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斑马鱼帕金森疾病模型的建立
目的:利用斑马鱼建立一种新的帕金森疾病动物模型.方法:利用显微注射将6-羟基多巴(6-OHDA)注射到斑马鱼玻璃体腔特异杀死视网膜中多巴胺能神经细胞,采用免疫印迹、免疫组化等技术在蛋白水平上进行鉴定.结果:与注射PBS的对照组相比,注射6-OHDA的实验组在行为学和生理学上都有明显的变化,实验组的斑马鱼游动缓慢甚至静止,其视网膜内多巴胺能细胞数明显减少,TH后明显降低,这些变化符合帕金森氏病的特征.结论:采用6-OHDA注射至斑马鱼玻璃体腔能够快速有效的建立斑马鱼帕金森氏病的动物模型.
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6-羟基多巴胺通过CaMKⅡ调节Cav1.3对大鼠黑质多巴胺能神经元的损伤研究
目的 探讨Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ (CaMKⅡ)和Cav1.3在6-羟基多巴胺处理大鼠原代黑质多巴胺能神经元损伤中的作用.方法 取出生24 h内大鼠黑质多巴胺能神经元进行原代培养,12 d后分别进行加药处理.使用免疫印迹法、免疫共沉淀法检测6-羟基多巴胺对神经元CaMKⅡ活性和Cav1.3表达情况、Cav 1.3-CaMKⅡ复合体形成情况.采用MTT法、siRNA敲减技术检测6-羟基多巴胺对大鼠原代多巴胺神经元细胞死亡情况的影响.结果 6-羟基多巴胺处理组Cav1.3表达水平和p-CaMKⅡ水平明显高于对照组,两组比较差异具有统计学意义(P＜0.05).6-羟基多巴胺处理组Cav1.3-CaMKⅡ复合体水平明显高于对照组,两组比较差异具有统计学意义(P＜0.05).6-羟基多巴胺处理组p-CaMKⅡ和Cav1.3水平显著高于对照组(P＜0.05),而KN能明显抑制6-羟基多巴胺引起的p-CaMKⅡ和Cav1.3增加,两组比较差异具有统计学意义(P＜0.05).SiCav1.3能抑制50％以上Cav 1.3表达,抑制Cav1.3和CaMKⅡ,改善6-羟基多巴胺引起的细胞损伤,两组比较差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 6-羟基多巴胺处理大鼠原代多巴胺神经元引起的细胞损伤与Cav1.3和CaMKⅡ表达和活性增加相关,CaMKⅡ通过与Cav1.3形成复合体来直接调节Cav1.3的功能,抑制Cav1.3和CaMKⅡ可改善6-羟基多巴胺导致的细胞损伤.
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大鼠单侧纹状体内四点注射6-羟基多巴胺建立帕金森模型
[目的]探讨单侧纹状体内四点注射6-羟基多巴胺(6-Hydroxydopamine,6-OHDA)建立大鼠帕金森(Parkinson'sdisease,PD)模型的可行性与成功率.[方法]48只SD大鼠随机分为对照组(n=12)和PD模型组(n=36).PD模型组通过立体定位技术于纹状体内四点注射6-OHDA诱导PD疾病,于2周后先后进行阿扑吗啡诱导旋转行为学测试和11C-CFT MicroPET/CT显像以及免疫荧光染色法计数大鼠黑质致密部酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性的多巴胺能神经元总数的变化,以评定PD模型的成功率.[结果]11C-CFT MicroPET/CT显像结果显示,与对照组相比,PD模型组的11C-CFT损伤侧/健侧的放射性摄取比值(0.581土0.061,P＜0.05)以及损伤侧/健侧的TH阳性多巴胺能神经元数量比值(0.514±0.085,P＜0.05)均显著下降.阿扑吗啡诱导行为学旋转评定大鼠PD模型成功率为86.1％.[结论]纹状体内四点注射6-OHDA建立PD模型的方法可有效模拟人类PD多巴胺能神经元的退变减少,且成功率高(86.1％).
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IGF-1对6-OHDA诱导神经元氧化损伤的保护作用
目的 探讨胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的PC12细胞氧化损伤的保护作用.方法 以25、50、100、150、200 μmol/L的6-OHDA处理PC12细胞,在12、24、48 h用MTT法检测6-OHDA对PC12细胞活性的影响,筛选佳的实验浓度和观察时间.实验分为3组:对照组、6-OHDA组(150 μmol/L处理24 h)和IGF-1+6-OHDA组(IGF-1 100 nmol/L预处理2h,后加入150 μmol/L 6-OHDA处理24 h),MTT法检测各组细胞活性;免疫荧光染色法检测细胞活性氧(ROS)水平;Hoechst33342/PI双染法检测细胞凋亡.结果 随6-OHDA浓度的增加和作用时间的延长,PC12细胞的活性呈梯度降低,150 μmol/L 6-OHDA浓度和处理后24 h作为本研究的佳的实验浓度和观察时间.与6-OHDA组比较,IGF-1+6-OHDA组PC12细胞活力增强、ROS水平下降、细胞凋亡减少.结论 IGF-1预处理能减少6-OHDA引起的PC12细胞氧化损伤及凋亡,增加细胞活性,为防治帕金森病提供了潜在的治疗策略.
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重组人促红细胞生成素预处理对黑质多巴胺能神经元凋亡的影响
目的 研究重组人促红细胞生成素(rhEPO)对离体帕金森病模型中黑质多巴胺神经元凋亡的影响.方法 以6-羟基多巴胺(6-OHDA)为毁损剂建立大鼠离体帕金森病(PD)模型.用6u / ml rhEPO预处理黑质多巴胺神经元,然后用免疫组化方法 观察黑质中酪氨酸羟化酶(TH)免疫反应阳性细胞数和半胱天冬酶-3(Caspase-3)免疫反应阳性细胞数的变化,TUNEL法观察黑质中多巴胺神经元的凋亡情况.结果 与6-OHDA组(44.2±5.0)相比,rhEPO预处理组TH免疫反应阳性细胞(63.8±6.2,P<0.01)增多;与6-OHDA组(22.3±2.8)相比,rhEPO预处理组多巴胺神经元中Caspase-3表达减少,Caspase-3免疫反应阳性细胞染色较淡,数量减少(13.7±1.8,P<0.01);与6-OHDA组(20.3±3.1)相比,rhEPO预处理组TUNEL阳性细胞染色较淡,数量减少(10.7±1.5,P<0.01).结论 rhEPO预处理可以减轻6-OHDA对离体帕金森病模型中多巴胺神经元的损伤,其机制可能与rhEPO抑制黑质多巴胺神经元凋亡有关.
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咖啡因对6-羟基多巴胺诱导大鼠帕金森病模型作用的量效关系
目的:探讨咖啡因对大鼠6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的帕金森模型作用的量效关系及其佳用量.方法:应用6-OHDA制备成年大鼠右侧损毁的帕金森病模型,通过外周注射阿朴吗啡促使大鼠旋转次数作为对其病情进行定量检测的指标.用已知不同剂量的咖啡因每天对大鼠灌胃进行治疗,以大鼠旋转次数为主要指标,判断其对帕金森病治疗效果的变迁情况,以探讨咖啡因治疗帕金森病的佳剂量.结果:咖啡因(30,40,50mg/kg BW)有明显治疗效果,但咖啡因40,50mg/kg BW组对大鼠有可能产生生存质量影响.结论:30mg/kg BW是咖啡因治疗6-OHDA制备帕金森大鼠模型的有效剂量,咖啡因对帕金森病的疗效随剂量增长,到一定剂量时则不再增长.
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胞二磷胆碱对神经细胞凋亡保护作用
目的 探讨胞二磷胆碱对6-羟基多巴胺所致的神经细胞凋亡的保护作用机制.方法 采用流式细胞仪检测神经细胞的凋亡百分比及Bax、Bc1-2蛋白表达.结果 将1,0.1,0.01和0.001 mmol/L胞二磷胆碱+6-羟基多巴胺组,与6-羟基多巴胺组比较,凋亡百分比明显降低(P＜0.01);各组Bax蛋白的表达率明显下降,0.1 mmol/L胞二磷胆碱组明显低于对照组;1,0.1和0.01 mmol/L胞二磷胆碱组Bcl-2表达率显著升高;Bax/Bcl-2比值下降,0.1 mmol/L胞二磷胆碱组Bax/Bcl-2比值低于对照组(P＜0.01).结论 胞二磷胆碱通过减少Bax和增加Bcl-2蛋白的表达,使Bax/Bcl-2比值下降、细胞凋亡减少,发挥其神经保护作用.
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6-羟基多巴胺帕金森病模型大鼠氧化应激反应
目的:观察6-羟基多巴胺帕金森病大鼠模型的氧化应激反应及其可能的机制.方法:实验于2005-06/12在上海中医药大学科研实验中心完成.实验分组:Wistar雄性大鼠18只,随机分为正常对照组、假手术组、模型组,每组6只.实验干预:采用6-羟基多巴胺(溶于0.2 g/L抗坏血酸的生理盐水中)注射于脑右侧黑质,10 d后以腹腔注射阿朴吗啡0.5 mg/kg诱发大鼠向一侧旋转,记录开始旋转至30 min内的旋转圈数,以平均每分钟旋转圈数超过7次者为合格的帕金森病模型.假手术组6只大鼠只注射含0.2 g/L抗坏血酸的等量生理盐水,其余条件与造模组手术相同.正常对照组6只大鼠只进行大鼠固定,不进行任何处理.在旋转诱发实验完成后,动物每天自由饮水与进食,共45 d.实验评估:应用化学比色法测定大鼠中脑黑质纹状体部位活性氧、丙二醛、谷胱甘肽含量,谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性.结果:18只大鼠均进入结果分析.①活性氧含量:模型组明显高于正常对照组和假手术组[(451.13±73.42),(135.62±53.46),(161.15±61.16)U/mg,P＜0.01].②谷胱甘肽含量:模型组明显低于正常对照组和假手术组[(4.26±0.75),(7.03±1.39),(7.03±1.42)mg/g,P＜0.05].③谷胱甘肽过氧化物酶活性:模型组明显低于正常对照组和假手术组[(3.05±0.38),(3.96±0.39),(3.77±0.38)NU/g,P＜0.01].④超氧化物歧化酶活性:模型组明显低于正常对照组和假手术组[(137.74±4.65),(190.77+8.47),(199.73±8.23)NU/mg,P＜0.01].⑤丙二醛含量:模型组明显高于正常对照组和假手术组[(10.90±2.17),(4.18±2.88),(4.52±2.45)μmol/g,P＜0.01].结论:帕金森病模型大鼠的氧化反应被激活,处于氧化应激状态,氧化应激反应增强可能是帕金森病的发病机制之一.
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应用6-羟基多巴胺建立帕金森病大鼠模型的稳定性评价
背景:应用6-羟基多巴胺(6-Hydroxydopamine,6-OHDA)损毁黑质多巴胺神经元(nigral dopaminergic neuron,NDN)制作的大鼠模型,在目前帕金森病的研究中应用广,但由于黑质致密部体积狭小,技术难度大,故模型制备成功率一般仅为30％～40％左右.目的:探讨提高6-羟基多巴胺帕金森病大鼠模型成功率的方法,并对模型进行评价.设计:完全随机的实验研究.地点和材料:实验在安徽中医学院第一附属医院中心实验室完成,实验材料包括SD大鼠,6-OHDA,阿朴吗啡,兔抗TH血清,ABC试剂盒,SR-6N大鼠脑立体定向仪,JEM-100CX电镜.干预:取SD大鼠90只,将6-OHDA立体定向微量注射于左侧黑质区及黑质纹状体通路,观察大鼠行为及黑质细胞形态学变化.主要观察指标:旋转行为,免疫组织化学观察多巴胺能神经元数量,电镜观察多巴胺能神经元形态改变.结果:90只大鼠中经阿朴吗啡诱导后有64只(占71％)恒定转向右侧且结果稳定,旋转圈数30 min＞210 r,被视为成功大鼠模型;免疫组化观察发现注射侧黑质区多巴胺能神经元较对侧明显减少,电镜观察发现其普遍存在凋亡及坏死样改变.结论:应用本方法可较快建立稳定的成功率较高的大鼠模型,但在病理和行为学等方面同自然患者仍有较多差异.
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N-乙酰半胱氨酸拮抗6-羟基多巴胺对骨髓基质细胞的毒性作用
背景:内源性6-羟基多巴胺能参与氧化应激,N-乙酰半胱氨酸能有效抗氧化和清除自由基.目的:探讨6-羟基多巴胺对骨髓基质细胞的毒性作用及N-乙酰半胱氨酸对其的拮抗作用.方法:在体外培养SD大鼠骨髓基质细胞,取第3代骨髓基质细胞分别加入终浓度为0,0.05,0.1 g/L的6-羟基多巴胺和终浓度为0,0.075,0.3,1.2,4.8 g/L的N-乙酰半胱氨酸.结果与结论:MTT检测发现0.05和0.1 g/L 6-羟基多巴胺可以明显降低骨髓基质细胞的细胞活性,而加入6-羟基多巴胺的同时加入0.3 g/L N-乙酰半胱氨酸可以显著抑制6-羟基多巴胺的毒性作用.提示抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸可以影响6-羟基多巴胺的作用.
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6-羟基多巴胺单侧两点注射法构建的帕金森病模型鼠
背景：帕金森病动物模型的建立对帕金森病的临床、基础实验研究中有重要作用，同时其稳定性也直接影响到研究的结果。
目的：评价6-羟基多巴胺单侧两点注射法构建的帕金森病模型大鼠行为及病理变化。
方法：SD大鼠62只随机分为实验组50只，正常组12只，采用脑内立体定向，将6-羟基多巴胺注入实验组大鼠右侧黑质致密部和中脑腹侧被盖区以建立帕金森病模型，观察大鼠行为变化、酪氨酸羟化酶及脑内多巴胺含量改变。
结果与结论：2周后实验组经阿朴吗啡诱导后，有22只向左侧旋转速度>7 r/min，2周与4周之间大鼠的旋转圈数差异无显著性意义(P>0.05)。模型组中酪氨酸羟化酶及脑内多巴胺含量明显减少。说明应用6-羟基多巴胺单侧两点注射可成功建立行为及病理相似的帕金森病大鼠模型。 -
帕金森病大鼠黑质细胞凋亡与Bax蛋白表达相关性的实验研究
目的观察6-羟基多巴胺(6-OHDA)能否诱发黑质细胞凋亡以及Bax蛋白表达与黑质细胞凋亡的关系.方法通过脑立体定位注射6-OHDA的方法建立大鼠帕金森病(Parkinson disease,PD)模型,采用TUNEL方法、免疫组织化学、电镜观察等方法,选择6-羟基多巴胺注射术后1 d、7 d、14 d、21 d为研究时点,观察大鼠PD模型形成过程中黑质细胞凋亡的数量及超微结构变化情况,并检测黑质细胞Bax蛋白表达情况变化.结果用TUNEL法发现黑质细胞存在细胞凋亡,与对照组存在显著性差异,1 d～21 d细胞凋亡数逐渐增高;电镜观察在此过程中黑质细胞存在典型的细胞凋亡,Bax蛋白表达在1 d为高,其后很快下降,但显著高于对照组.结论 6-OHDA能诱发大鼠黑质细胞凋亡,Bax蛋白是黑质细胞凋亡的关键启动因素.
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6-羟基多巴胺诱导SH-SY5Y细胞帕金森病模型中14-3-3蛋白表达的研究
目的 应用蛋白质组学技术研究6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导SH-SY5Y细胞帕金森病(PD)模型中14-3-3蛋白的表达变化.方法 在建立6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞PD模型的基础上,分别提取6-OHDA实验组和对照组孵育24 h的细胞总蛋白,应用荧光差异双向凝胶电泳(DIGE)技术获得蛋白点的差异表达信息,运用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)鉴定出差异蛋白质.结果 DIGE分析发现实验组有一个表达明显上调的差异蛋白质点(P＜0.05),经质谱分析鉴定确认为14-3-3蛋白.结论 6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞的PD模型中14-3-3蛋白表达上调,提示14-3-3蛋白上调可能与PD的发病机制有关.
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一氧化氮与帕金森病大鼠模型神经损伤的研究
目的研究一氧化氮(NO)在帕金森病(PD)大鼠模型神经损伤中的作用.方法用高效液相色谱电化学法(HPLC- ET)及还原型辅酶Ⅱ(NADPH)黄递酶组化法观察NO在PD大鼠模型神经损伤中的作用.结果神经型一氧化氮合成酶(nNOS)抑制剂7-硝基吲唑(7-NI)明显减少6-羟基多巴胺(6-OHDA)引起的纹状体多巴胺及其代谢产物的降低(P<0.01);纹状体NADPH黄递酶阳性神经元可抵抗6-OHDA的损伤. 结论来源于神经元的NO参与了PD大鼠模型的神经损伤过程.
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硫辛酸抑制帕金森病模型细胞铁聚积的实验研究
目的 观察硫辛酸(LA)对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的PC12细胞铁代谢的影响,并探讨其作用机制.方法 MTT法确定6-OHDA适造模浓度,筛选LA低、高保护浓度.实验分为正常对照组、模型组(6-OHDA 50 μmol/L)、LA低剂量(0.001 μmol/L)组和LA高剂量(0.1μmol/L)组.比色法测定细胞内MDA、铁含量,Western blot检测铁代谢相关蛋白DMT1(+IRE)、IRP1、IRP2水平,实时荧光定量PCR分析DMT1(+IRE)、IRP1、IRP2的mRNA表达.结果 (1)与对照组相比,模型组细胞活力明显下降(P＜0.01),MDA、铁含量显著增加(P＜0.01),DMT1(+IRE)、IRP1、IRP2蛋白及mRNA水平明显上调(P＜0.01).(2)与模型组相比,LA低、高剂量组细胞活力均上升(P＜0.05,P＜0.01),MDA、铁含量均显著减少(P＜0.01),DMT1(+IRE)、IRP1、IRP2蛋白及mRNA水平均下调(P＜0.05,P＜0.01).(3)与LA低剂量组相比,LA高剂量组MDA、铁含量减少(P＜0.05),DMT1(+IRE)、IRP1蛋白及mRNA水平降低(P＜0.05,P＜0.01);而LA低剂量组与LA高剂量组相比,两组的IRP2蛋白及mRNA表达差异不具有统计学意义(P＞0.05).结论 LA对6-OHDA诱导的PC12细胞损伤具有保护作用,其机制可能是通过抑制IRP/IRE途径下调6-OHDA诱导的DMT1(+IRE)上升,从而减少细胞对铁离子的吸收,减轻铁聚集引起的氧化应激对细胞的损伤.
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蛋白激酶Cδ 参与帕金森大鼠模型 中6-OHDA的神经毒性作用
目的 研究蛋白激酶Cδ(PKCδ)细胞核转移在帕金森大鼠模型神经元丢失中的病理作用.方法40只雄性SD大鼠随机分为Sham组(10只)和PD组(30只),立体定位右侧纹状体注射生理盐水或6-OHDA溶液并通过阿朴吗啡(APO)诱导旋转进行模型筛选,免疫组化检测黑质致密部(SNpc)酪氨酸羟化酶(TH)表达情况.采用Western blotting检测PKCδ蛋白表达并通过共聚焦观察PKCδ在细胞核的表达.结果PD组SNpc部位TH阳性神经元形态发生了病理改变且密度显著下降(P<0.05);Western blotting显示PD组SNpc组织中PKCδ 及Cleaved PKCδ的表达较Sham组显著上调(P<0.05);共聚焦显微镜提示PD组SNpc部位PKCδ与细胞核有共定位.结论PKCδ的酶解激活及细胞核转位可能参与了PD的神经病理发生.
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帕金森病大鼠模型神经元型一氧化氮合酶(nNOS)阳性神经元的实验研究
目的观察研究帕金森病(PD)大鼠模型纹状体神经元型一氧化氮合酶(nNOS)阳性神经元,探讨一氧化氮(NO)在PD发病机制中所起作用.方法应用立体定向技术建立6-OHDA毁损的大鼠PD模型,通过多巴胺受体激动剂阿扑吗啡(APO)测试大鼠旋转行为,免疫组化方法观察黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元和纹状体nNOS阳性神经元的变化.结果大鼠6-OHDA损毁侧黑质TH阳性神经元数目较对侧明显减少,双侧纹状体nNOS阳性神经元数目无显著差异.结论 6-OHDA对TH阳性神经元有损伤作用,而NOS阳性神经元对其具有抵抗作用.NO可能参与了PD发病机制.
关键词： 帕金森病 6-羟基多巴胺 一氧化氮 神经元型一氧化氮合酶 -
帕金森病大鼠显微舌象研究
目的:研究帕金森病大鼠舌象的变化.方法:采用经典的6-羟基多巴胺损毁注射法制作帕金森病大鼠模型,同时设立正常组作对照.采用显微摄像法拍摄大鼠舌象照片,使用Adobe Photoshop7.0图像软件进行舌色量化,并应用基于RGB模型的舌色分析方法进行舌色量化数据分析.结果:模型组大鼠舌色红色度值r1明显高于空白组(P ﹤0.001),模型组大鼠舌色绿色度值r2、蓝色度值r3明显低于正常组(P ﹤0.05或P ﹤0.01).结论:帕金森病模型大鼠的舌象为红舌.
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PKCδ抑制剂减轻6-OHDA诱导的多巴胺能神经细胞凋亡
目的 观察蛋白激酶Cδ抑制剂在6-OHDA诱导多巴胺能神经细胞系SH-SY5Y细胞凋亡过程中所起的作用,探讨帕金森病可能的分子发病机制.方法 体外培养SH-SY5Y细胞,观察PKC抑制剂对6-OHDA毒性作用的影响,分别用台盼蓝染色、流式细胞仪和透射电镜法观察细胞凋亡.结果 PKCδ抑制剂Rottlerin可减轻6-OHDA引起的细胞凋亡.而总PKC抑制剂Bisindolylmaleimide Ⅰ(Bis)和钙依赖性PKC(α和β)抑制剂G(o)6976不能减轻6-OHDA引起的细胞凋亡.结论 PKCδ抑制剂对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞凋亡产生保护作用,PKCδ可能直接参与了帕金森病人的神经元凋亡过程.
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厚朴酚对抗6-OHDA诱导PC12细胞损伤的作用机理研究
目的:探讨厚朴酚对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导PC12细胞损伤的保护作用可能机制.方法:将厚朴酚或6-OHDA加入培养的PC12细胞中.四甲基偶氮唑蓝法(MTT法)检测细胞活力,用荧光分光计法测定细胞损伤过程中活性氧、半胱氨酸蛋白酶3的含量变化.结果:在加入100μmol/L 6-OHDA时PC12细胞活性显著下降,厚朴酚(0.1～10μmol/L)预处理1 h可明显抑制6-OHDA导致的PC12细胞活性下降,ROS含量水平的上升以及caspase-3的活性上升.结论:厚朴酚对6-OHDA诱导的PC12细胞损伤有一定的保护作用,其作用机制涉及到抑制细胞内ROS的产生和Caspase-3的激活.
