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5株新疆出血热病毒分子流行病学研究
目的从分子水平揭示中国新疆出血热(XHF)病毒基因结构与功能的关系,寻找传播途径及流行原因. 方法对分离自新疆的5株XHF病毒进行S基因片段的克隆和测序,与其他克里米亚-刚果出血热(CCHF)的S基因序列进行比较和分析. 结果 5株病毒S基因全长均为1 672个核苷酸,开放阅读框均为1 449个核苷酸,编码一个含482个氨基酸的蛋白.新疆分离毒株的S基因核苷酸序列同源性(93.0%～99.5%)明显高于其他国家分离毒株的S基因核苷酸序列.系统发生树状图显示新疆毒株在一个分支之下形成独立的群体,明显区别于来自其他地区的CCHF病毒并且又进一步分为三组.结论不同毒株的S基因序列差异不完全取决于病毒分离的宿主、地域和时间.
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新疆克里米亚-刚果出血热病毒株S基因分子生物学特性研究
目的 对新疆地区2005年分离自亚洲璃眼蜱的3株克里米亚-刚果出血热(CCHF)病毒株进行S基因序列测定并分析比较该病毒的分子生物学遗传特性.方法 应用逆转录聚合酶链反应扩增出病毒基因组S片段,纯化后直接测定其核苷酸序列,用DNASTAR软件对测定的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行比较分析.结果 3株病毒S基因都由1673个核苷酸组成,开放阅读框均为1449个核苷酸,编码482个氨基酸,3株病毒间核苷酸及氨基酸同源性序列为99.5%,与其他已发表的9株CCHF病毒株的核苷酸序列同源性在92.7%～99.8%之间.这3株病毒与已分离的7001和79121株同属1个基因组,序列相差2%～3%之间.与尼日利亚的原型株IBAR10200的差异性为13%,远大于与中国原型株66019之间的6.8%的差异.结论 中国株为相对独立的一个类群,新疆自治区境内不同地区分离的CCHF病毒S基因分子结构差异相对较小.
关键词： 克里米亚-刚果出血热 S基因 核苷酸序列 系统发生树 -
中老缅边境蚊虫标本中Nam Dinh病毒的分离和鉴定
2012年在云南省南部中老缅边境地区采集的库蚊中分离到3株病毒(YN12039、YN12040、YN12060),该病毒只引起C6/36细胞发生病变.负染电镜观察病毒颗粒呈球形,直径60～80 nm,有囊膜,表面有刺突.采用RTPCR方法对分离株的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA-polymerase,RdRp)、HEL1 (superfamily 1helicase)、S蛋白(spike protein)基因进行扩增,同源性分析显示3株云南新分离株与Nam Dinh病毒(NDiV) RdRp、HEL1、S蛋白氨基酸序列相似度高,均为98％以上.系统进化分析结果表明,3株云南新分离株与NDiV的亲缘关系近,处于同一进化分支.该研究结果丰富了NDiV病毒的信息,对NDiV病毒分子特征、分布区域和物种嗜性等特征提供了数据参考.
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猪传染性胃肠炎病毒S基因全抗原位点片段及猪呼吸道冠状病毒缺失片段表达产物的反应原性比较
猪呼吸道冠状病毒(PRCV)是猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的自然缺失株,二者主要区别在于PRCV的S基因缺失B、C两个主要抗原位点.因此,利用RT-PCR技术分别扩增TGEV Purdue毒株S基因近N端的S1和S1-2两个片段,将之克隆到pGEX-KG原核表达载体的GST基因下游,经表达,获得大小约52kD和108kD两种融合蛋白,表达量分别占菌体总蛋白的45%和35%,主要以包涵体的形式存在.利用TGEV和PRCV两种阳性血清进行Western blot检测,当第一抗体为TGEV阳性血清时,可检测到52kD和108kD两条带;而当第一抗体为PRCV阳性血清时,只检测到108kD一条带.结果表明这两种融合蛋白具有良好的反应原性,且可用于TGEV和PRCV的鉴别诊断,为进一步研制开发TGEV和PRCV的鉴别诊断试剂盒奠定了基础.
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猪流行性腹泻病毒CH/JL毒株S基因的克隆、序列分析及线性抗原表位区的鉴定
以猪流行性腹泻病毒CH/JL毒株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得的3个相互重叠的cDNA克隆覆盖了S基因,序列比对结果表明:PEDV CH/JL株S基因与CV777、Brl/87、JS、KPEDV和Chinju99毒株S基因核苷酸序列的同源性分别为96.97%、96.87%、96.41%、94.02%和93.93%,氨基酸序列的同源性分别为96.17%、95.88%、96.10%、92.36%和92.05%;分子进化树分析结果显示,PEDV CH/JL株S基因与JS毒株S基因亲缘关系近,处于同一群.利用DNAstar Protean程序预测了PEDV CH/JL株S蛋白一个抗原表位区(83～276aa),将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1后转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,在终浓度1.0mmol/L的IPTG诱导下获得了表达,Western blot结果显示,预测的抗原表位区GST融合蛋白能与猪流行性腹泻病毒多克隆抗血清反应,提示该抗原表位区含有线性抗原表位.
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黑龙江省大林姬鼠中汉坦病毒的分离及其S基因序列分析
为了研究黑龙江省大林姬鼠携带汉坦病毒(HV)的分子特征,对黑龙江省大林姬鼠分离株NA33的S基因进行了扩增和序列分析.结果表明,NA33株S基因全长由1693 nt组成,TA含量丰富,编码N蛋白的ORF起始于37nt,终止于1326 nt,编码的蛋白长429 aa,符合HTN型编码.与HV参考毒株进行比较,NA33与Amur类汉坦病毒同源性高,与其它HTN型相对较低,与SEO等同源性更低.N蛋白进化树分析表明,NA33位于Amur类病毒所在支系,并且与俄罗斯远东和吉林大林姬鼠分离株亲缘关系更接近,体现了一定的宿主依赖性和地理簇集性.序列分析发现,NA33的N蛋白具有Amur类汉坦病毒保守的氨基酸位点.黑龙江省大林姬鼠携带Amur类汉坦病毒,是重要的传染源.
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2010～2012年华中地区猪流行性腹泻病毒分子特征和遗传进化分析
2010年底开始,猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)在中国境内出现严重暴发.为探讨该病突然再次暴发的原因,对2010年10月至2012年6月于华中地区11个地市收集的12株猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S、M和ORF3基因进行RT-PCR扩增、克隆及测序,并对其序列变化、遗传进化关系、抗原位点、糖基化位点和多肽极性进行分析.结果显示,12株PEDV流行毒株S、M和ORF3基因部分核苷酸及氨基酸的改变使其关键序列明显不同于以往毒株,其中有11株流行毒株的S基因比现用疫苗毒株CV777多9个核苷酸,而且在其S1区N'端存在大量的氨基酸突变.遗传进化分析显示,12株PEDV华中地区毒株与2007～2009年韩国毒株、2007～2008年泰国毒株、2009～2010年越南毒株、2011年日本毒株及2010～2012年中国其它地区流行毒株亲缘关系均较密切,而与欧洲株(CV 777、Br1/87)、中国现用疫苗株(CV777)及2003～2007年中国分离株(LJB/03、JS-2004-2、DX、QH、LZC)亲缘关系均较远.与现用疫苗株(CV777)相比,流行毒株S蛋白的抗原位点、糖基化位点和跨膜螺旋均有明显改变,提示PEDV在近年呈现快速变异和进化的趋势,因而可能需要选择更有效的疫苗株来控制PEDV的暴发.
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HBsAg逆转录病毒表达质粒的构建及其在真核细胞中的表达
目的构建乙型肝炎表面抗原(HBsAg)逆转录病毒表达质粒并探讨其在真核细胞中的表达.方法用限制性内切酶从重组质粒pBKS-S中切出HBsAg基因,并亚克隆到逆转录病毒表达质粒pLXSN,构建成重组质粒pLXSN-S;经限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定无误后,用阳离子脂质体转染法将重组质粒pLXSN-S分别转染HepG2、K562和EB病毒转化B淋巴母细胞(EBVC);用ELISA法检测HBsAg在细胞培养上清中的表达.结果经酶切和DNA序列测定鉴定证实重组质粒构建正确;质粒pLXSN-S转染细胞培养上清均可检测到HBsAg.结论逆转录病毒表达质粒pLXSN-S构建成功并可在真核细胞中稳定表达.
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HBsAg真核表达质粒的构建和鉴定
目的构建HBsAg真核表达质粒.方法用PCR的方法从质粒pEcob6中扩增出HBsAg基因,并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建成重组质粒pcDNA3.1-S;然后用限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定.结果经酶切和DNA序列测定鉴定,证实重组质粒构建正确.结论真核表达质粒pcDNA3.1-S构建成功.
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四川省两县(区)乙型肝炎病毒S基因和P基因变异分析
目的 分析四川省两县(区)乙型肝炎(乙肝)病毒(Hepatitis B Virus,HBV)S基因和P基因变异.方法 从乙肝病毒表面抗原、乙肝病毒e抗原均阳性的血清中提取病毒脱氧核糖核酸,经聚合酶链反应和核苷酸测序后,比较和分析S基因和P基因核苷酸和氨基酸变异.结果 47例慢性HBV感染者血清标本中,12份标本在"a"决定簇内出现氨基酸变异(25.53%),分别为T126A、I126T/S、P127T、T131N、M133L、M133T、T140I;变异主要集中在"a"决定簇的第1环上(92.86%,13/14).1份标本逆转录酶C域中出现rtV2071变异.结论 自然发生的氨基酸变异主要集中在"a"决定簇的第1环上,其抗原性已改变,对乙肝疫苗接种人群构成了潜在的威胁.拉米夫定耐药株也可在未接受核苷(酸)类药物治疗的病人中发现.
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乙型肝炎病毒S基因变异的研究进展
乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)S基因变异可引起乙肝疫苗免疫失败,而长期免疫压力又可以促进HBV变异的发生,基因型和血清型也与HBV S基因变异有明显的关系.国内HBV标准株缺乏,可影响变异株的判定.常规的临床检测方法易对变异株产生漏检,需要应用乙肝病毒表面抗原多克隆抗体试剂或研制"免疫逃逸突变株"的特异性抗体.目前发现145Arg变异株和129Leu变异株等有HBV抗原性或免疫原性的改变,而变异株的传染性、致病性、流行病学特征等问题有待进一步研究.
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秦皇岛口岸褐家鼠携带汉坦病毒S基因序列分析
目的 了解河北省秦皇岛口岸褐家鼠携带汉坦病毒情况及其基因型.方法 褐家鼠标本于2016年7月28日采自河北省秦皇岛港渤海船务有限公司货堆区和生活区,运用实时荧光PCR检测标本汉坦病毒核酸并进行核苷酸同源性和进化树分析.结果 从1只褐家鼠中检测到汉坦病毒核酸阳性,经汉坦病毒S基因序列测定和同源性分析,与国内外汉城型(SEO型)汉坦病毒相似性较高(87.3％～97.9％),与汉滩型(HTN型)汉坦病毒及其他类型汉坦病毒相似性较低(<55％).系统进化树显示该病毒株与SEO型汉坦病毒汇聚一支,且与S3亚型在同一分支,与辽宁省褐家鼠中的病毒株亲缘关系近.结论 河北省秦皇岛口岸褐家鼠携带的汉坦病毒SEO型为S3亚型,与河北省所流行的汉坦病毒种类一致.
关键词： 褐家鼠 汉坦病毒 实时荧光聚合酶链式反应 S基因 -
一例输入性非典型肺炎患者病原体的分离鉴定及其变异性研究
目的对一例输入性非典型肺炎病例的病原体进行分离鉴定,研究其变异情况,为该病的诊断和防治提供依据. 方法用Vero E6细胞对病人的咽拭标本进行分离培养,并对分离物使用电镜、间接免疫荧光(IFA)、巢式PCR及S基因核苷酸序列测定等方法进行分析. 结果在该病人的咽拭标本中,成功地分离到一株冠状病毒(F69),将部分S基因测序并与不同地区非典型肺炎病人分离株进行比较,表明分离到的毒株为一种新型冠状病毒. 结论目前存在冠状病毒的变异株,病毒核苷酸序列与广东省原发性SARS病人分离到的冠状病毒有所不同.
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新疆出血热病毒S基因在真核系统的克隆和表达
目的在真核系统表达XHFV S基因片段,制备安全、特异、便于操作的S蛋白. 方法设计引物,扩增得到S基因编码片段,用杆状病毒表达载体pFastBac HT b克隆S基因,并在昆虫细胞中表达S基因. 结果地高辛探针杂交和PCR扩增结果表明成功地构建了含XHFV S基因片段的pBac-Sxhf质粒.SDS-PAGE分析表达产物在相对分子质量(Mr)为66×103下方出现1条明显的蛋白条带,Western blot发现该蛋白带可以与抗XHF病毒核蛋白单克隆抗体发生反应. 结论构建的含XHFV S基因的重组杆状病毒可以在昆虫细胞表达S蛋白,该蛋白可与特异性抗体相结合.
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汉坦病毒Hunan03株S基因分子特征及核蛋白结构分析
目的 测定汉坦病毒S基因编码区序列,分析和预测其编码的核蛋白结构,用于指导汉坦病毒诊断性抗原的筛选.方法 对免疫荧光技术(IFA)阳性的鼠肺组织应用RT-PCR法扩增汉坦病毒S基因完整开放读码框(ORF),扩增产物克隆到pGM-T载体,转化E.coli TOP10,通过蓝白斑试验和PCR筛选阳性克隆后进行基因序列测定；利用NCBI和Swiss-Prot/TrEMBL数据库中相关基因与蛋白结构分析软件包,如BLSAT、ProtParam、PredictProtein等对S基因的组成、结构、生物学特征及蛋白二级结构进行预测和分析.结果 PCR扩增产物大小约1290 bp；构建了pGM-T/S载体并测序成功；S基因序列中ORF全长1290个核苷酸残基,GC含量为44.11％,AT含量为55.89％,包含429个氨基酸(20种)；序列递交至GenBank后获得的登录号为JN712306；与原型株76-118(No.M14626)核苷酸同源性为83％,氨基酸同源性为98％,存在10个非特异性的变异位点；蛋白总平均疏水性为-0.405；二级结构中含3个跨膜区、4个非跨膜区,包含55％的螺旋结构,6.1％的折叠结构和38.9％的环结构.结论 汉坦病毒S基因的测序和生物信息学的分析,揭示了核蛋白基因结构特征,为诊断性抗原的研究奠定了基础.
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血清乙型肝炎表面抗原和表面抗体共阳性慢性HBV感染者病毒S基因变异分析
目的 探讨乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和表面抗体(HBsAb)共阳性患者乙肝病毒S基因区氨基酸变化特点,了解分子病毒学特征.方法 对26例HBsAg和HBsAb共阳性且DNA阳性的慢性HBV感染者(实验组)和随机选取的39例HBsAg阳性HBsAb阴性且DNA阳性慢性HBV感染者(对照组)的HBV DNA S区基因序列进行PCR扩增和测序,并对S区氨基酸序列进行比对分析.结果 HBsAg和HBsAb共阳性组S基因区氨基酸突变高于对照组,两者差异具有统计学意义(P＜0.05)；在a决定簇(aa124 ～147)尤其是第1个茎环结构内(aa124 ～ 137)氨基酸突变频率明显高于对照组(5.49％vs 1.09％,P＜0.05).结论 HBsAg和HBsAb共阳性患者S基因a决定簇第1个茎环结构氨基酸变异明显增加,推测与HBsAg和HBsAb共阳性现象的发生可能有相关性.
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HBsAg阴性/HBV DNA阳性与S基因变异的关系——附8例报告
目的 研究无锡地区HBV感染者HBsAg缺失与S基因变异的关系,探讨其形成机理.方法采用ABBOTT测定HBV M;套式PCR检测HBV DNA并作S基因序列分析;荧光定量法测定HBV DNA含量.结果 8例HBsAg缺失者S基因出现了变异,导致HBsAg肽63、82、89、90、91、101、115、154位氨基酸替换,且89、90位氨基酸为联合变异;该模式75%(6/8)系慢性肝炎病人,87.5%(7/8)未使用免疫制剂,其HBV DNA含量是低的,而血清抗-HBs中位数值达239.1mU/ml.结论 HBsAg缺失模式多为自然发生的变异,变异主要发生在a决定簇以外部分,可改变HBsAg的抗原性,使其不能被现行的试剂所检出,此外HBsAg阴性也与血液中HBV DNA含量低有关.
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HBsAg、抗HBs共存与HBV基因型及基因变异的关系
目的探讨无锡地区HBV感染者HBsAg与抗HBs共存模式与基因型、S基因变异、病毒复制的关系.方法采用微粒子捕获酶联放射免疫法及ELISA测定HBV M;套式PCR扩增HBV DNA,并作序列分析;荧光定量法检测HBV DNA含量.结果抗HBs阳性血清加入多价HBsAg后,抗HBs可阴转;21份血清出现S区多位点变异,造成HBsAg肽36、47、63、77、89、90、115、126、129、139、154位氨基酸替换,该变异不影响病毒复制;本模式中B基因型1例(3.2%),C基因型30例(96.8%),没有发现A、D、E、F、G基因型;基因变异与否和基因型无显著性差异,P＞0.05.结论S基因变异可改变HBsAg抗原性,导致HBsAg与抗HBs结合力降低,以及检测灵敏度的提高,这些是造成HB-sAg与抗HBs共存的原因;本模式以C基因型占绝对优势,且基因型与基因变异无相关性.
关键词： 乙型肝炎表面抗原与表面抗体 基因型 S基因 变异 -
HBsAg/HBsAb双阳性慢性乙型肝炎患者HBV S基因免疫逃逸相关变异分析
目的 分析HBsAg/HBsAb双阳性慢性乙型肝炎患者HBV S基因主要亲水区免疫逃逸相关位点变异特点.方法 收集89例 HBsAg/HBsAb双阳性和148例HBsAg单阳性的慢性乙型肝炎患者血清及临床资料,提取患者血清HBV DNA,扩增患者HBV S基因并进行测序,应用DNASTAR Lasergene MegAlign软件对主要亲水区已有文献报道的46个免疫逃逸相关位点及新增N-糖基化变异进行比对分析.结果 2组患者在年龄、ALT、TBIL、HBV DNA载量和HBeAg 阳性率方面差异均无统计学意义(P均<0.05).HBsAg/HBsAb 双阳性患者HBV S基因主要亲水区变异的总检出率为31.46%,明显高于HBsAg单阳性患者的18.92%(P<0.05),其中sL110I/S、sT113N/S、sT131I/N/P和sS143L/M/T的变异检出率明显高于单阳性组;双阳性患者多位点联合变异检出率亦明显高于单阳性患者(20.22% vs. 6.08%,P<0.05).双阳性患者新增N-糖基化变异检出率高于单阳性患者(7.87% vs. 2.03%),差异具有统计学意义(P<0.05).结论 HBsAg/HBsAb双阳性患者比HBsAg单阳性患者的HBV S基因免疫逃逸相关变异种类更多,单位点和多位点联合变异检出率更高,并且新增N-糖基化变异检出率也更高,这些变异可能是引起慢性乙型肝炎患者HBsAg/HBsAb双阳性共存的驱动因素之一.
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不同结合臂长10-23 DNAzymes对乙型肝炎病毒S基因和C基因表达的抑制作用
目的探讨不同结合臂长10-23 DNAzymes在2.2.15细胞内对乙型肝炎病毒S基因和C基因表达的抑制作用.方法设计并合成不同结合臂长的10-23 DNAzymes,能分别针对乙型肝炎病毒S基因和C基因开放阅读框A157UG和A1816UG.不同的10-23 DNAzymes分别转染2.2.15细胞,放射免疫分析法测定2.2.15细胞培养上清中HBsAg和HBeAg水平,实时荧光定量PCR法测定2.2.15细胞培养上清中HBV DNA水平.MTT法检测细胞毒性.结果不同结合臂长的10-23DNAzymes在0.1～2.5 μmol/L浓度范围内均能有效抑制HBsAg和HBeAg的表达,抑制效应可长达72 h.在同一剂量相同转染时间的条件下,不同结合臂长的10-23 DNAzymes对HBsAg和HBeAg表达的抑制率呈以下关系:DrzBS-9＞DrzBS-8＞DrzBS-7;DrzBC-9＞DrzBC-8＞DrzBC-7.DrzBS-9和DrzBC-9在2.5 μmol/L剂量条件下,转染48 h后对HBsAg和HBeAg表达的抑制率可分别高达95%和92%.不同结合臂长的10-23 DNAzymes对2.2.15细胞培养上清中HBV DNA水平并无明显影响.MTT细胞毒性检测表明,在0.1～2.5 μmol/L浓度范围内未见10-23 DNAzymes对2.2.15细胞的毒性作用.结论不同结合臂长10-23 DNAzymes在2.2.15细胞内对乙型肝炎病毒S基因和C基因表达均有一定的抑制作用,DrzBS-9和DrzBC-9的抑制作用较强.
关键词： 肝炎病毒 乙型 10-23 DNAzyme S基因 C基因
