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FHIT基因真核细胞表达载体的构建与鉴定
目的构建人FHIT基因真核细胞表达载体.方法采用RT-PCR方法,从人新鲜甲状腺组织的总cDNA中扩增出456 bp的人FHITcDNA片段,然后用KpnⅠ和 BstX Ⅰ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用免疫细胞化学法检测FHIT基因的表达情况.结果人FHIT基因cDNA已经正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中;体外转染MM96L细胞后,可见转染细胞胞浆中有较高量的Fhit蛋白表达.结论本实验所构建的重组质粒为FHIT基因在肿瘤发病机制与防治的研究中提供了有利的分子工具.
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FHIT基因、吸烟与肺癌
肺癌是全世界常见的恶性肿瘤之一,每年死于肺癌的患者超过100万[1].病因学研究显示,与肺癌发生有关的因素主要包括吸烟、职业因素、环境因素、病毒感染、遗传背景以及肺癌的基因易感性等,其中约90%的肺癌与吸烟相关[2].目前大量文献报道脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad, FHIT)基因异常与吸烟、肺癌关系密切.现就FHIT基因、吸烟与肺癌的研究进展做一综述.
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FHIT基因结构、功能及其应用研究进展
近几十年来,随着人们对肿瘤分子生物学的进一步认识,发现人类恶性肿瘤的发生是一个多步骤且牵涉到多重基因事件的复杂过程.在某些恶性肿瘤如白血病和淋巴瘤等疾病中,其恶性过程被认为是解除了基因管制的染色体易位和倒置先激发而终导致肿瘤发生的.失去基因管制的基因功能改变可能包括:致癌基因的激活、抑癌基因功能丧失以及一些修饰基因功能改变等等.而抑癌基因的缺失其活化方式包括:突变、缺失、移位、重排、扩增、高表达等[1].自从1996年Ohta等[2]利用外显子捕获法发现了定位在3P14.2的FHIT基因以来,经过几年的研究,对认为FHIT基因是一个抑癌基因积累了一些证据.在进一步认清FHIT基因本质的基础上,本文将结合一些关于FHIT基因分子生物学的新近发现,对FHIT基因的结构、功能以及其在临床的实践应用综述如下.
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皮肤鳞状细胞癌中FHIT基因启动子甲基化与FHIT蛋白表达的临床意义
[目的]检测皮肤鳞状细胞癌中FHIT基因的异常甲基化及其表达情况,探讨其异常甲基化与皮肤鳞状细胞癌发生的相关机制及其与桩床病理分型的关系. [方法]采用甲基化特异性PCR应方法,测定32例皮肤鳞状细胞癌组织标本FHIT基因启动子甲基化情况,免疫组织化学方法检测其蛋白表达情况. [结果]32例病变癌组织中,有17例发生了甲基化.阳性率为53.1%;皮肤鳞状细胞癌及正常皮肤组织中FHIT蛋白的阳性表达率分别为43.75%(14/32)和100%(20/20),FHIT基因的甲基化与其蛋白的表达和病变组织的组织学分级、淋巴结转移状况均有一定的关联(P＜0.01). [结论]FHIT基因的甲基化可能参与疾病的发生发展,且与其临床病理有一定关系,是影响皮肤鳞状细胞癌预后的重要因素之一.
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骨髓增生异常综合征患者FHIT基因启动子甲基化改变
目的 研究骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者中脆性组氨酸三联基因(fragile histidine triad,FHIT)启动子的甲基化状况及其临床相关性.方法 应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)技术对54例不同阶段MDS患者骨髓标本FHIT基因甲基化状态进行检测.结果 54例MDS患者中26例(48.1%)发生FHIT基因甲基化,FHIT基因甲基化改变与患者的性别、血象、染色体异常等结果均无相关性,但与患者年龄具有显著的相关性(R:-0.291,P=0.033).FHIT基因甲基化频率在难治性贫血/伴有环形铁粒幼细胞的难治性贫血(refractory anemia/refractory anemia with ringed sideroblasts,RA/RAS)(1/6,16.7%)、伴多系病态造血的难治性血细胞减少症(refractory cytopenia with multilineage dysplasia,RCMD)和伴环形铁粒幼细胞的RCMD(refractory cytopenia with multilineage dysplasia with tinged blasts,RCMD-RS)(6/19,31.6%)、难治性贫血伴有原始细胞增多-1型(refractory anemia with excess blasts-1,RAEB-1)(7/11,63.6%)、难治性贫血伴原始细胞增多2型(refractory anemia with excess blasts-2,RAEB-2)(4/7,57.1%)和难治性贫血伴有原始细胞增多转化型/急性髓性自血病(refractory anemia with excess blasts in transformation/acute myeloid leukemia,RAEBt/AML)(8/11,72.7%)之间的差异无统计学意义(X2=8.417,P=0.077),但早期阶段(RA/RAS和RCMD)、晚期阶段(RAEB-1和RAEB-2)以及RAEBt/AML患者之间的差异具有统计学意义(X2:7.938,P:0.019),并且FHIT基因甲基化频率与国际预后评分系统分组预后危险程度也具有显著的正相关性(X2=10.110,P=0.018).结论 FHIT基因甲基化可能是促进MDS疾病进展的分子事件之一.
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外源性FHIT基因表达对肺腺癌细胞株A549恶性表型的逆转作用
目的探讨FHIT(fragile histidine triad)基因表达在肺癌细胞增殖、凋亡、成瘤性中的作用. 方法应用脂质体转染法构建能高效表达外源性FHIT基因的A549-FHIT细胞和作为空载体对照的A549-vector细胞,裸鼠皮下接种构建肺癌移植瘤动物模型,应用逆转录-PCR、Western杂交、免疫组化、流式细胞计数等技术检测外源性FHIT基因转录、表达及对肺癌细胞株增殖、凋亡、成瘤性等的影响. 结果 A549-FHIT细胞的生长曲线、克隆形成率、移植瘤体积和重量均显著低于A549-vector和亲本A549细胞;A549-FHIT细胞凋亡水平显著高于A549-vector和亲本A549细胞;与两个对照组相比,A549-FHIT细胞G0/G1比例显著增高.结论外源性FHIT表达基因能够显著抑制肺癌细胞增殖和分裂,诱导其凋亡,抑制其成瘤性,提示FHIT基因在肺癌中具有抑癌基因的功能.
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肺癌FHIT基因表达下降的临床病理生理意义及与肿瘤细胞增殖、凋亡的关系研究
目的研究FHIT(fragile histidine triad)基因表达下降与人肺癌临床病理生理特征和预后的关系，探讨FHIT基因表达与细胞增殖和凋亡的相关性。方法应用免疫组化法检测了166例肺癌组织标本和37例肺良性病变组织中FHIT基因及Ki-67的表达水平，应用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测其细胞凋亡指数。结果 (1)肺癌组织中FHIT基因表达水平显著低于肺良性病变组织(P＜0.01)；(2)肺癌组织中FHIT基因表达水平降低与肺癌组织学类型、细胞分化程度，患者P-TNM分期、淋巴结转移程度存在相关性(P＜0.05)；(3)肺癌组织中FHIT基因表达水平降低可能与肺癌患者长期大量吸烟有关(P＜0.01)；(4)FHIT基因低表达组肺癌患者的术后长期生存率显著低于高表达组(P＜0.05)；(5)FHIT基因表达水平降低与肺癌细胞的增殖活跃及凋亡受抑可能存在一定程度的相关性(P＜0.01)。结论 FHIT基因可能参与了对肺癌肿瘤细胞增殖和凋亡的调节，其表达下降可能与肺癌的发生、发展过程有关。
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Peutz-Jeghers综合征患者STK11及FHIT基因突变分析
目的 分析Peutz-Jeghers综合征(PJS)患者丝/苏氨酸蛋白激酶基因(STK11基因)与脆性组氨酸三联体基因(FHIT基因)突变情况,明确基因突变与PJS临床特征的关系.方法 分析患者的临床特征,对STK11及FHIT基因所有外显子及侧翼序列进行基因测序,测序结果与基因库中已知的正常序列比较.结果 16例具有典型的Peutz-Jeghers综合征临床特征的先证者中,9例检测出STK11基因外显子区致病性突变,1例已有报道,余8例及另1例发生FHIT基因第10外显子非编码区杂合突变,未见相关报道.相关直系亲属均未检测到以上突变类型.发生STK11基因突变的患者未见FHIT基因突变.PJS患者STK11基因突变率高达56.25％.结论 无论有家族史或散发PJS患者均以STK11基因突变为主要病因,少数存在FHIT基因突变,两基因突变间无明显相关性.FHIT基因可能参与了PJS疾病的发生.
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宫颈癌脆性组氨酸三联基因的表达与血浆中的甲基化状态
目的 探讨宫颈癌患者血浆中脆性组氨酸三联(fragile histidine triad,FHIT)基因5'端CpG岛甲基化状态以及该基因在宫颈癌组织中的表达情况.方法 用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific polymerase chain reaction,MS-PCR)对151例患者的血浆进行FHIT基因甲基化状态的研究,并用免疫组织化学方法检测FHIT蛋白的表达情况.结果 31.13%的患者血浆FHIT基因发生甲基化;59.60%宫颈癌组织FHIT蛋白表达减弱或缺失,其中47.78%存在血浆FHIT基因的甲基化.结论 血浆中FHIT基因甲基化是引起宫颈癌FHIT蛋白表达减弱的重要因素,利用它可以对宫颈癌进行无创伤诊断和预后的评估.
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FHIT基因与消化系统肿瘤
在肿瘤发生过程中,原癌基因激活、抑癌基因失活、误配修复基因改变等起了重要作用.
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非小细胞肺癌中FHIT基因异常甲基化对其蛋白、mRNA表达的影响
背景与目的 脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad,FHIT)是一种新的抑癌基因,其启动子甲基化在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用.本研究的目的 是通过检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中抑癌基因FHIT启动子CpG岛异常甲基化和蛋白、转录表达情况及其相互关系,探讨FHIT基因在NSCLC发生发展中的作用.方法 应用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)、免疫印迹(Western Blot)及RT-PCR测定52例NSCLC组织及其癌旁正常组织(>5 cm)中FHIT的甲基化、蛋白表达和转录水平.结果 NSCLC癌组织中FHIT甲基化率为38.46%(20/52),在癌旁正常组织中FHIT甲基化率为7.6996(4/52),两者差异存在统计学意义(P<0.05);癌组织中FHIT蛋白表达率为28.8%(15/52),癌旁正常组织FHIT蛋白表达率为88.5%(46/52),两者差异存在统计学意义(P=0.000);FHIT mRNA在癌组织中表达率为51.9%(27/52),在癌旁正常组织中全部表达,且表达量明显高于癌组织(P=0.000).结论 在NSCLC中,FHIT基因启动子甲基化频率明显升高,其蛋白表达率明显下降,mRNA表达率下降,提示FHIT启动子甲基化在肺癌的发生和发展中起着一定作用,而且FHIT基因的甲基化与蛋白及mRNA的表达存在一定的关系.
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肺癌前病变、肺癌中FHIT基因表达的临床研究
背景与目的 FHIT基因为近年发现的新的候选抑癌基因,位于3p14.2,跨越FRA3B易脆点,在包括肺癌在内的多种人类肿瘤中均存在异常表达.本研究旨在观察FHIT基因在人肺癌前病变、肺癌中的表达情况,探讨FHIT基因在肺癌发生、发展过程中的可能作用.方法 采用免疫组化方法检测298例甲醛固定、石蜡包埋的标本(包括161例肺癌、51例肺癌前病变、30例正常肺组织、23例肺良性病变和33例肺癌转移淋巴结)中FHIT蛋白表达情况.结果 FHIT蛋白在正常肺组织及肺良性病变组织中均无失表达,癌前病变组织和肺癌组织中失表达率分别为54.9%(28/51)和59.0%(95/161),肺癌转移淋巴结组织中失表达率为78.8%(26/33);肺癌前病变、肺癌及转移淋巴结组织中FHIT蛋白失表达率显著高于正常肺组织及肺良性病变组织(P＜0.001).肺癌组织中FHIT基因表达水平与肺癌组织学类型、肿瘤细胞分化程度、患者pTNM分期、淋巴结转移有密切关系(P＜0.05).FHIT蛋白失表达组肺癌患者的术后5年生存率显著低于表达组(P＜0.01).吸烟组患者FHIT基因失表达率69.1%显著高于无吸烟组49.5%(P＜0.01).结论 FHIT蛋白失表达可能是肺癌发生过程中的早期分子事件,与肺癌的发生、发展及预后有关;吸烟导致FHIT蛋白表达下降可能是诱发肺癌的原因之一.
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人肺癌中FHIT基因表达的临床病理生理意义及与预后的关系研究
目的研究FHIT基因表达与人肺癌临床病理生理特征和预后的关系,探讨FHIT基因在人肺癌发生、发展过程中的可能作用.方法应用免疫组化法检测了166例肺癌组织标本及其癌旁肺组织和37例肺良性病变组织中FHIT基因的表达水平.结果肺癌组织中FHIT基因表达阳性率(63.03%±26.41%)显著低于癌旁组织(83.74%±17.46%),而癌旁组织又显著低于肺良性病变组织(92.98%±5.56%)(P＜0.01);肺癌组织中FHIT基因表达水平降低与肺癌组织学类型、细胞分化程度,患者P-TNM分期、淋巴结转移程度存在相关性(P＜0.05);吸烟组肺癌患者的肺癌组织中FHIT基因表达阳性率(55.14%±27.55%)明显低于非吸烟组(71.93%±22.05%)(P＜0.01);FHIT基因低表达组肺癌患者的术后长期生存率显著低于高表达组(P＜0.05).结论 FHIT基因的表达下降可能与肺癌的发生、发展过程有关.吸烟是导致肺癌患者FHIT基因表达下降的重要原因之一.
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人非小细胞肺癌中FHIT基因转录本异常的研究
目的探讨FHIT基因转录表达异常在人肺癌发生、发展中的作用.方法应用nested RT-PCR方法对35例人非小细胞肺癌(NSCLC)织、癌旁组织和远癌肺组织,10例肺良性病变肺组织以及4株肺癌细胞株中FHIT基因转录表达异常进行了研究.结果 35例肺癌中14例肺癌组织存在FHIT转录表达异常,异常率为40%;在这14例癌组织转录本异常病例中,5例癌旁组织亦见转录本异常(35.71%,5/14)远癌肺组织和肺良性病变组织均未见转录本异常.4株肺癌细胞株均检测到转录本异常.在鳞癌中FHIT基因转录本异常率(58.82%)著高于腺癌(22.22%)P＜0.05)FHIT基因转录本异常与肺癌细胞的分化程度、P-TNM分期、原发肿瘤大小、肿瘤部位,以及患者年龄等均无明显关系(P＞0.05)结论本研究结果表明在NSCLC中存在FHIT基因转录表达异常.FHIT基因异常主要发生在肺鳞癌中,且可能是肺癌发生的早期分子事件.
关键词： 肺肿瘤 FHIT基因 转录表达异常 nested RT-PCR DNA序列分析 -
人NIT1基因原核表达载体的构建和鉴定
背景与目的目前已知FHIT基因为抑癌基因,其结构和功能的异常与肺癌的发生、发展有密切关系,而且可能与NIT1基因存在功能上的相关性.但是,FHIT基因与NIT1基因调控肺癌发生发展的分子机制尚未明了.本研究旨在构建人NIT1基因原核表达载体,为进一步研究人肺癌细胞株中NIT1基因和FHIT基因的关系打下基础.方法应用RT-PCR法获得NIT1基因cDNA,定向克隆到融合表达载体pET-32a中,作双酶切和测序鉴定.结果①克隆的cDNA片断包含了人NIT1基因翻译区的全部序列,翻译区序列与GenBank登录的人NIT1 cDNA序列完全一致.②对构建的原核表达载体做双酶切,获得了预期的目的条带.结论通过RT-PCR和定向克隆的方法,成功构建了人NIT1基因的原核表达载体,为研究人NIT1蛋白的表达和进一步研究人肺癌细胞中NIT1基因和抑癌基因FHIT的关系奠定了基础.
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人非小细胞肺癌中FHIT等位基因缺失和突变的研究
目的探讨FHIT等位基因缺失、突变在肺癌发生、发展中的作用。方法应用PCR-SSCP和DNA序列分析方法对35例人非小细胞肺癌和4个肺癌细胞株中FHIT基因的4个外显子(外显子3、4、5、8)和微卫星D3S1300、D3S1312、D3S1313进行研究，并以远癌肺组织和10例肺良性病变组织做对照。结果在35例肺癌中，22例肺癌发生了一个或两个以上的FHIT等位基因缺失，缺失率为62.86％(22／35)。在鳞癌中，FHIT等位基因缺失率（88.24％，15／17）明显高于腺癌（38.89％，7／18）(P＜0.01)；在吸烟患者中(76.19％，16／21)亦明显高于不吸烟患者(42.86％，6／14)(P＜0.05)。而FHIT等位基因缺失与肺癌的细胞分化程度、P-TNM分期、原发肿瘤大小、部位、患者性别、年龄及有无转移均无明显关系（P＞0.05）。Lewis肺癌、A549细胞株亦有FHIT基因部分缺失。4例肺癌组织具有微卫星灶D3S1312点突变，经DNA序列分析显示均为D3S1312微卫星灶基因的87位点密码子发生了CT点突变。结论 FHIT基因异常主要以等位基因的缺失为主，而点突变发生率较低。FHIT等位基因缺失主要发生在肺鳞癌和吸烟患者中，且FHIT基因可能为烟草致肺癌的靶基因，其等位基因缺失可能是肺癌的早期分子事件。
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脆性组氨酸三联基因蛋白在子宫内膜癌中的表达
目的研究脆性组氨酸三联基因(FHIT)蛋白在子宫内膜癌中的表达及其与预后相关因素分析.方法应用免疫组织化学S-P法检测FHIT蛋白在14例正常子宫内膜及38例子宫内膜癌石蜡标本中的表达,分析FHIT蛋白表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系.结果FHIT蛋白定位于正常子宫内膜腺体细胞的细胞浆.7例增生期和7例分泌期正常子宫内膜腺体细胞均为强阳性染色,间质及肌层组织染色阴性.FHIT蛋白亦定位于子宫内膜癌细胞胞浆,有47.37%(18/38)PHIT蛋白表达阴性.FHIT蛋白表达异常与子宫内膜癌的深肌层浸润、淋巴结转移、晚期肿瘤、低分化癌及肿瘤家族史明显相关(P＜0.05),而与肿瘤的病理类型无关(P＞0.05).结论FHIT基因失活可能在子宫内膜癌发生中起重要作用;FHIT蛋白表达异常可能与子宫内膜癌的预后相关.
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FHIT基因杂合性丢失及微卫星不稳定性与宫颈癌发生发展的关系
目的探讨FHIT基因杂合性丢失(LOH)及微卫星不稳定性(MI)在宫颈癌发生发展中的作用.方法选择FHIT基因的两个微卫星多态标记对60例浸润性宫颈癌及35例宫颈上皮内瘤样病变(CIN)组织进行LOH和MI检测.结果在D3S1234和D3S1300座位上,浸润性宫颈癌的LOH发生率分别为45.0%(27/60)、38.3%(23/60),MI频率分别为18.3%(11/60)、11.7%(7/60).CIN的LOH频率分别为42.9%(15/35)、37.1%(13/35). MI频率分别为11.4%(4/35)、8.6%(3/35).宫颈癌及CIN在两个位点的LOH和MI无统计学差异(P>0.05);两位点的LOH阳性率在宫颈癌组织高中分化与低分化之间有统计学差异(P<0.05);双座位的LOH及MI在宫颈癌有无淋巴结转移间有统计学差异(P<0.05);高级别CIN(CINⅢ及原位癌)患者的LOH和MI的发生率高于低级别CIN(CINⅠ、Ⅱ).结论 FHIT基因的改变是CIN发生过程中的较晚期事件;FHIT基因的LOH对于宫颈癌的筛查、早期诊断及判断预后可能具有临床实用价值.
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FHIT基因与宫颈癌的相关性研究
目的探讨FHIT基因在宫颈癌发生中的作用及与宫颈癌的临床分期和组织分化程度间的关系.方法选择FHIT基因的2个微卫星多态标记对42例宫颈癌进行杂合性丢失(LOH)和微卫星不稳定性(MI)分析.结果在D3S1234和D3S1300座位上,LOH频率分别为52.5%(21/40)、70.8%(17/24),MI频率分别为22.5%(9/40)、20.83%(5/24).FHIT基因改变与宫颈癌的临床分期和组织分化程度无关.结论 FHIT基因参与了宫颈癌的发生.对于宫颈癌的诊断和筛查可能具有实用价值.
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FHIT、HPV16/18在宫颈鳞癌中的表达及意义
目的 探讨脆性组氨酸三联体(Fragile histidine triad)基因(FHIT)HPV16/18与宫颈癌发病的关系.方法 采用免疲组化法检测50例宫颈鳞癌组织、50例正常宫颈组织中的FHIT基因表达情况和HPV感染情况.结果 FHIT在正常宫颈组织中的阳性表达率为72%(36/50),在宫颈鳞癌组织中的阳性表达率为32%(16/50),明显低于正常宫颈组织组P<0.001.HPV16/18在正常宫颈组织的阳性率为12%(6/50),在宫颈鳞癌组的阳性生率为72%(36/50),两组间比较有统计学差异P<0.001.相关分析提示FHIT蛋白缺失与HPV16/18感染无相关关系.结论 FHIT基因缺失及HPV16/18感染与宫颈癌的发生有关.HPV感染与FHIT蛋白缺失异常是导致宫颈鳞癌的两个独立原因.
关键词： FHIT基因 HPV16/18感染 宫颈鳞癌
