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疮灵液对模型大鼠血管新生与创面炎症反应的影响
目的：探讨疮灵液对血管新生与创面愈合的影响。方法通过鸡胚尿囊膜模型（CAM）筛选不同剂量的疮灵液对血管新生的疗效；通过血管内皮细胞增殖实验（MTT）、迁移划痕实验探查筛选适合剂量的疮灵液对血管新生的细胞学疗效；采用大鼠背部机械性全层皮肤创面，将生理盐水纱布（对照组）、疮灵液纱布（疮灵液组）覆盖创面，隔日更换；造模时及造模后第3、7、14、28天测定创面面积，造模后第3、7天测炎症反应积分，造模时及造模后第3、7天取创面组织用于检测肿瘤坏死因子（TNF-α）与白细胞介素-6（IL-6）含量。结果 CAM实验显示，疮灵液0.2 ml、0.3 ml组血管新生[分别为（62.6±4.88）个、（62.0±5.70）个]少于对照组（104.0±27.01）个，P＜0.05。选择疮灵液0.2 ml组进行细胞实验，其抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖（0.66±0.03）%。疮灵液组创面炎症积分治疗后3 d、7 d [分别为（2.91±0.66）分、（1.25±0.45）分]分别低于对照组治疗后3 d、7 d[（4.51±1.01）、（2.25±0.62）分]（P＜0.05或0.01）。创面肉芽TNF-α含量治疗后3 d、7 d[分别为（768±107）ng/L、（380±47）ng/L]，低于对照组治疗后3 d、7 d[分别为（958±140）ng/L、（512±62）ng/L]；IL-6含量治疗后3 d、7 d[分别为（664±133）ng/L、（363±43）ng/L]，低于对照组治疗后3 d、7 d[分别为（2215±314）ng/L、（1562±174）ng/L]（P＜0.05或0.01）。结论疮灵液具有抗血管内皮细胞的迁移与增殖，抑制血管新生作用；且可改善创面的炎症反应，不影响机械性创面的愈合。
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几种收涩中药对鸡胚尿囊膜血管生成影响的实验研究
目的 研究收涩中药乌梅、椿皮、金樱子、五味子、五倍子、赤石脂、禹余粮对鸡胚尿囊膜生成的影响.方法 采用血清药理学方法,制备收涩药物的大鼠血清；建立鸡胚绒毛尿囊膜模型,并应用鸡胚绒毛尿囊膜模型进行活性筛选.于鸡胚发育的第5天,将加药物血清后的明胶海绵载体加于鸡胚绒毛尿囊膜上,孵育48 h后,固定鸡胚绒毛尿囊膜,取出,采用医用图像采集系统分析结果.结果 收涩药物金樱子、五味子、五倍子、乌梅、赤石脂、椿皮对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管数目有一定抑制作用(P＜0.05)；乌梅组、椿皮组对抑制新血管生成有一定的趋势,与空白对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 收涩中药对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管有一定的抑制作用.
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温阳益心活血化痰法对鸡胚尿囊膜血管生成的影响
治疗性血管新生为冠心病提供了一种新的治疗选择.这种被形象地称之为"药物促进心脏自身搭桥"的方法已经引起医学界的广泛关注.目前西医用基因重组的bFGF、VEGF蛋白或其基因导入在实验研究中己被证实,对缺血心肌具有确切的促侧支循环形成和血管新生作用,这种新的治疗方法在临床上也己进入试用阶段,但其价格昂贵,且可能有引起致命性低血压、促进肿瘤生长和动脉粥样硬化形成等副作用,目前尚不能在临床广泛地推广应用.已有大量的临床和实验研究证实,中医药防治冠心病疗效肯定,可以很好地改善症状和心肌缺血,提高患者生存质量,而促血管新生可能是中药治疗冠心病的另一机制.既往实验和临床研究证实,温阳益心活血化痰法具有很好的抗心肌缺血和动脉粥样硬化的作用[1～3],我们采用鸡胚绒毛尿囊膜模型(CAM),观察了此法指导下创立的温心胶囊对CAM血管生成的影响,以期从另一个层面阐明温阳益心活血化痰法治疗冠心病的作用机理.
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藤梨根含药血清对鸡胚尿囊膜微血管生长的影响
目的:探讨中药藤梨根对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的影响,以衡量其抑制或谤生新血管发生的能力.方法:采用CAM技术和计算机图像分析技术,观察藤梨根含药血清对鸡胚绒毛尿囊膜血管数量和血管面积的影响.结果:藤梨根高剂量组与空白组、血清组比较,有较明显的抑制新血管生成能力,低剂量组无显著影响.结论:藤梨根对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管有一定的抑制作用.
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内异方对子宫内膜异位症黏附侵袭的作用及机制
目的 比较子宫内膜异位症(简称内异症)在位、异位子宫内膜组织与对照子宫内膜组织间的黏附侵袭能力,评价中药内异方的干预作用.方法 采用Boyden侵袭小室实验、鸡胚尿囊膜(chick chorioal-lantoic membrane,CAM)异位种植及免疫组织化学EnVision方法,比较对照组子宫内膜基质细胞与内异症在位、异位子宫内膜基质细胞的侵袭能力,观察各组种植组织中黏附侵袭相关细胞因子的表达及中药内异方对其影响.结果 内异症在位和异位内膜组基质细胞的穿膜数明显高于对照子宫内膜组(P<0.05);内异方、丹那唑血清处理后,内异方组的穿膜细胞数较丹那唑组显著减少(P<0.05).与对照内膜组比较,内异症异位内膜组织种植灶中细胞间黏附因子-1(ICAM-1)及内异症在位、异位内膜组种植灶中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达显著升高(P<0.05),TIMP-1的表达明显降低(P<0.01);内异症在位内膜中,内异方、丹那唑血清均能显著降低MMP-9表达,并上调TIMP-1、ICAM-1的表达(P<0.01);内异症异位内膜中,内异方可显著降低MMP-9(P <0.01)、ICAM-1(P<0.05)的表达,丹那唑可显著降低ICAM-1表达(p<0.05).与丹那唑比较,内异方下调MMP-9表达作用更明显(P<0.05).结论 内异症在位和异位子宫内膜存在MMP-9高表达,TIMP-1低表达,促使子宫内膜细胞易在异位侵袭种植.中药内异方可抑制异位子宫内膜基质细胞的侵袭能力及MMP-9的表达.
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重组人血管内皮生长因子D诱导鸡胚尿囊膜血管增生
为了表达和纯化具有生物学活性的人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)-D,探讨VEGF-D对血管增生作用,从人胎肺组织中提取总RNA,设计特异性引物并应用RT-PCR法扩增VEGF-D成熟肽片段;经测序证明目的片段序列正确后,构建重组表达质粒pGEX-5X-1/VEGF-D并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行GST-VEGF-D融合蛋白的表达.结果表明,融合蛋白的分子量约为38 kD,表达量占菌体总蛋白的15%以上,抗GST和抗VEGF-D的抗体均能识别融合蛋白;纯化的GST-VEGF-D融合蛋白与VEGFR-3/Fc具有结合活性,并能刺激红白血病细胞系HEL细胞生长;在鸡胚尿囊膜实验中GST-VEGF-D具有促进鸡胚尿囊膜血管生成的作用.结论:成功表达了具有生物学活性的重组人VEGF-D融合蛋白,为进一步研究VEGF-D的作用机理提供了实验模型.
关键词： 血管内皮生长因子D 血管内皮生长因子受体3 鸡胚尿囊膜 血管生成 -
超声辐照携重组人血管内皮抑制素脂质微泡抑制鸡胚尿囊膜血管生成研究
目的 探讨超声波辐照击破携重组人血管内皮抑制素脂质微泡对鸡胚尿囊膜血管生成的影响.方法 采用生物素-亲和素系统制备携重组人血管内皮抑制素脂质微泡,测定微泡粒径、载药量；采用鸡胚尿囊膜模型观察超声辐照载药微泡对血管生成的抑制作用.结果 制备的载药微泡平均粒径(3.0±0.4) μm,荧光显微镜可见FITC标记的微泡表面发出绿色荧光,ELISA测得每108微泡载药量为0.8 mg；超声辐照载药微泡治疗组鸡胚尿囊膜新生血管面积、血管面积/总面积比值均小于其余各组(P＜0.05).结论 超声波辐照击破携重组人血管内皮抑制素脂质微泡具有明显抑制鸡胚尿囊膜血管生成作用.
关键词： 造影剂 超声生物效应 重组人血管内皮抑制素 血管生成 鸡胚尿囊膜 -
内皮抑素对荷卵巢上皮性癌细胞系ES-2细胞裸鼠的抗血管生成作用
肿瘤的生长和转移与肿瘤区血管生长有密切关系,分期越晚,分化越差,肿瘤内血管密度(MVD)越高.抑制和破坏肿瘤区新生血管的生长,阻断其血液供应导致肿瘤细胞坏死,并阻断其转移,成为治疗实体肿瘤的一种新途径[1].1997年,O′Reilly等[2]体外实验发现,内皮抑素对牛毛细血管内皮细胞有特异的抑制增殖作用,而对非血管内皮细胞、平滑肌细胞等无抑制作用;体内实验证明,内皮抑素可抑制鸡胚尿囊膜的毛细血管生长.近年来,已有数种作用机理不同的这类药物正在进行临床试验.目前,内皮抑素已应用于多种肿瘤的体内实验[3-5].本研究采用裸鼠移植瘤模型,观察内皮抑素对人卵巢上皮性癌(卵巢癌)移植瘤内肿瘤新生血管生成的抑制作用,现报道如下.
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沙蟾毒精抑制血管生成的作用
探讨沙蟾毒精(arenobufagin)对体内外血管生成的抑制作用.采用MTT法检测沙蟾毒精对人鼻咽癌细胞(CNE-2)、人喉癌细胞(Hep2)、人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)、人结肠癌细胞(LOVO)、人前列腺癌细胞(PC-3及DU145)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的细胞毒性及运用光学显微镜观察细胞形态的变化,发现沙蟾毒精剂量依赖性抑制CNE-2、Hep2、SH-SY5Y、LOVO、PC-3、DU145和HUVECs增殖,且在对人癌细胞亚细胞毒浓度下能够有效抑制HUVECs的增殖.采用鸡胚尿囊膜(chick embryo chorioallantoic membrane,CAM)模型观察新生血管的生成,结果发现沙蟾毒精作用24 h后,尿囊膜新生血管生成明显减少.采用细胞周期分析法观察到沙蟾毒精阻滞HUVECs于G<,2>/M期,且随着浓度增加,细胞出现sub-G<,1>凋亡峰.运用流式细胞术检测沙蟾毒精作用HUVECs后的凋亡现象以及线粒体膜电位的变化,确证沙蟾毒精呈时间和剂量依赖性诱导HUVECs凋亡,同时检测到线粒体膜电位下降.Western blotting检测发现,沙蟾毒精作用HUVECs后,凋亡标志分子PARP被切割.上述研究表明,沙蟾毒精具有明显的体内外抑制血管生成作用,其抑制作用可能与诱导血管内皮细胞周期阻滞及凋亡有关.
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λ-卡拉胶寡糖体外对血管生成的抑制作用
为探讨λ-卡拉胶寡糖体外对血管生成的抑制作用,采用鸡胚尿囊膜模型(CAM)观察λ-卡拉胶寡糖对CAM血管发育的抑制,发现该寡糖可明显抑制CAM微血管生成,在200 μg·egg-1时,抑制率达54.90%.随后采用MTT法测定λ-卡拉胶寡糖对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响,发现该寡糖的细胞毒作用在不同的细胞间具有选择性,对HUVEC的抑制强,高浓度时(1 mg·mL-1)能明显抑制其增殖,但低浓度(＜250 μg·mL-1)对细胞几乎无毒.对寡糖的细胞迁移和侵袭抑制作用进行检测,并测定其对HUVEC表达基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的影响.结果表明,λ-卡拉胶寡糖能有效减缓HUVEC的迁移、侵袭能力,并具有抑制HUVEC中MMP-2表达的作用.该研究说明λ-卡拉胶寡糖通过抑制内皮细胞的增殖、细胞侵袭和迁移达到血管生成抑制的作用.
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肝素硅阿霉素抗癌药物系统对鸡胚尿囊膜血管生成的影响
目的：研究肝素硅阿霉素抗癌药物系统（ DHN）对碱性成纤维生长因子（ b－FGF）诱导血管生成的抑制作用。方法 b－FGF诱导实验分为9组：空白组，模型组（ b－FGF），对照A组（介孔硅）、B组（肝素硅）、C组（肝素）、D组（阿霉素1μg），3个剂量实验组（DHN，10，5，1μg）；各组b－FGF的用量均为每胚0.1μg，空白组和对照A、B、C组的给药量为10μg。新生血管实验不加b－FGF以外，其余分组与给药情况与b－FGF实验一致。新鲜受精鸡胚发育至11 d，开窗加药，3 d后取加药部位及其周围的尿囊膜， BI－2000图像分析系统下计数CAM的血管分叉数及血管内径，计算血管生成抑制率。结果 DHN各组的血管分支数及血管直径较模型组显著减小，3个剂量实验组对b－FGF诱导的CAM血管生成的抑制率分别为69.1％，61.1％，56.2％。 DHN对正常新生血管的抑制率分别为41.6％，20.5％，10.6％。结论 DHN对b－FGF诱导的血管生成和正常新生血管生成均有一定的抑制作用。
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人参皂苷结构修饰物HRG的体内抗肿瘤活性研究
目的 探讨新化合物3β,12β,20(S)-三羟基达玛-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-β-D-吡喃葡萄糖苷[3β,12β,20 (S)-trihydroxy dammarane-3-O-β-D-glucopyranosyl(1-2)-β-D-glucopyranoside] (HRG)即人参皂苷结构修饰物的体内抗肿瘤活性.方法 建立肝癌H22鸡胚尿囊膜(CAM)移植瘤模型,观察药物对移植瘤生长、诱导血管生成数、生长抑制率等的影响；将移植瘤切片及HE染色进行光镜组织形态的观察和测定；运用免疫组织化学染色(S-P法)检测移植瘤微血管密度及血管内皮生长因子的表达情况.结果 新化合物HRG 25、50、100 μg·mL-13个剂量组对肝癌H22-CAM移植瘤生长均有抑制作用,其抑瘤率分别为27.73％、50.02％、64.21％；HRG可显著减少移植瘤诱导血管生成数,且光镜下观察发现各用药组移植瘤组织均存在不同程度坏死,坏死程度与移植瘤诱导血管生成数成反比例关系；HRG可降低移植瘤的微血管密度,并下调血管内皮生长因子的表达.结论 HRG具有体内抗肿瘤活性,能够显著抑制肝癌H22-CAM移植瘤的生长和其诱导的血管生成,其机制可能与降低移植瘤微血管密度和下调血管内皮生长因子表达有关.
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硫酸长春碱温敏性凝胶的释药特性和抗血管生成活性研究
目的 考察硫酸长春碱(VBL)温敏性凝胶的释药特征,并评价其抗血管生成活性.方法 以单甲基聚乙二醇-羟基乙酸共聚物(MPEG-PLGA)为材料制备VBL凝胶,运用高效液相色谱法测定VBL凝胶的载药量和释放度,采用鸡胚尿囊膜(CAM)实验考察不同剂量的VBL凝胶对CAM血管的抑制作用.结果 随着MPEG-PLGA溶液浓度的增加,溶液发生相转变的温度降低,20%MPEG-PLGA溶液在37℃左右胶凝.VBL凝胶在2 h表现出10%～30%的突释,随着MPEG-PLGA的浓度的增加,突释量减小.2 h以后凝胶的释药速度减慢,第3天以后释药速度又呈现出加快的趋势,10%和20%的水凝胶在10d的累积释放度为80%左右.VBL凝胶高剂量组(5.6x10~(-3) pg·个~(-1)鸡胚)和低剂量组(2.8×100Pg·个~(-1)鸡胚)均能明显抑制CAM小血管的生成成(P＜0.01),其中高剂量组还能够明显抑制大血管的生成(P＜0.05).低剂量的VBL凝胶剂对CAM小血管的抑制作用明显优于相同剂量的水溶液(P＜0.01),高剂量的VBL凝胶剂对CAM大、小血管的抑制作用与相同剂量的水溶液相当(P＞0.05).结论 VBL瀑敏性凝胶具有明显的缓释特征,通过低剂量持续作用的方式可以明显地抑制CAM血管生成.
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羟基红花黄色素A抑制新生血管形成的机制研究
目的从中药中寻找新的血管生成抑制剂,并探讨其抑制新生血管生成的作用机理.方法从红花中提取分离羟基红花黄色素A,利用鸡胚尿囊膜(CAM)实验观察羟基红花黄色素A对新生血管的抑制作用,并通过RT-PCR实验,观察羟基红花黄色素A对CAM组织中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体(VEGF-R)(flt-1) mRNA表达的影响.结果提取出的羟基红花黄色素A纯度达到了98.9%,浓度为0.59 g/L的羟基红花黄色素A能使CAM血管数明显变细减少(P<0.01)并能显著抑制CAM组织中bFGF、VEGF及VEGF-R(flt-1) 的mRNA表达(P<0.05).结论通过本实验我们首次得出羟基红花黄色素A能显著抑制CAM新生血管生成,其作用机制之一是通过抑制bFGF、VEGF及VEGF-R(flt-1)的mRNA表达来实现的,提示羟基红花黄色素A可能是一很有潜力的血管生成抑制剂.
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人癌鸡胚移植瘤及血管生成模型建立的影响因素
通过肿瘤诱导的新生血管寻找肿瘤诊断和治疗的新方法,是近年来肿瘤研究的热点之一.而研究肿瘤的血管生成、寻找抗肿瘤血管生成的新药则依赖于各种不同血管生成模型的建立.常用的血管生成模型有体内和体外两大类.体外的血管生成模型有内皮细胞的增殖、迁移、小管形成和组织(主动脉环)模型;体内血管生成模型有角膜模型、皮下气囊模型、鸡胚尿囊膜模型、藻酸盐陷夹模型、小鼠皮下凝胶模型等.由于目前对体内新生血管形成的定量评价尚无精确有效的方法,而鸡胚尿囊膜技术因取材方便、无需特殊设备、经济、实验周期短、又能定性或半定量地检测肿瘤组织、细胞分泌成分及各种生物因子对血管的活性作用、在透明膜上观察到的结果较可靠等优点,是研究肿瘤生物学特性,特别是肿瘤诱导血管生成的良好模型,因此是一项值得推荐的技术.目前鸡胚尿囊膜实验模型的应用已较成熟,并且广泛用作研究血管生成和抗血管生成的模型[1].
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人大肠癌鸡胚尿囊膜移植模型的建立及血管生成特征的观察
目的 研究人大肠癌腺癌细胞株HT-29鸡胚尿囊膜移植模型建立的方法,观察和分析其血管生成的特征.方法 将不同浓度的人大肠癌腺癌细胞株HT-29接种于鸡胚尿囊膜(chick embryo chorioallantoic membrane,CAM),观察影响大肠癌鸡胚移植模型瘤体成活的因素、瘤体生长特征和血管生成情况.结果 建立了人大肠癌CAM移植模型.移植模型瘤体易于生长,具有较强的血管生成作用.结论 该模型易于复制,能动态观察大肠癌的血管生成过程,可用于大肠癌的生物学行为、药物筛选等领域的研究.
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改良鸡胚尿囊膜肿瘤实验动物模型及其生物学行为观察
目的 利用鸡胚尿囊膜建立人移植瘤模型并观察其生物学行为和组织学形态已有报道.但是,在实际工作的过程中仍存在不少的问题.因此,通过改良的方法,获得简单,快捷,可重复的动物模型.方法 将人胶质瘤SW0-38细胞滴加到鸡胚尿囊膜上,观察影响鸡胚的存活和成瘤的可能因素、移植瘤的生长特性和形态学特征.结果 利用改良的方法成功建立胶质瘤鸡胚尿囊膜的模型；肿瘤组织能够诱导血管生成,镜下形态符合恶性胶质瘤的形态学特征.结论 该模型简单,快捷,易于建立.便于观察肿瘤组织的生物学行为,可用于抗肿瘤的药物筛选.
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Image-Pro Plus图像分析软件定量鸡胚尿囊膜血管新生面积的方法
目的 应用Image-Pro Plus 5.0图像处理和分析软件,研究鸡胚尿囊膜 (chick chorioallantoic membrane,CAM) 血管新生面积定量的新方法.方法 20只发育良好的7日龄鸡胚,分为龙葵给药组和对照组,每组10只.将中药龙葵水提液及等量蒸馏水吸附于5 mm直径的定性滤纸,置于CAM上.利用Image-Pro Plus 5.0软件,定量血管新生面积、蛋壳开窗处对应的CAM面积,计算出血管新生面积与CAM面积的比值.结果 用Image-Pro Plus 5.0可方便、自动、准确地进行给药前后的数据收集和面积计算.统计分析表明,受试物龙葵可明显抑制CAM血管新生,与对照组比较有极显著差异(P<0.001).结论 Image-Pro Plus 5.0图像处理和分析软件是一种高效、准确的统计血管新生面积的工具,用该软件定量蛋壳开窗部位下的血管新生面积占开窗部位所对应的CAM总面积,不仅操作简便,而且数据计算自动生成,可较准确地反映鸡胚血管新生情况.
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Jagged1在生理性和病理性新生血管形成中的表达变化
目的 观察Jagged 1 在生理性和病理性新生血管形成中的表达变化,为肿瘤的治疗寻找新的靶点.方法 体外培养血管内皮细胞免疫细胞化学法检测其Jagged 1 的表达.建立鸡胚尿囊膜动态血管发育模型,免疫荧光化学和Westernblot 检测不同发育时期尿囊膜血管中Jagged 1 的表达.免疫组织化学和Western blot 检测正常结直肠组织和大、中、小三种尺寸的结直肠癌肿块中Jagged 1 的表达.结果 ( 1)免疫细胞化学结果显示,Jagged 1 是细胞跨膜蛋白,表达于细胞膜上.(2)成功建立鸡胚尿囊膜动态血管发育模型,其免疫荧光和Western blot 结果显示,Jagged 1 随着血管的发育而表达,随血管密度、血流量增加而表达上调.(3)免疫组化结果显示Jagged 1 在结直肠癌中广泛表达,而在正常皮肤及结直肠组织中表达较少,Jagged 1 的表达量同肿瘤的体积有关.结论 Jagged 1 在内皮细胞、血管发育初期和肿瘤新生血管中表达上调,表明其可能是新生血管形成的早期事件,参与诱导下游新生血管形成基因的表达.
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琼胶寡糖抑制血管形成作用的研究
目的:探讨琼胶寡糖(AOS)对血管形成的抑制及其作用机制.方法:采用鸡胚尿囊膜模型(CAM)并结合组织化学方法观察AOS抑制血管发育的情况;以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为研究对象,采用MTT法测定AOS的细胞毒情况,并利用Hoechst染色及流式细胞术检测寡糖的促凋亡现象.结果:AOS可明显抑制鸡胚尿囊膜的微血管形成,呈量效关系,在200 μg/egg时,抑制率达50.98 %;AOS对各类细胞的细胞毒作用有差异,以HUVEC的敏感性较强,在125 μg/ml时增殖抑制率达39.66 %.AOS有明显的促进HUVEC细胞凋亡的作用,流式细胞仪检测发现AOS能将细胞周期阻滞在S期.结论:琼胶寡糖具有明显的抑制血管形成作用,且该作用主要是通过促进脐静脉内皮细胞凋亡并阻滞细胞周期于S期产生的.
