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骨唾液酸蛋白对Caspase介导的RAW264.7细胞凋亡的抑制作用
目的:探讨骨唾液酸蛋白(BSP)对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)介导破骨细胞前体RAW264.7凋亡中所起的作用.方法:培养破骨细胞前体RAW264.7,加信号通路相应抑制剂和(或)BSP处理后,用Caspase3/7/8/9检测试剂盒检测细胞Caspase3/7/8/9的活性,用Co-IP检测Caspase-8与整和素αvβ3是否存在相互作用.结果:BSP处理后RAW264.7细胞的Caspase-3/8/9活性下降,显著抑制了RAW264.7细胞的凋亡;而Caspase-8活性与Caspase-3活性存在正相关关系;且Caspase-8与整合素αvβ3存在相互作用.结论:BSP对RAW264.7细胞的抗凋亡作用主要通过调节外源性细胞凋亡途径来实现,并且由Caspase-8引起的细胞凋亡可因BSP与αvβ3的相互结合而抑制.
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骨唾液酸蛋白对破骨细胞前体RAW264．7增殖、分化作用的信号通路
目的：探讨骨唾液酸蛋白（BSP）促进破骨细胞前体RAW264．7增殖和分化的关键信号通路与分子。方法：培养RAW264．7细胞，加BSP及信号通路相应抑制剂处理后，用MTS检测细胞的增殖，用TRAP染色试剂盒检测细胞的分化，用Calcineurin、AKT、JNK、ERK和p38活性检测试剂盒检测其活性。结果：抑制ERK和p38分子可显著抑制BSP促细胞增殖作用；抑制AKT、PI3K、Calcineurin分子可显著降低BSP的促分化作用；随着BSP处理时间的增加，RAW264．7细胞内Calcineurin活性增加；AKT活性在BSP作用48 h时大，JNK、p38和ERK活性则在BSP作用24 h时大。结论：BSP主要通过调节细胞内MAPK通路中的ERK和p38促进RAW264．7细胞的增殖，通过调节AKT、PI3K、Calcineurin通路促进RAW264．7细胞的分化。
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Wnt3a对小鼠破骨细胞分化调控的影响
目的 探讨Wnt3a对小鼠破骨细胞分化调控的影响.方法 将细胞分为4组:阴性对照组(即空白组)、实验对照组(感染Ad-GFP组)、阳性对照组(50 ng/ml RANKL诱导组)、实验组(感染Ad-Wnt3a组).分别给予处理因素后常规细胞培养6d,通过酒石酸抗酸性磷酸酶(TRAP)染色观察破骨细胞的分化成熟情况；Western blot检测TRAP、Cathepsin K蛋白的表达；分别于处理因素后3、6、9d提取细胞总RNA,荧光定量Real time (RT-PCR)检测核因子κB受体(RANK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、组织蛋白酶K(Cathepsin K)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因的表达.结果 TRAP染色显示50 ng/mL RANKL诱导组能成功诱导RAW 264.7成多核(核≥10),空白组和Ad-GFP组有少量多核细胞(3≤核≤5),Ad-Wnt3a组为单核有个别双核；Western blot检测显示Ad-Wnt3a组TRAP、Cathepsin K蛋白表达降低,差异具有统计学意义(P＜ 0.05)；RT-PCR检测Ad-Wnt3a组能下调RANK、TRAP、Cathepsin K、MMP-9基因的表达.结论 Wnt3a能抑制RAW264.7分化成成熟的破骨细胞.
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小鼠EPCs和RAW264.7细胞株体外联合培养体系的建立
目的 体外建立小鼠血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)和破骨细胞前体细胞RAW264.7细胞株共培养体系.方法 EPCs和RAW264.7细胞株共培养为实验组,加了等量细胞培养液但没有加入EPCs的细胞作为对照组.利用分离式培养小室进行细胞联合培养,Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测细胞的增殖,通过检测光密度值绘制共培养过程中RAW264.7细胞生长曲线；逆转录PCR检测共培养1、3、5、7d后RAW264.7细胞VEGFR-2和CXCR4 mRNA的表达；TRAP染色检测破骨细胞活性.结果 和EPCs细胞联合培养能加快RAW264.7细胞的增殖速率,和RAW264.7单独生长比较,共培养3、5、7d后,2组的光密度值差异有显著性(P＜0.01)；共培养促进RAW264.7细胞分化为破骨细胞.结论 在体外联合培养体系中,EPCs具有促进宿主破骨细胞前体细胞增殖与分化的作用.
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补骨脂素抑制破骨细胞形成及其机制的实验研究
目的 探讨补骨脂素对破骨细胞分化的影响,以及对破骨细胞ERα、IL-17R基因表达的调节作用,初步阐明补骨脂素抗骨质疏松作用.方法 采用核因子κB受体活化因子配体体外诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7分化为破骨细胞,以雌二醇作为阳性对照药,补骨脂素分为高剂量(10 μmol/L)、中剂量(5 μmol/L)、低剂量(2.5 μmol/L).通过TRAP染色细胞数和骨吸收陷窝数评价药物抑制破骨细胞分化作用,同时采用RT-PCR和ELISA检测破骨细胞MMP-9、Cathepsin K、TRAP基因表达和蛋白水平,反映破骨细胞活性,RT-PCR和ELISA检测IL-17R、ER-α的基因表达和蛋白水平,初步探讨补骨脂素作用机制.结果 与对照组比较,补骨脂素高、中、低3个浓度均显著抑制破骨细胞形成数和骨陷窝形成数,同时对Cathepsin K、TRAP、IL-17R的基因表达均有显著的抑制作用(P ＜0.05,P＜0.01),并且显著增强ER-α基因表达(P＜0.01).高、中、低剂量的补骨脂素对MMP-9的基因表达有显著的抑制作用(P＜0.05).与对照组比较,高、中剂量的补骨脂素对Cathepsin K的蛋白含量有非常显著的抑制作用(P＜0.01);高、中、低剂量的补骨脂素对TRAP、MMP-9、IL-17R的蛋白含量有显著的抑制作用(P＜0.05,P＜0.01);高、中、低剂量的补骨脂素均显著促进ER-α的蛋白表达(P＜0.01).结论 补骨脂素对破骨细胞的形成和溶骨活性均有显著的抑制作用,该作用可能通过提高破骨细胞雌激素受体的表达和抑制IL-17R的表达实现.
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SR-A受体参与抑制LPS刺激RAW264.7产生炎症因子
目的探讨清道夫受体A能否抑制LPS刺激RAW264.7产生炎症因子.方法 LPS诱导小鼠巨噬细胞株RAW264.7 SR-A受体上调后,用LPS再次刺激,观察SR-A受体的上调能否抑制RAW264.7对LPS的反应,后采用遗传互补实验观察转染SR-A受体后能否抑制LPS活化NF-κB.结果 LPS刺激SR-A受体已上调的RAW264.7产生的炎症因子明显下降,而遗传互补实验证实SR-A受体确实能抑制LPS通过TLR4活化NF-κB.结论 SR-A受体参与负调控LPS对RAW264.7的活化,防止过强的炎症反应.
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脂氧素对巨噬细胞RAW264.7的抗炎实验研究
目的 研究脂氧素(LX) A4和叔丁氧羟基-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(BOC-2)对LPS作用巨噬细胞RAW264.7存活的影响.方法 取对数生长期的巨噬细胞RAW264.7为研究载体,实验用不同浓度的脂多糖(LPS)在不同时间点处理细胞,观察LX A4和BOC-2对LPS作用巨噬细胞RAW264.7后的存活率.CCK-8法观察LPS对各组巨噬细胞RAW264.7的不良反应,Western blot法检测LX A4和BOC-2对LPS处理后巨噬细胞RAW264.7的Toll样受体4(TLR4)和pNF-κB p65蛋白水平,酶联免疫吸附(ELISA)法检测LX A4和BOC-2对LPS处理后巨噬细胞RAW264.7培养上清液中白细胞介素6(IL-6)水平.结果 在1 000 ng/mL浓度LPS组,作用时间6h,巨噬细胞RAW264.7内TLR4蛋白水平和pNF-κB p65蛋白水平显著高于其余各组(P＜0.05).在LPS作用下,LX A4组细胞存活率显著高于对照组(P＜0.05);BOC-2组在LPS作用后巨噬细胞RAW264.7的存活率显著低于无LPS作用(P＜0.05).在LPS作用下,LX A4组pNF-κB p65蛋白水平低于对照组及BOC-2组(P＜0.05),BOC-2组pNF-κB p65蛋白水平高于其余各组(P＜0.05).在LPS作用下,LX A4组IL-6的水平低于对照组及BOC-2组(P＜0.05).结论 LX A4能够抑制LPS对巨噬细胞RAW264.7的作用及TLR4/NF-κB信号通路的激活,有助减轻炎性反应.
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Rac1对巨噬细胞RAW264.7细胞生物学作用的影响
目的 分析巨噬细胞RAW264.7的Rac1表达水平,通过构建Rac1载体和特异性siRNA探讨其对RAW264.7细胞生物学活性的影响.方法 经反转录法克隆Rac1的cDNA并构建Rac1基因表达载体,Western blot技术检测Rac1的蛋白表达水平,定量荧光PCR(qRT-PCR)测定Rac1 mRNA,流式细胞术分析细胞表面膜分子表达的改变,Transwell法观察细胞的迁移能力,ELISA法检测细胞培养上清中相关细胞因子的表达.结果 经测序等手段鉴定表明,Rac1载体构建成功,且将Rac1载体转入RAW264.7细胞可见其mRNA和蛋白表达均明显上调、细胞迁移能力增强,但对RAW264.7细胞膜表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ类分子的表达没有明显影响.然而,Rac1抑制剂及其特异性siRNA却可上调上述3种膜分子的表达.此外,Rac1转染的RAW264.7细胞分泌的IL-1β水平显著低于siRNA处理组及Rac1抑制剂组,而IL-6、IL-33、TNF-α的表达各组之间没有显著差异.结论 Rac1的表达有助于RAW264.7细胞的迁移和抑制IL-1β的分泌,而对细胞的抗原提呈作用无显著影响.
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氯喹对金黄色葡萄球菌激活的RAW264.7巨噬细胞表达TNF-α的影响
目的 分析氯喹(CQ)对灭活金黄色葡萄球菌(SAC)刺激活化的RAW264.7巨噬细胞表达肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响,探讨其对革兰氏阳性菌引起的炎症反应的潜在作用及机制.方法 采用细胞内细胞因子染色法分析胞内TNF-α的表达,利用流式微球阵列法检测细胞培养上清中TNF-α的表达,应用定量RT-PCR检测TNF-α的mRNA表达水平,免疫印迹法分析NF-κB信号通路的活化以及TNF-α前体的表达.结果 CQ明显抑制SAC激活的RAW264.7巨噬细胞分泌可溶性TNF-α,而细胞内TNF-α表达水平提高.定量RT-PCR显示CQ对TNF-α的mRNA水平没有影响;与此相一致,CQ对调控其转录的关键信号通路NF-κB p65的磷酸化水平影响不大.然而,免疫印迹分析表明,CQ使SAC诱导的Mr 26 000和28 000 TNF-α前体蛋白的表达水平显著升高.结论 CQ通过抑制TNF-α从膜结合的Mr26 000和28 000前体蛋白转变为可溶性成熟蛋白的加工过程而抑制该炎症细胞因子的分泌,从而发挥其抗炎效应.
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雪胆素甲通过破坏微丝结构诱导LPS活化的RAW264.7细胞凋亡
目的 分析雪胆素甲(CuⅡa)对脂多糖(LPS)活化的RAW264.7巨噬细胞的影响,探讨其潜在的抗炎效应及作用机制.方法 MTS法检测CuⅡa对RAW264.7细胞增殖的作用,相差显微镜观察CuⅡa对LPS活化的细胞形态的影响,荧光显微镜观察CuⅡa对细胞骨架的影响,流式细胞仪检测亚二倍体(凋亡)峰的变化,免疫印迹检测Cleaved caspase-3、生存素以及G-actin与F-actin的变化.结果 CuⅡa能明显抑制RAW264.7细胞的增殖,并呈时间和剂量依赖性,但单独CuIIa不能有效诱导细胞凋亡.CuⅡa使LPS活化的伸展细胞收缩变圆,伪足突起消失,G-actin水平下降,细胞内发生严重的Actin聚集,说明微丝结构被破坏.随着CuⅡa浓度的增加,其诱导LPS活化的RAW264.7细胞处于sub-G0/G1(凋亡峰)的数量明显增加.免疫印迹分析显示CuⅡa使Caspase-3明显活化,生存索急剧下降.结论 CuⅡa可能通过引起Actin聚集而破坏微丝细胞骨架,诱导LPS活化的RAW264.7细胞发生凋亡,从而发挥其抗炎效应.
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Fucoidan选择性抑制LPS诱导巨噬细胞分泌IL-12
目的探讨配体fucoidan活化清道夫受体后能否抑制LPS刺激巨噬细胞分泌IL-12.方法不同剂量的fucoidan(以多价阴离子chondroitin为阴性对照)与RAW264.7作用10 min后,加入等量的LPS刺激,检测上清中IL-1270、IL-6和TNF-α;同时观察不同剂量fucoidan对RAW264.7贴壁的影响.结果不同剂量的fucoidan能不同程度促进LPS诱导RAW264.7分泌炎症因子IL-6和TNF-α,但却能明显地抑制IL-12的分泌;随着所加fucoidan量的增加,RAW264.7细胞的贴壁能力逐渐下降.结论Fucoidan可能通过与清道夫受体SR-A(scavenger receptor A)结合发挥其特异抑制LPS诱导巨噬细胞分泌IL-12的作用.
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激活素A对RAW264.7巨噬细胞活性的调节作用
目的探讨激活素A对参与炎症反应的小鼠巨噬细胞活性调节作用.方法以LPS刺激活化的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞作为阳性参照,ELISA法检测激活素A及LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7细胞IL-1β分泌水平,还原酶法分析NO分泌水平,RT-PCR检测IL-1β和iNOS mRNA的表达,瑞氏染色检测RAW264.7细胞吞噬活性.结果在激活素A刺激下RAW264.7细胞IL-1β和NO分泌水平均明显升高,IL-1β和iNOS mRNA表达亦增加,巨噬细胞吞噬活性增强;激活素A和LPS共刺激RAW264.7细胞时,激活素A明显抑制LPS刺激的RAW264.7细胞IL-1β和NO产生水平,以及IL-1β和iNOSmRNA表达,巨噬细胞吞噬活性也明显低于LPS单独刺激组.结论激活素对巨噬细胞的活性调节具有双重作用,这种作用与巨噬细胞的激活状态有关.
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高表达AhR的RAW264.7细胞株的构建及对炎症细胞因子调控的研究
目的 构建稳定高表达芳香烃受体(AhR)的小鼠RAW264.7细胞株,观察AhR对脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7细胞炎症细胞因子表达的影响.方法 构建含AhR-Flag-EGFP基因的慢病毒重组质粒载体并获得病毒上清,感染RAW264.7细胞后经嘌呤霉素筛选获得稳定表达的单克隆细胞株,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测绿色荧光蛋白表达情况,qRT-PCR和Western blot法验证AhR基因及蛋白水平表达情况.qRT-PCR和ELISA检测LPS刺激后炎症细胞因子的表达情况.结果 获得1株稳定高表达AhR的RAW264.7细胞,荧光显微镜和流式细胞仪显示其荧光率达100％,qRT-PCR和Western blot结果表明RAW/AhR稳转组相对于RAW/Vector空转组,AhR的mRNA和蛋白水平明显上调(P＜0.05).LPS刺激后炎症相关细胞因子表达升高,相对于空转组,稳转组的促炎细胞因子IL-6、IL-1β的表达更低(P＜0.05),抗炎细胞因子IL-10的表达更高(P＜0.05).结论 成功构建稳定表达AhR的RAW264.7单克隆细胞株,证实了AhR对LPS刺激的巨噬细胞炎症反应具有负性调控作用,为后续进一步研究巨噬细胞中AhR的免疫调节及其他功能奠定基础.
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MicroRNAs途径在RAW264.7细胞中作用的初步研究
目的 通过检测microRNAs生成的关键酶Dicer在RAW264.7细胞不同功能状态下的表达差异研究microRNAs途径在其中产生的作用.方法 采用QRT-PCR、流式细胞术等对RAW264.7细胞在不同功能分化状态下的Dicer酶进行检测.结果 GMCSF与MCSF分别刺激RAW264.7细胞诱导其增殖分化后,Dicer酶的mRNA水平显著增高,但随刺激时间呈现不同趋势(P＜ 0.01)；在诱导凋亡死亡状态下,RAW264.7中Dicer酶的表达下降30％( P＜0.01)；LPS与IL-4分别诱导RAW264.7细胞分化为M1和M2型,Dicer的表达与M1、M2型相关炎性因子的表达有相关性.结论 MicroRNAs调控途径参与并影响RAW264.7不同功能状态.
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间歇性张应力对小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7分化成熟的影响
目的：探讨张应力对破骨前体细胞小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7分化成熟的影响。方法：施加1000με、3000με、5000με间歇性张应力于体外诱导分化的RAW264.7细胞，采用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和吖啶橙染色观察破骨细胞形成情况，并分析比较各组破骨细胞分化状况。结果：牵张应力促进了破骨细胞的增殖和分化，其TRAP阳性细胞增多，且随着牵张力量的增强TRAP阳性细胞数量呈增加趋势，但张应力增加到5000μεTRAP阳性细胞数量增加不明显。结论：间歇性的牵张力促进了小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7向破骨细胞的分化。
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氧化还原蛋白1对RAW264.7巨噬细胞炎症反应的刺激作用
目的 研究过氧化还原蛋白1(PORD1)对RAW264.7细胞炎性介质一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子α(TNFα)释放量的影响.方法 用MTT法检测重组蛋白PORD1对RAW264.7细胞的毒性,一步法检测RAW264.7细胞上清液中NO的含量;ELISA法检测RAW264.7细胞上清中TNFα的含量.结果 与空白组比较,50 nmol· L-1PORD1对细胞有显著毒性,20、10、5 nmol·L-1均无细胞毒性;PORD1可以诱导RAW264.7细胞中NO和TNFα大量表达.结论 外源性重组蛋白PORD1可以促进炎症反应的发生,其机制可能与增强炎症介质的释放有关.
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不同PEG含量对mPEG-PLGA-mPEG纳米粒血浆蛋白吸附和体外细胞摄取的影响
目的 考察不同PEG含量对mPEG-PLGA-mPEG(PELGE)纳米粒血浆蛋白吸附和巨噬细胞吞噬的影响.方法 利用SDS-PAGE电泳技术,分析不同纳米粒的血浆蛋白吸附;以小鼠巨噬细胞RAW 264.7为模型,采用化学发光法分析不同纳米粒的吞噬情况.结果 与结论 PEG含量为5%～10%时,纳米粒吸附少的血浆蛋白,而且被巨噬细胞吞噬也少.由此,可设计出适合于静脉注射的、可生物降解的、长循环的药物载体.
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维药狭叶薰衣草抗炎活性部位筛选研究
目的:从薰衣草的不同提取部位中筛选出抗炎活性部位.方法:采用二甲苯致小鼠耳肿胀模型和冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性模型进行抗炎活性筛选,再将活性好的部位采用细胞炎症模型进行相关分子机制的初步研究.结果:XYC-3、XYC-5对二甲苯致小鼠耳肿胀实验有明显抑制作用(P<0.05);XYC-3对小鼠毛细血管通透性实验有显著抑制作用(P<0.05);XYC-3、XYC-5有明显抑制LPS诱导的NO产生,且NO水平抑制率随着提取物浓度成正比;还可抑制LPS刺激的RAW 264.7细胞中TNF-α,IL-6的产生,可有效抑制炎症因子的释放.结论:XYC-3和XYC-5具有明显的抗炎作用,为薰衣草的抗炎活性部位.
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干扰NaV1.9对RAW264.7细胞增殖、吞噬和迁移的影响
目的 应用RNA干扰技术沉默RAW264.7小鼠巨噬细胞中电压门控性钠通道(VGSCs/NaVs)α亚单位NaV1.9基因,建立稳定干扰细胞株,并观察其对细胞增殖活性、吞噬能力和迁移功能的影响.方法 通过LipofectamineTM2000将短发夹RNA(shRNA)干扰质粒转染至RAW264.7细胞,经G418筛选获得稳定细胞株.用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定干扰效率,CCK-8法测定稳定细胞株的增殖活性,流式细胞术检测细胞的细胞周期及吞噬能力,Transwell小室法检测细胞的迁移功能.结果 成功建立稳定干扰NaV1.9的细胞株,RT-PCR法鉴定干扰效率达80％.CCK-8法及流式细胞术结果显示,降低NaV1.9的表达使细胞增殖活性下降(P＜0.05)；流式细胞术结果显示,抑制NaV1.9的表达使细胞吞噬能力降低(P＜0.05)；Transwell小室法结果显示,干扰NaV1.9的表达使细胞迁移能力减弱(P＜0.05).结论 建立了稳定干扰NaV1.9的RAW264.7细胞株,下调NaV1.9的表达使巨噬细胞增殖活性、吞噬能力和迁移功能显著降低.
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小鼠sST2基因真核表达及其对LPS活化RAW264.7巨噬细胞的调节作用
目的:克隆并构建含小鼠sST2和人IgG Fc 融合基因的真核表达质粒, 初步探讨其表达产物sST2-Fc融合蛋白对LPS刺激小鼠巨噬细胞生物学活性的影响.方法:借助RT-PCR技术, 从小鼠脾脏总RNA中扩增全长sST2 cDNA, 构建sST2与hIgG Fc段融合基因的真核表达载体(psST2-Fc).应用脂质体将重组质粒psST2-Fc转染CHO细胞, 经G418筛选, 获得稳定表达sST2-Fc融合蛋白的CHO细胞株.细胞培养上清经蛋白A亲和层析纯化后, 采用Western blot进行鉴定, 应用FACS检测sST2-Fc与RAW264.7巨噬细胞表面相应受体结合情况;ELISA法检测sST2-Fc对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的影响.结果:测序证实克隆和构建的小鼠sST2-Fc cDNA阅读框序列正确, Western blot 证实sST2-Fc融合蛋白的表达, sST2-Fc抑制LPS诱导巨噬细胞分泌的炎性细胞因子TNF-α和IL-6.结论:成功构建sST2-Fc融合基因并获得稳定表达, sST2-Fc通过与其特异性受体结合可抑制巨噬细胞介导的炎性反应.
