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霍乱毒素B亚单位在乳酸乳球菌食品级表达系统中的分泌性表达
目的 在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)食品级分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ和L.lactis MBP71/pSQ中克隆表达霍乱毒素B亚单位(CTB),实现CTB的分泌性表达.方法 采用PCR扩增霍乱弧菌569B菌株染色体中CTB蛋白编码基因片段,克隆到食品级分泌表达载体pSQZ和pSQ中,转化入宿主菌L.lactis MBP71,构建CTB的分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ-ctB和L.lactis MBP71/pSQ-ctB;采用Western-blot检测重组菌株中CTB的表达及表达量.结果 PCR扩增得到CTB编码基因片段ctB,酶切、连接到载体pSQZ和pSQ并转化到宿主菌L.lactis MBP71中,构建了分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ-ctB和L.lactis MBP71/pSQ-ctB.Western-blot检测发现,L.lactis MBP71/pSQ-ctB和L.lactis MBP71/pSQZ-ctB系统均能分泌性表达CTB,L.lactis MBP71/pSQ-ctB上清的表达量约为2 μg/ml;L.lactis MBP71/pSQ-ctB的表达效率远远高于L.lactis MBP71/pSQZ-ctB.结论 成功实现了CTB在食品级表达系统中的分泌性表达.
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中和性流行性感冒病毒基因工程抗体在昆虫细胞中的全基因表达、纯化及鉴定
将中和性流行性感冒(流感)病毒基因工程抗体IV-2、IV-6的轻链和重链Fd段基因,分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc,构建成杆状病毒表达载体pAC-L-Fc-Ⅳ-2和pAC-L-Fc-Ⅳ-6,转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现抗体的分泌型表达,表达产物进行亲和层析分离纯化.SDS-PAGE电泳和Western blot法证实有完整免疫球蛋白的表达,免疫印迹法证实它们能与流感病毒血凝素蛋白特异性结合.经间接竞争性抑制ELISA法测定,抗体与流感病毒抗原结合的解离常数KD值分别为2.5×10-9M和3.0×10-9M.流感病毒基因工程全抗体经在昆虫细胞中的表达、纯化和抗体特性鉴定,获得了两株纯化的全抗体,可用于以后的动物模型呼吸道粘膜被动免疫抗感染的研究.
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白喉毒素无毒突变体H21G蛋白的分泌性表达及纯化
目的 原核分泌性表达白喉毒素无毒突变体H21G蛋白并进行纯化,为下一步开发以重组H21G蛋白为基础的疫苗奠定基础.方法 以pET16a-H21G质粒为模板,PCR扩增H21G基因,亚克隆至pET22b载体中,构建重组原核表达质粒pET22b-H21G,转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组H21G蛋白分泌性表达.重组蛋白经渗透压休克,DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Phenyl Sepharose 6FF(high sub)疏水层析纯化后,使用还原/非还原SDS-PAGE和HPLC法分析纯化蛋白的纯度,窄范围等电聚焦分析其等电点,MALDI-TOF质谱法分析其相对分子质量,N-末端测序法鉴定N-末端氨基酸序列.结果 重组原核分泌性表达质粒pET22b-H21G经双酶切(Nco Ⅰ和Xho Ⅰ)和测序证明构建正确;目标蛋白以可溶形式存在于宿主菌周质间隙,表达量为10％～15％;经纯化后,重组蛋白纯度达95％以上,等电点在4.55 ～6.20之间,相对分子质量和N-末端氨基酸序列均与白喉毒素相符合.结论 成功分泌性表达并纯化了重组白喉毒素无毒突变体H21G蛋白,为下一步开发以重组H21G蛋白为基础的疫苗奠定了基础.
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人源与鼠源神经生长因子信号肽引导β-内啡肽分泌表达的差异
目的:考察人源神经生长因子信号肽序列是否具有介导β-内啡肽分泌性表达的作用,以及人源与鼠源神经生长因子信号肽的作用效率是否存在差异.方法:构建2个分别利用人或鼠的信号序列介导β-内啡肽分泌表达的真核表达载体pcDNA3.1-hEP和 pcDNA3.1-mEP;脂质体法转染NIH3T3细胞,转染48 h后分别收集细胞培养上清液、细胞,以及细胞呈单层生长的盖玻片.收集的上清液用RIA法测定β-内啡肽的浓度;收集的细胞提取总RNA,一步法RT-PCR检测融合基因的mRNA的转录;长有细胞的盖玻片处理后进行细胞免疫荧光染色.结果:RT-PCR的结果显示,所构建的融合基因在NIH3T3细胞内发生了表达,β-内啡肽主要分布在NIH3T3细胞的胞质内.pcDNA3.1-hEP和 pcDNA3.1-mEP分别转染NIH3T3细胞48 h后,细胞培养上清β-内啡肽的浓度分别是(280.33±24.16) pg/ml和(191.04±7.96) pg/ml,有显著的统计学差异(P<0.05),且与空白对照之间均有显著的统计学差异(P<0.01).结论:人源神经生长因子信号肽序列能够介导β-内啡肽蛋白的分泌性表达,且作用效率要优于鼠源信号肽.
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重组鲨肝活性蛋白的分泌表达及其体外对肝细胞葡萄糖激酶活性的影响
构建了鲨肝活性蛋白的原核分泌表达载体pET22b-S,经过周质蛋白的提取、DEAE SepharoseFF、MonoQ/AKTA explorer、Bio-gel P10的分离纯化,获得可溶性重组鲨肝活性蛋白(rSHAP).初步研究了rSt-IAP对肝细胞增殖以及肝细胞葡萄糖激酶活性的影响.结果显示rSHAP能够被成功分泌至细胞间质中,分离纯化后可获得纯度约95%的可溶rSHAP,产量约3.8 mg/L.所获得的rSHAP具有刺激SMMC-7721细胞株增殖活性,体外活性检测显示15～45μg/ml的rSHAP能够显著提高正常人肝细胞HL-7702葡萄糖激酶活性.
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过敏毒素 C3 a在肾小球足细胞中的分泌性表达试验
目的：建立过敏毒素C3 a分泌性表达慢病毒体系和分泌性高表达过敏毒素C3 a的足细胞株，为研究过敏毒素C3 a对足细胞的作用创造条件。方法人工合成过敏素素C3 a分泌性表达基因；以重组慢病毒为媒介，将过敏毒素C3 a分泌性表达基因导入到人足细胞系（human podocytes，HPC）；利用药物筛选和连续梯度稀释克隆法获得稳定整合有过敏毒素C3a转基因结构的HPC细胞株；利用实时定量PCR从mRNA水平、酶联免疫吸附测定方法从蛋白质水平对过敏毒素C3 a的表达和分泌情况进行鉴定。结果成功建立了过敏毒素C3 a分泌性表达慢病毒体系；获得了分泌性高表达过敏毒素C3 a的人肾小球足细胞株。结论所建立的过敏毒素C3 a分泌性表达慢病毒体系和分泌性高表达过敏毒素C3 a的足细胞株，为进一步分析过敏毒素C3 a对足细胞的作用创造了条件。
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乳酸乳球菌食品级分泌性表达载体pSQZ的构建及报告蛋白的表达
目的 构建乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L lactis)食品级分泌表达载体,表达报告蛋白核酸内切酶(NucA).方法 PCR扩增乳酸乳球菌未知分泌蛋白(Usp45)编码基因的启动子、核糖体结合位点、分泌信号和成熟肽前11个氨基酸编码序列,克隆到载体pSH91中,构建食品级分泌性表达载体pSQZ;克隆报告蛋白金黄色葡萄球菌NucA成熟肽的编码序列nucA到pSQZ中分泌信号后,转化乳酸乳球菌MBP71,构建乳酸乳球菌分泌性表达系统L lactis MBP71/pSQZ-nucA;采用TB-D法和酶谱法检测乳酸乳球菌分泌性表达的NucA活性.结果 PCR扩增得到usp45基因片段,酶切、连接到载体pSH91中构建了食品级表达载体pSQZ;将扩增的nucA基因片段克隆入载体pSQZ并转化乳酸乳球菌,得到乳酸乳球菌分泌性表达系统L lactis MBP71/pSQZ-nucA.在TB-D平板上,L lactis MBP71/pSQZ- nucA克隆子周围出现橙色光晕;在酶谱检测中,L lactis MBP71/pSQZ-nucA上清和菌体在18 kDa位置均有橙色条带,但上清条带亮度和宽度大于菌体.结论 成功构建了乳酸乳球菌食品级分泌表达系统,实现了报告蛋白NucA在乳酸乳球菌中分泌性表达,为进一步保护性抗原的分泌性表达研究奠定了基础.
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结核分枝杆菌ESAT-6基因重组卡介苗的构建与鉴定
目的:ESAT-6是结核分枝杆菌的一种分泌性蛋白质,具有免疫保护作用,可作为抗结核病新疫苗的候选分子.而卡介苗由于缺失ESAT-6基因,不能产生该抗原蛋白.本研究旨在构建ESAT-6基因重组卡介苗,使其表达ESAT-6抗原,从而增强其免疫原性和免疫保护性,探索将该重组卡介苗用作新型结核病疫苗的可行性.方法:分别以卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,经PCR扩增得到BCGα-抗原(α-Ag)信号肽序列和结核杆菌ESAT-6基因,将ESAT-6基因与大肠杆菌-卡介苗穿梭质粒载体pMV261重组,得到重组质粒pME.再将BCGα-Ag信号肽序列克隆至pME中,得到重组质粒pSME.后通过电穿孔法将pSME导入卡介苗中,并用抗性筛选、PCR扩增及打点杂交进行鉴定.结果:电转化后的卡介苗能在含10 mg/L卡那霉素的培养基上生长.以重组卡介苗总DNA为模板的PCR扩增得到阳性扩增带,大小与α-Ag信号肽序列加上ESAT-6基因的长度一致.打点杂交中探针与重组卡介苗显示阳性信号.结论:基因重组卡介苗构建成功,并有望分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白ESAT-6.该重组卡介苗既保留了卡介苗中原有的抗原,又增添了新的保护性抗原,且这种抗原可被广泛识别,能强烈诱导宿主T淋巴细胞增殖和持久的免疫记忆,因此ESAT-6重组卡介苗可能具有更好的免疫原性和保护力.本研究为改造卡介苗、发展新型结核病疫苗奠定了基础.
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利用ctxb的自身启动子表达CTB
霍乱毒素B亚单位(CTB)在大肠杆菌表达体系中不能实现良好的分泌性表达.本文拟利用ctxb的自身启动子来实现CTB的高效分泌性表达.PCR方法扩增ctxb的调控序列和结构基因,克隆至pGEM-T载体中,并在其下游链上大肠杆菌核糖体基因的转录终止信号rmBT1T2,构建的表达质粒pGEM-T48转化大肠杆菌JM109和霍乱毒素基因阴性株霍乱弧菌IEM101.结果ctxb在自身启动子的调控下,大肠杆菌JM109和霍乱弧菌IEM101都实现了CTB的分泌性表达.但在pGEM-T48(IEM101)中CTB的分泌性表达量明显高于PGEM-T48(JM109)中的量,两者比例为50:1.因此,pGEM-T48(IEM101)表达体系是较为理想的CTB分泌性表达体系.
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铜绿假单胞菌外毒素A全基因的克隆与分泌性表达
利用PCR技术从铜绿假单胞菌PA103株DNA中扩增到铜绿假单胞菌外毒素A(EPA)全基因,选择合适位点插入pBV221 PLPR启动子下游,构建分泌性表达载体;转化宿主E.coli DH5α、JM109后,热诱导表达;SDS-PAGE分析表明表达产物占菌体总蛋白量的17%左右,分子量69kD左右;分离细胞组分蛋白发现仅有少量重组蛋白以成熟毒素形式分泌到宿主菌的周质间隙,并能检测到Vero细胞毒活性,其余大部分以包涵体形式存在.免疫印迹检测显示,表达产物与兔抗EPA多抗有特异性反应.此项工作为重组EPA的研制建立了有用的技术方法.
关键词： 铜绿假单胞菌外毒素A 分泌性表达 Vero细胞毒性
