 获得性免疫缺陷综合征 -
新疆地区HIV-1感染者CRF07_BC流行毒株gag基因变异特性
目的 分析新疆地区人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)感染者中流行的CRF07_BC亚型毒株gag基因的遗传变异特性.方法 对75例HIV-1感染者分别于间隔6个月的两个时间点采集标本.抽提标本RNA反转录后用巢式聚合酶链反应扩增gag基因片段,将得到的2次序列进行亚型、同源性、基因离散率和选择压力分析.结果 进化树上同一样本的2次序列聚集成一个小分枝,有15大簇分枝的共同特征是每枝上的几个毒株来源的新疆下属地区相同且同源相似性在94.2％ ～ 99.4％之间,具有这种特征的标本超过全部标本量的半数;与首次采样的序列相比,6个月后的样本序列组内基因离散率、与标准株间的组间基因离散率均呈现出增加的趋势;基因选择压力分析表明新疆地区的HIV-1毒株正受到正向选择压力.结论 进化树上每簇分枝上的几个样本来源的地区相同和序列高度同源提示每簇上的几例标本很有可能是由同一株亲本毒株进化而来的;基因离散率随流行时间的增长而增加和基因选择压力分析结果均表明HIV-1毒株发生着连续的定向突变.
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HIV-1 B亚型核心蛋白gag基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达
目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型核心蛋白gag基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,为进一步制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础.方法以克隆好的HIV-1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gag基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5'端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性的扩增gag基因.TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gag编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1(+)/gag.在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gag基因的细胞系,用RT-PCR及Western印迹检测其在HepG2细胞中的表达.结果重组质粒经BamHⅠ、 XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.5kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了gag基因片断,测序结果表明编码框正确.RT-PCR及Western印迹证实稳定转染gag基因的HepG2细胞系中有该基因的表达.结论成功构建了HIV-1 B亚型核心蛋白gag基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/gag,并在HepG2细胞中获得稳定表达.
关键词： 人类免疫缺陷病毒 pcDNA3.1(+) Gag 基因表达 -
外用肝素促进供皮区创面愈合的临床应用
氨基葡聚糖(GAG)用于创面的治疗已经有临床、动物实验研究,并已初步发现它有抗感染、抗凝、促进血管再生等作用.肝素中含有大量硫酸基,是酸性强的GAG[1].
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表达HIV-1 CRF01_AE gag的rAd5疫苗构建及其免疫原性评价
目的 构建表达HIV-1 CRF01_AE gag基因的重组腺病毒(rAd5)载体疫苗,并在小鼠体内评价其免疫效果.方法 利用实验室前期改造优化的HIV-1 CRF01_AE gag基因,构建获得携带有gag基因的重组Ad5疫苗,即rAd5-HIV AEgag.经鉴定证实重组Ad5疫苗可以表达Gag蛋白后,在BALB/c小鼠体内评价重组疫苗rAd5-HIV AEgag的免疫效果.结果 重组腺病毒疫苗可以准确地表达Gag蛋白,疫苗免疫BALB/c小鼠可以诱导出较高强度的体液和细胞免疫应答反应.结论 成功构建了表达HIV-1 CRF01_AE gag基因的重组Ad5疫苗.
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序贯联合应用HIV-1 gp160腺病毒载体疫苗的体液免疫效果研究
目的 探讨序贯联合应用Ad5-HIVgp160疫苗与其他艾滋病疫苗所诱导的特异性体液免疫反应效果.方法 用Ad5-HIVgp160疫苗、其他腺病毒载体和腺病毒相关载体疫苗以不同免疫程序分别免疫豚鼠,通过ELISA和中和实验方法检测其诱导的免疫反应,比较疫苗联合免疫组豚鼠与疫苗单独免疫组豚鼠诱导的体液免疫反应的强度.结果 不同免疫程序的豚鼠均能检测到针对HIV gp120的HIV结合抗体和针对HIV敏感株sf162的中和活性;联合疫苗组诱导的gp120特异性抗体滴度和病毒中和活性高于单独免疫组,但无显著性差异.结论 Ad5-HIVgp160疫苗单独或与其他疫苗联合使用均能诱导高水平的体液免疫反应,能激发针对HIV敏感株产生中和活性的抗体.
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钦州市钦南区HIV-1流行亚型及基因变异特征研究
目的 调查流行于钦南区的HIV-1亚型种类并分析其基因变异特征.方法 抽取100例未抗病毒治疗的HIV-1感染者,从血样中提取病毒RNA或前病毒DNA,采用聚合酶链反应(PCR)扩增HIV-1 gag基因和pol基因片段并测序,用系统进化树分析其亚型,并计算gag和pol区的基因离散率.结果 97份血样获得gag基因序列或pol基因序列,4份血样的gag与pol分型不一致,其他93份分型明确,其中CRF01_AE重组型、CRF07_BC重组型、CRF08 BC重组型及G亚型分别占76.34％(71/93)、9.68％(9/93)、12.90％(12/93)和1.07％(1/93).CRF08_BC的gag基因离散率为0.059±0.005,高于CRF07_BC的0.053±0.005(P＜0.01)和CRF01_AE的0.049±0.004(P＜0.01).CRF01_AE的pol基因离散率为0.044±0.003,高于CRF07_BC的0.035±0.004(P＜0.01)和CRF08 BC的0.033±0.003(P＜0.01).结论 钦南区HIV-1存在至少3种流行亚型,其中CRF01_AE是主要的亚型,不同基因区的变异程度有所不同.
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人免疫缺陷病毒Ⅱ型核心蛋白DNA疫苗的实验免疫研究
目的检测HIV-2核心蛋白DNA疫苗诱导Balb/c小鼠免疫应答的能力.方法将表达HIV-2核心蛋白DNA疫苗质粒pVAXIgag肌注Balb/c小鼠,分析CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量、脾特异性CTL反应、血清中HIV-2的特异性抗体水平.结果重组质粒pVAXI-gag免疫组与空载体pVAXI及PBS对照组相比较差异显著,血清抗体滴度及淋巴细胞杀伤效应为P＜0.01,脾T细胞亚群的数量为P＜0.05.结论HIV-2核心蛋白DNA疫苗能诱导Balb/c小鼠产生特异性细胞免疫应答和体液免疫应答.
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酵母表达的HIV-1中国株CN54 Gag蛋白的免疫原性研究
目的评价毕赤酵母表达的HIV-1中国株CN54 Gag蛋白在Balb/c小鼠诱导体液和细胞免疫的能力.方法利用重组 Gag蛋白单独及与重组DNA或痘苗联合免疫Balb/c小鼠,检测小鼠产生的特异性结合抗体和IgG1/IgG2a,同时检测T淋巴细胞增殖反应和CTL反应.结果 3个蛋白单独免疫组均能诱导小鼠产生抗体和T淋巴细胞增殖反应,其中不加佐剂的免疫组诱导免疫反应低于其它两组.但3组的CTL杀伤活性均不明显.重组蛋白和重组DNA及痘苗联合免疫均诱导产生了较好的体液和细胞免疫反应,而且重组痘苗初始免疫-蛋白加强免疫组还诱导产生了较强的CTL反应. 结论酵母表达的HIV-1 Gag蛋白具有良好的免疫原性,在与重组DNA和痘苗疫苗联合使用时具有协同作用,能刺激动物产生更强的HIV-1特异性体液和细胞免疫反应.本研究为构建HIV-1蛋白疫苗和探讨各类疫苗的联合免疫方式提供了有价值的参考数据.
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HIV-1 Gag蛋白酵母表达产物的纯化及免疫原性检测
目的纯化HIV-1 Gag蛋白,并检测其免疫原性.方法将表达HIV-1 Gag蛋白的酵母工程菌GS115/pPICGAG接种到YPD培养基中多次传代后,用PCR检测其目的基因.该酵母工程菌在BMMY培养基中经甲醇诱导表达,上清液初步浓缩后上柱进行凝胶过滤层析,并将纯化蛋白免疫Balb/c小鼠,检测其血清抗体水平.结果该酵母工程菌经多次传代后外源基因不丢失.Western blot检测结果表明纯化蛋白具有很好的反应原性,其纯度可达85%.纯化蛋白免疫小鼠后可诱导特异性抗体产生.结论表达HIV-1 Gag蛋白的酵母工程菌具有很好的遗传稳定性,其表达产物可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答.
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表达HIV-1 gag蛋白的重组乳酸乳球菌诱导小鼠产生体液免疫应答
目的 分析表达HIV-1 gag蛋白的重组乳酸乳球菌通过口服、滴鼻、皮下注射以及上述3种方式联合免疫小鼠诱导的体液免疫反应.方法 将50只BALB/c小鼠随机分成5组,每组10只.表达gag的重组乳酸乳球菌分别通过口服、滴鼻、皮下注射以及上述3种方式联合免疫小鼠,对照组口服含PMG36e空载体的乳酸乳球菌,接种菌量均为109菌落形成单位(CFU),连续免疫3次,每次间隔2周,其中口服和滴鼻每次连续免疫3d.采集免疫前和每次免疫后2周小鼠的血清,ELISA检测gag特异性的IgG水平.结果 表达gag的重组乳酸乳球菌经口服、滴鼻、皮下注射以及3种方式联合免疫均诱导小鼠产生了gag特异性IgG,且联合免疫组gag IgG水平显著高于其他各实验组(P＜0.01).初次免疫后6周,口服和皮下注射免疫组gag IgG水平显著高于滴鼻免疫组(P＜0.01).免疫3次后各组血清中gag抗体的阳性率:口服免疫组分别为40％、40％、90％;滴鼻免疫组分别为10％、20％、20％;皮下免疫组分别为10％、60％、90％;联合免疫组的阳性率在初次免疫后2周已达到100％.结论 表达HIV-1 gag的重组乳酸乳球菌载体疫苗经口服、滴鼻、皮下注射及3种方式联合免疫均能诱导小鼠产生特异性的体液免疫反应,多种途径联合免疫可增强乳酸乳球菌载体疫苗的免疫效果.
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人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)gag基因疫苗的免疫原性
目的: 检测人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)gag基因疫苗的免疫原性. 方法: 分别以ELISA、荧光抗体染色和乳酸脱氢酶释放法, 检测免疫小鼠血清抗体滴度、脾 T细胞亚群的数量和淋巴细胞杀伤效应. 结果: 血清抗体滴度、脾 T细胞亚群的数量及淋巴细胞杀伤效应, 重组质粒pVAXGAG免疫组与空载体pVAX1对照组相比较差异显著(分别为P<0.05和P<0.01). 结论: HIV-1 DNA疫苗质粒pVAXGAG在BALB/c小鼠中不仅可诱导特异性体液免疫, 而且可诱导特异性细胞免疫.
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表达HIV-1 gag蛋白重组乳酸乳球菌株的建立及其在小鼠体内定植的研究
目的 构建表达HIV-1 gag的重组乳酸乳球菌,并分析重组菌在小鼠体内的定植情况.方法 将HIV-1 gag克隆至原核表达质粒pMG36e,重组质粒pMG36e-gag电转乳酸乳球菌,SDS-PAGE和Western blot法检测其在乳酸乳球菌中的表达.以109个重组菌给小鼠口服,对照组口服PBS.口服后第1、3、5、7、9、11天分别取小鼠的胃、小肠和大肠,采用稀释滴种法测定小鼠胃、肠道内重组菌的数量.结果 酶切和DNA测序表明gag已克隆入pMG36e.SDS-PAGE在预期位置检测到蛋白条带,Western blot分析证实其为gag蛋白.重组菌定植实验表明,第1、3天在胃肠均有一定量重组菌,且大肠中重组菌数量多于胃和小肠,随后胃肠中重组菌均迅速减少,仅在大肠中仍有一定量的重组菌,第11天时胃肠仅分离到极少量的重组菌.结论 本研究获得胞内表达HIV-1 gag前体蛋白Pr55的重组乳酸乳球菌,其可在胃肠中短期存活,可作为预防HIV-1感染的候选疫苗.
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真皮细胞外基质中氨基聚糖与蛋白多糖的组成及功能研究进展
真皮ECM由胶原支架与氨基聚糖(glycosaminoglycan,GAG)及蛋白聚糖有机交联构成,GAG、蛋白聚糖填充在胶原纤维支架中,发挥黏附、润滑、抗压、维持内环境稳定、干预代谢、影响细胞行为等作用,对维持真皮的功能产生重要影响.同时GAG、蛋白聚糖与胶原纤维相互作用,影响彼此的功能及代谢.功能完备的组织工程真皮应同时具备胶原支架成分及填充于其中的无定形基质成分,以模拟人类真皮的构造及组成,实现结构及功能的仿生化[1].本文就真皮ECM中GAG与蛋白聚糖的组成、功能、代谢特点、相互作用作一综述.
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哈尔滨市新确诊男男同性性接触者HIV-1感染者毒株基因型分析
目的 分析哈尔滨市新确诊男男同性性接触者(men who have sex with men,MSM) HIV-1感染病例的毒株基因型特征.方法 收集2012-2015年新确诊且未经过抗病毒治疗的HIV-1感染者抗凝血,分离外周血单核细胞,从中提取基因组DNA,采用巢式PCR法扩增gag和env基因.采用MEGA7.0软件构建gag和env基因系统发育树,分析基因型特点.结果 共收集148例MSM HIV-1感染者样本,均获得gag和env基因序列.系统发育树显示,其中CRF01_AE亚型108例,占73.0％;B亚型19例,占12.8％;CRF07_BC12例,占8.1％;独特重组型9例,占6.1％.在不同年份、不同年龄群体的标本中,CRF01_AE均为优势基因型.在CRF01_AE毒株中,98.1％ (106/108)与我国MSM人群参考株成簇,1.9％ (2/108)与泰国及我国西南地区异性传播参考株成簇.77.8％ (7/9)的独特重组型毒株来自20～40岁群体.2012年开始出现gag和env基因间重组亚型,2014年发现gag基因内重组亚型,2015年出现基因内和基因间均发生重组的复杂亚型,尚未发现env基因内重组毒株.结论 哈尔滨市2012年至2015年新确诊男男同性性接触人群HIV-1感染病例中流行毒株基因型较复杂,CRF01_AE亚型毒株一直是本地区的优势毒株,同时,基因间和基因内重组毒株已出现.因此,加强MSM人群新发感染病例的实时监测,并制定有效的预防措施是非常必要的.
