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脂质体包裹CpG ODN和肿瘤抗原治疗肝癌的免疫效应
目的 探索脂质体、CpG寡核苷酸(ODN)以及Hepa 1-6肝癌细胞裂解物联合应用治疗肝癌的免疫效果.方法 建立C57BL/6小鼠肝癌模型,以PBS、ODN+Hep(肝癌细胞Hep) 、Lip(Lipofectamine脂质体)+HDN+Hep荷瘤鼠背部皮下注射,各组小鼠肝脏HE染色,FCM检测小鼠脾脏CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC、NK1.1-FITC的组成,ELISA法测免疫小鼠血清中IFN-γ、IL-4水平.结果 脂质体包裹CpG ODN+Hepa 1-6肝癌细胞裂解物中CD3-FITC、CD4-FITC 、CD8-FITC、NK1.1-FITC的体外杀伤活性以及荷瘤小鼠血清中IFN-γ、IL-4水平均显著高于CpG ODN+Hep组以及PBS组.结论 脂质体包裹CpG ODN+Hep能显著提高机体的免疫功能,尤其是特异性细胞免疫功能.
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CpG寡核苷酸对C57BL/6小鼠肝癌模型影响的初步研究
目的 建立C57BL/6小鼠肝癌模型并研究CpG寡核苷酸(ODN)对C57BL/6小鼠肝癌模型的治疗效果.方法 用HE染色鉴定C57BL/6小鼠肝癌模型.肝癌模型建立后,分别用PBS及CpG寡核苷酸处理C57BL/6小鼠肝癌模型,并用FCM检测小鼠脾脏CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC、NK1.1-FITC的组成,ELISA法测免疫小鼠血清中IFN-γ、IL-4水平.结果 成功建立C57BL/6小鼠肝癌模型,ODN处理组的肝癌细胞裂解物中CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC、NK1.1-FITC的体外杀伤活性以及荷瘤小鼠血清中IFN-γ、IL-4水平均显著高于PBS组.结论 CpG ODN能够提高小鼠对肝癌的免疫功能,尤其是特异性细胞免疫功能
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乙肝疫苗联合含CpG基序寡脱氧核苷酸和卡介苗对小鼠的免疫应答影响
目的:观察乙肝疫苗联合CpG ODN和卡介苗免疫小鼠,对小鼠抗HBs水平和细胞免疫的影响.方法:不同剂量乙肝疫苗单用或联合CpG ODN或卡介苗免疫小鼠,用ELISA方法检测抗HB s水平,流式细胞仪检测外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的百分比和比值.结果:免疫4 wk后,中、高剂量乙肝疫苗联合CpG ODN组抗HBs水平显著高于低剂量乙肝疫苗组(420.56±55.66 vs 181.62±41.25,t=0.013,P＜0.05;403.38±63.85 vs 181.62±41.25;t=0.024,P＜0.05).但中、高组间无差别.CpG ODN联合组与单用乙肝疫苗组比较,联合低、中剂量乙肝疫苗抗HBs水平较单用乙肝疫苗明显升高(181.62±41.25 vs59.16±18.43,t=0.022,P＜0.05;420.56±55.66 vs241.82±23.84,t=0.018,P＜0.05).但高剂量乙肝疫苗联合组与单用乙肝疫苗比较两组间未显示明显差别.且以CpG ODN联合中等量乙肝疫苗产生的抗HBs水平高.卡介苗联合组与单用乙肝疫苗组无差别,但在联合低、中剂量乙肝疫苗抗HB s水平低于CpGODN联合组.CpG ODN联合组CD4+T淋巴细胞百分比和CD4+/CD8+比值明显高于单用乙肝疫苗组和卡介苗联合组(CD4+:38.30±1.68 vs 31.47±2.15,t=0.018,P＜0.05;38.30±1.68 vs 29.31±2.97,t=0.013,P＜0.05;CD4+/CD8+:9.01±0.38 vs 6.45±0.39,t=0.000,P＜0.05;9.01±0.38 vs 6.99±0.79,t=0.029,P＜0.05).结论:CpG ODN联合乙肝疫苗不仅能诱导出高水平的抗HBs,而且对细胞免疫也有调节作用.
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CpG寡核苷酸在肿瘤治疗中的应用研究进展
肿瘤的免疫治疗可以追溯至19世纪后期,当时纽约的一个外科医师William Coley就已开始运用细菌的提取物治疗肿瘤.
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CpG ODN作为黏膜免疫佐剂的研究进展
经黏膜免疫因其简便易行、可同时激发黏膜免疫和系统免疫应答等优点受到极大关注.但由于存在黏膜屏障,能有效介导黏膜免疫应答的佐剂已成为研究热点.在诸多在研佐剂中,CpG ODN具有极强的黏膜免疫激活作用,诱导以Th1型为主的免疫应答,具有广阔的应用前景,本文综述了CpG ODN作为黏膜免疫佐剂的研究进展.
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CpG ODN佐剂序列的筛选及其免疫刺激活性研究
目的 设计和筛选对入PBMC细胞和小鼠脾细胞具有免疫刺激活性的CpG ODN序列,研发能用于人用疫苗的有效核酸佐剂. 方法 根据具有免疫刺激活性的CpG ODN序列结构特点,设计并合成出15条候选序列,分别合成并进行非硫代和硫代修饰.分选健康人PBMC细胞及Balb/c小鼠脾细胞,以不同CpG ODN进行体外刺激,MTT法检测CpG ODN诱导细胞增殖水平.随后将筛选出的有效CpG ODN序列与人类基因组序列进行同源性比较,以评估其安全性. 结果 在刺激人PBMC和小鼠脾细胞72h后,硫代和非硫代修饰的15条序列A值均高于阴性对照组,其中IMB-AC5序列刺激人PBMC后A值分别达到0.377和0.334,与阳性对照ISS1018序列A值(0.387和0.338)接近;刺激小鼠脾细胞72h后,A值同样高于其他序列,达到0.571和0.486,与阳性对照ISS1018序列A值(0.588和0.464)接近.综合上述结果,选择5号非硫代序列作为候选佐剂.同源性比较结果显示,该序列与人类基因组序列没有同源性,与部分蛋白编码基因的同源性只有50％ ～65％,此外其部分序列与入18号染色体上的一些重复序列有同源性,高同源性达62％.证明筛选出的新型CpG ODN佐剂IMB-AC5安全性较高.结论 设计筛选出对人PBMC细胞和小鼠脾细胞具有免疫刺激活性的CpG ODN序列IMB-AC5,与人类基因组序列具有较低同源性,为进一步研发人用疫苗佐剂奠定基础.
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大鼠骨髓增生异常综合征基因治疗及其机制研究
目的 应用反基因V-erbB寡核苷酸(ODN)产品对大鼠骨髓增生异常综合征(MDS)动物模型进行基因治疗,观察其疗效和可能的毒性反应. 方法 尾静脉注射或口服治疗.对42只动物应用不同给药方法和剂进行治疗.(1)尾静脉注射给药,以常规剂量(D)0.56mg/kg和0.5×D两个剂量对17只大鼠MDS进行治疗.并以8只未经任何治疗的MDS为对照.在2～3个月的观察期,17只大鼠MDS均有骨髓原始和早幼粒细胞百分比(%)的下降,其中,94.1%(16/17)大鼠骨髓象恢复正常或接近正常;对照组8只MDS,3只从RA发展为RAEB.4只死于内脏出血,未见逆转为正常者.(2)口服用药14只动物,分别以1×D、0.5×D和0.25×D 3种不同剂量. 结果 仅1×D有效,其余2种剂量均无效.(3)将反基因V-erbB寡核苷酸与CpG寡核苷酸联合应用,对MDS、AEL和AML进行尾静脉注射治疗,发现此2种寡核甘酸治疗,显效时间明显缩短.但上述方案仅对MDS和AEL有效,而对AML则无效.(4)疗效原理研究证明,反基因V-erbB ODN能抑制大鼠MDS中白血病的发展,而中心错配的反基因V-erbB ODN和正基因V-erbB ODN则不能. 结论 在0.56mg/kg剂量下,此产品对大鼠MDS,不论静脉注射或口服用药均有明显的疗效,且毒性不显.治疗恢复期间大鼠平均体重增加98g且生育能力完好,说明此产品具有临床应用价值;反基因v-erbB ODN通过形成巩固三链DNA结构,抑制内源性V-erbB表达和扩增,从而显示疗效.
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利用小鼠脾细胞上清抗病毒活性建立新型抑制性ODN的体外筛选方法
目的:通过检测小鼠脾细胞上清抗病毒活性,建立一种体外筛选小鼠敏感的新型抑制性寡聚脱氧核苷酸(ODN)的方法,为后续小鼠体内实验提供抑制性ODN的体外筛选方法.方法:将小鼠脾细胞分为对照组、CpG 2216刺激组,收集不同浓度(0、0.25、0.50、1.00、2.00.4.00、8.00、16.00及32.00 mg·L-1)的CpG 2216刺激上清及CpG 2216作用小鼠脾细胞不同时间(3、6、12、24、48、72及96 h)的刺激上清,通过VSV病毒保护实验检测的A578评价各组上清的抗病毒活性,确定CpG 2216的佳作用浓度、作用时间及刺激上清稀释度;再将小鼠脾细胞分为对照组、CpG 2216刺激组、CpG 2216+抑制性ODN(A151)组,同上确定A151的佳作用浓度;将小鼠脾细胞分为对照组、CpG 2216刺激组、CpG 2216+抑制性ODN(MAT01～06)组,应用上述优化的实验条件如各ODN剂量、作用时间等处理细胞后,收集刺激上清,采用VSV病毒保护实验,观察各抑制性ODN的抑制作用,以初步判定此方法的可行性.结果:筛选方法确定为:浓度为5×106·mL-1的小鼠脾细胞铺于96孔圆底细胞培养板,加入CpG 2216至终浓度2 mg·L-1和/或抑制性ODN至终浓度16 mg·L-1,孵箱中培养24 h后收集上清,1:4稀释上清后加入已贴壁的L929细胞板内,共孵育18 h后弃上清,加入VSV病毒液继续培养48 h.弃净上清后结晶紫染色、脱色并检测A578.此种筛选方法可以区别本室自行设计的抑制性ODN之间的抑制活性.结论:成功建立了抑制性ODN抑制小鼠脾细胞抗病毒活性的筛选方法,抑制性ODN的小鼠体外筛选方法的建立,为后续抑制性ODN在小鼠体内的生物学活性观察提供了体外筛选平台.
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102 CpG DNA的免疫学作用及其应用
CpG基序是以未甲基化CpG为核心的的寡聚脱氧核苷酸,对人及动物具有强烈的免疫刺激功能.CpG DNA可以直接激活抗原递呈细胞,诱导其产生IL-12、TNF-α等Th1型细胞因子;还可以间接刺激NK细胞分泌IFN-γ.鉴于它可优势诱导Th1为主的免疫应答,现已成为目前免疫佐剂研究的热点之一.本文对CpG DNA的免疫学作用及应用研究作一综述.
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免疫刺激剂CpG ODN防治烟曲霉菌引起的变态反应性结膜炎的实验研究
背景研究证实免疫调节剂CpG ODN对蛋白类过敏原引起的变态反应性结膜炎有防治作用,但其对真菌引发的变态反应性结膜炎是否有类似作用尚不清楚.目的研究局部应用CpG ODN是否能够预防或减轻烟曲霉菌引发的变态反应性结膜炎.方法建立烟曲霉菌变态反应性结膜炎小鼠模型,用CpGODN或对照ODN(GpC ODN)对其进行干预,PBS干预作为阴性对照.实验分为预防实验(模型动物在变态反应原再次激发前给药)和治疗实验(激发后给药),对小鼠眼部临床症状进行评分.取小鼠结膜组织进行组织病理学检查,并计数标本中的炎性细胞.应用实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)法动态观察小鼠结膜组织中TLR4 mRNA的变化;将烟曲霉菌免疫原与眼部回流淋巴结和脾脏的细胞进行共培养,流式细胞分析培养细胞中调节性T淋巴细胞的比例和活化状态.结果预防实验中,结膜下注射CpG ODN组与GpC ODN对照组、PBS对照组比较,小鼠眼部过敏症状评分差异均无统计学意义(P＞0.05);CpG ODN组与GpCODN对照组、PBS对照组比较结膜组织中性粒细胞数降低,差异均有统计学意义(21.25±11.59 vs 30.75 ±11.44,21.25±11.59 vs 69.00±9.90;t=5.140,t=3.210,P＜0.01);TLR4 mRNA表达上调.在治疗实验中,CpG ODN组与GpC ODN对照组、模型对照组比较,眼部过敏症状评分降低(t=4.000,t=2.750,P＜0.05);中性粒细胞数显著减少(t=4.870,t=3.829,P＜0.01).CpG ODN治疗组小鼠眼部回流淋巴结CD4+ CD25+细胞以及CD4+ CD25+ CD69+ 细胞所占的比例均显著高于GpC ODN组和PBS对照组(P＜0.05).结论 CpG ODN通过上调结膜TLR4的表达、活化Treg细胞来预防和治疗烟曲霉菌引起的变态反应性结膜炎,预先结膜下注射和点眼均可减轻小鼠眼部过敏症状和晚期结膜炎性细胞的聚集.
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NF-κB诱捕ODN促进宫颈癌HeLa细胞凋亡的实验研究
目的 探讨NF-κB在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变组织以及宫颈癌组织中的表达情况以及NF-κB诱捕ODN对宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡的影响.方法 选取2013年2月至2014年2月南京医科大学第二附属医院妇产科收治的42例宫颈癌患者,以及同期诊治的宫颈上皮内瘤样病变患者22例、正常宫颈组织12例,进行免疫组织化学检测NF-κB信号激活情况;在体外培养的宫颈癌HeLa细胞株中,分别转染NF-κB特异诱捕ODN和错义ODN,使用MTT和流式细胞技术检测细胞增殖、凋亡情况.结果 宫颈癌组织中NF-κB的表达明显增加;使用NF-κB诱捕ODN阻断NF-κB信号激活能够显著抑制宫颈癌HeLa细胞增殖,并增强顺铂诱导的细胞凋亡.结论 NF-κB诱捕ODN可以通过阻断NF-κB信号活化,从而抑制细胞增殖并增强顺铂诱导的细胞凋亡,为宫颈癌治疗提供了新的作用靶点和治疗方向.
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不同CpG ODN对大鼠骨髓间充质干细胞增殖作用的研究
目的:筛选对大鼠骨髓间充质干细胞增殖具有影响作用的CpG ODN.方法:体外全骨髓贴壁法提取并纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代孵育12 h至完全贴壁,双盲法加入不同CpG ODN共孵育48 h,MTT比色法检测,不同大鼠重复实验3次,筛选促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖的CpG ODN.结果:与PBS溶媒对照组相比,有4条CpG ODN对不同大鼠BMSCs均具有显著促增殖作用,MTT结果具有统计学意义(P＜0.05).结论:4条CpG ODN具有显著促进大鼠BMSCs增殖的作用,将在下一步的实验中探讨它们对BMSCs分化功能的作用.
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含CpG寡核苷酸在人神经母细胞瘤裸鼠移植瘤模型中的抗肿瘤效应
背景与目的:含有非甲基化CpG二核苷酸的寡脱氧核苷酸(CpG oligonuchofides.CpC ODN)序列可以模拟细菌DNA特征,作为"异己信号"刺激机体免疫系统,发挥抗肿瘤作用.本研究探讨在人神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)裸鼠移植瘤模型中.CpG ODN是否可以通过调节非特异性免疫来介导抗肿瘤效应.方法:体外WST-1实验明确CpG ODN对神经母细胞瘤细胞株SK-N-MC的生长影响,建立NB荷瘤动物模型,当肿瘤生长到皮下可触及时,随机分组后给予不同注射处理(生理盐水、non-CPG ODN、CpC ODN)、观察各组小鼠肿瘤生长情况,病理组织学方法检测各组肿瘤组织的异同,免疫荧光组化法检测自然杀伤细胞(natural kill cell,NK)和巨噬细胞的浸润.结果:体外实验证明CpC ODN对SK-N-MC细胞无明显的直接细胞毒性及生长抑制作用.CpG ODN处理组与non-CpG ODN、生理盐水组相比,肿瘤细胞生长明显受到抑制[(0.14±0.03)cm3 vs.(2.97±0.40)cm3、(3.80±1.12)cm3(p<0.01)].HE染色显示与肿瘤细胞生长活跃的对照组相比.CaG ODN处理组肿瘤组织中有较多的炎性细胞浸润及大片坏死灶.免疫荧光染色发现CpG ODN处理组与生理盐水组、non-CpG ODN组相比较瘤体内有明显的NK、巨噬细胞浸润.结论:具有免疫刺激作用的CpG ODN可能通过调节NK、巨噬细胞的活性来抑制NB生长,发挥抗肿瘤作用.
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CpG ODN通过活化p38 MAPK上调A549细胞β防御素-2的表达
目的 研究含CpG基序的寡核苷酸(unmethylated CpG motif containing oligodeoxynucleotide,CpG ODN)对人肺腺上皮细胞A549 β防御素-2(human β-defensin 2,hBD-2)的表达及p38 MAPK磷酸化水平的影响.方法 培养A549细胞,加或不加p38特异性抑制剂SB203580情况下用不同浓度CpG ODN进行干预.用RT-PCR法检测刺激后A549细胞hBD-2 mRNA表达变化,用Western Blot法检测细胞内p38 MAPK蛋白磷酸化水平的变化.结果 CpG ODN刺激可以促进A549细胞内磷酸化p38 MAPK含量的增加,活化p38 MAPK途径,从而诱导hBD-2的表达,与对照组比较,P<0.05;用特异性阻断剂SB203580阻断p38 MAPK磷酸化可抑制CpG ODN的诱导作用.结论 CpG ODN通过p38 MAPK途径诱导hBD-2在呼吸道上皮细胞的表达,增强呼吸道对外界微生物的抵抗作用.
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CpG ODN在治疗呼吸道变应性疾病中的研究进展
CpG ODN(CpG寡聚脱氧核苷酸)是近年来的研究热点,它通过激活多种免疫效应细胞发挥免疫刺激作用.动物模型和临床试验显示其在治疗呼吸道变应性疾病中有着良好的应用前景.
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CpG ODN免疫活化机制及其在肿瘤治疗中的应用
含有未甲基化鸟嘌呤胞嘧啶二核苷酸序列的寡核苷酸(CpG ODN)可以活化T,B淋巴细胞、抗原提呈细胞(APC),可以诱导免疫细胞产生IFN-γ等Th1型为主的炎性细胞因子,其具有活化机体固有和适应性免疫应答的能力.通过动物模型证实CpG ODN可以以疫苗佐剂、单一治疗、联合其他治疗方式的形式应用于肿瘤治疗中.CpG ODN用于人体也已经进入临床实验阶段,为肿瘤患者带来了新的治疗途径.
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基于PON的ODN组网模式的探讨
ODN是基于PON技术的光纤接入网中从OLT到ONU之间的部分,属于接入光缆网的一部分,为OLT和ONU之间的光信号提供物理传输通道.在不同环境下选择不同的ODN组网模式,对技术的实施、后期的维护管理和投资成本的降低都具有重要意义.文章针对已有的ODN规划原则,提出自己的看法,给出高层住宅、别墅和聚类市场三种典型环境下ODN的组网模式.
