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脓毒血症患者白细胞急剧升降一例
内毒素是革兰氏阴性(G-)菌细胞壁上脂多糖(LPS)和微量蛋白的复合物,正常机体肠腔内含有大量G-菌及内毒素,当血液感染G-菌或内毒素移位时,内毒素激活多种细胞产生大量细胞因子及炎症介质,引发全身炎症反应,如发热、WBC增加、血管微循环障碍等.
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缺氧诱导因子-1α对脂多糖所致心肌细胞线粒体功能损伤的影响
目的 探讨心肌细胞缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导心肌细胞线粒体功能损伤的影响.方法 培养新生乳鼠心肌细胞,随机(随机数字法)分为4组.①C组:常规心肌细胞培养,不予任何处理；②LPS组:给予1μg/mlLPS,培养2h；③YC-1 +LPS组:预给HIF-1α特异性抑制剂YC-1 4μmol/L培养8h,再加入1 μg/mlLPS,培养2h；④YC-1组:仅给予4μmol/L YC-1培养8h.利用荧光分光光度计测定线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP),荧光素酶法测定细胞ATP含量,比色法测定细胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase,COX)活性,Western blot测定细胞色素氧化酶亚单位1,2的蛋白表达水平.结果 与C组相比,LPS显著抑制心肌细胞MMP、COX活性,ATP含量也显著降低(P＜0.05),并抑制COX-1蛋白表达(P＜0.05),上调COX-2蛋白表达(P＜0.05).与LPS组相比,HIF-1α抑制剂YC-1能进一步降低心肌细胞MMP、COX活性及ATP含量(P＜0.01),显著增加COX-1表达并使COX-2表达的下调(P＜0.01).结论 HIF-1α抑制剂YC-1可能通过改变COX-1及COX-2表达,加重LPS所致的心肌细胞线粒体功能的损伤,提示HIF-1α对LPS诱导的心肌细胞线粒体损伤可能具有保护作用.
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痰热清注射液对急性肺损伤大鼠肺内炎症因子的影响
目的 研究痰热清注射液对内毒素性急性肺损伤(ALI)大鼠肺内炎症因子的影响。方法 清洁级健康SD雄性大鼠56只，随机（随机数字法）分为空白组、模型组、干预组。模型组、干预组分别给予内毒素(LPS)尾静脉注射，1h后，干预组给予痰热清注射液尾静脉注射。三组分别选取2，4，6h三个观察点，取支气管肺泡灌洗液(BALF)放射免疫法检测TNF-α，IL-1β，IL-8的含量及Wright-Giermsa染色计中性粒细胞的比例(ωPMN),并观察肺组织病理学变化及测湿干质量比值(W/D)。采用SPSS 17.0统计软件，以P＜0.05为差异具有统计学意义。结果2，4，6h三个观察点，模型组BALF中TNF-α，IL-1β，IL-8的含量及ωPMN较空白组明显升高(P＜0.05或P＜0.01)，肺组织W/D明显增加(P＜0.01)，且病理损伤程度明显重于空白组。干预组BALF中TNF-α，IL-1β，IL-8的含量及ωPMN较模型组明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，肺组织W/D明显减少(P＜0.01)且病理损伤程度明显轻于模型组。结论 痰热清注射液能抑制内毒素性急性肺损伤肺内炎症因子水平，减轻急性肺损伤程度。
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异丙酚对急性肺损伤大鼠肺组织凋亡及NF-κB p65的影响
目的 探讨不同剂量异丙酚对脂多糖诱导大鼠急性肺损伤(acute lung injury,ALI)凋亡及NF-KB p65的影响.方法 60只SD大鼠随机(随机数字法)分为5组:空白对照(NS)组,模型(All)组和不同剂量丙泊酚干预(P1,P2,P3)组.HE染色和血气分析评估模型制备成功与否,流式细胞术及蛋白免疫印迹法通过单因素方差分析,检测肺组织凋亡和NF-KB活化情况.结果 模型组肺部损伤达到Au标准,模型制备成功;丙泊酚干预组肺损伤较模型组明显减轻,且呈剂量依赖性;与对照组比较,模型组肺组织细胞凋亡率显著增加,NF-κB P65核转位显著增加,核浆比显著高于对照组(P<0.05);与模型组比较,异丙酚干预组肺组织凋亡率显著减少,核转位显著减少,P1,P2,P3组核浆比显著低于模型组,(P<0.05).结论 异丙酚对脂多糖诱导大鼠急性肺损伤具有保护作用;异丙酚能显著抑制肺组织细胞凋亡和NF-κB核转位;异丙酚对脂多糖诱导大鼠ALI的拮抗作用可能与抑制肺组织凋亡和抑制NF-κB P65核转位有关.
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MicroRNA-29a在脂多糖诱导人单核细胞凋亡中的作用和机制
目的 探讨microRNA-29a (miR-29a)对人单核细胞株THP-1凋亡的作用及其机制.方法 体外培养人单核细胞株THP-1和人胚肾细胞株293T,合成人miR-29a的拟似物(mimic)和抑制剂(inhibitor).用脂质体Lipofectamine RNAiMAX转染miR-29a的mimic或inhibitor进入THP-1细胞,分组处理后收集细胞标本.第1组细胞转染mimic (100 nmol/L) 48 h；第2组细胞先转染inhibitor(100 nmol/L) 24 h,再用脂多糖(LPS)诱导24h,分别用流式细胞仪方法检测两组细胞凋亡,用real time RT-PCR方法检测抗凋亡基因Bcl-2和Mcl-1的表达变化.构建Bcl-2和Mcl-1的荧光素酶报告基因载体,用脂质体Lipofectamine 2000转染293T细胞(DNA质粒和miRNA片段共转染),双荧光素酶报告基因系统(luciferase)检测荧光素酶的表达变化.应用SPSS 13.0统计软件,采取单因素方差分析或t检验进行数据统计分析.结果 THP-1细胞转染miR-29a的mimic48 h后,细胞凋亡较对照组增加(17.38％增加至42.06％)；单独用LPS诱导THP-1细胞,24 h后细胞凋亡较对照组增加；THP-1细胞先转染inhibitor 24 h后,再用LPS诱导24 h,细胞凋亡较单独用LPS诱导组减少(由51.50％降至38.09％)；THP-1细胞转染miR-29a的mimic后,抗凋亡基因Bcl-2和Mcl-1的表达水平降低明显(P＜0.05).另外,Luciferase检测结果显示,在293T细胞中,双萤光报告系统显示miR-29a可特异抑制带有Bcl-2和Mcl-13'UTR上野生型识别元件的报告基因表达(P＜0.05).结论 上调miR-29a的表达水平能促进THP-1细胞发生凋亡,下调miR-29a的表达水平则能抑制LPS诱导的THP-1细胞凋亡,miR-29a调控THP-1的凋亡水平是通过靶向于两个抗凋亡基因Bcl-2和Mcl-1实现的,提示miR-29a在调控免疫细胞的凋亡过程中具有重要的作用.
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乌司他丁对脂多糖诱导的大鼠肺组织Toll样受体4信号通路表达的影响
目的 探讨乌司他丁对脓毒性大鼠肺损伤的保护机制.方法 选健康清洁级SD大鼠30只,随机(随机数字法)分为生理盐水对照组10只、脂多糖(LPS)组10只、脂多糖+乌司他丁(LPS+ UTI)组10只.注药24 h后取肺组织观察形态学改变,分别应用RT-PCR或Western blot 及ELISA方法测定肺组织Toll样受体4(TLR4)、核因子-κB (NF-κB)及肿瘤坏死因子TNF-α mRNA及蛋白表达.结果 脂多糖导致大鼠肺组织损伤,乌司他丁可下调肺组织TLR4 mRNA (t=3.563,P=0.032)、TNF-α mRNA(t=5.147,P=0.028)及TLR4蛋白(t=2.692,P=0.041)、NF-κB蛋白(t=2.459,P=0.024)、TNF-α蛋白(t=3.336,P=0.037)表达,并减轻肺损伤.结论 乌司他丁对脂多糖致肺损伤具有一定保护作用,其机制之一可能与抑制TLR4-NF-κB信号途径转导有关.
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Tat-NBD多肽抑制胰腺腺泡细胞AR42J细胞的核因子-kB相关性炎症反应
目的 通过脂多糖在体外刺激大鼠胰腺腺泡细胞AR42J,诱导胰腺腺泡细胞发生炎性效应,探讨NF-kB必需调节蛋白结合域多肽对脂多糖诱导的炎性效应的干预作用与机制,为急性胰腺炎的治疗机制和研究提供新的途径.方法 以脂多糖(0.1mg/L,1mg/L,10 mg/L,100 mg/L)刺激大鼠胰腺腺泡细胞AR42J构建急性胰腺炎的体外模型.不同浓度的免疫缺陷性病毒的Tat多肽的蛋白转导功能区和野牛型NBD多肽融合成Tat-NBD多肽对AR42J细胞进行预处理,突变型Tat-NBD(MT)多肽,Tat,NBD作为对照.半定量逆转录-多聚酶链反应法观察TNF-α的mRNA表达的改变;定量酶联免疫吸附法检测培养液上清中TNF-α蛋白浓度的改变.链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物免疫细胞化学法观察NF-kB-p65蛋白的合成和核转移的情况.结果 Tat-NBD(WT)多肽可以抑制LPS诱导的AR42J炎症细胞因子TNF-α mRNA和蛋白的表达,且抑制NF-kB-p65蛋白表达与移位,呈剂量依赖方式(P＜0.05).对照的单纯NBD多肽、突变型Tat-NBD(MT)多肽、Tat均不能抑制TNF-αmRNA和蛋白的表达,且不能抑制NF-kB-p65蛋白的向核内转移.结论 TAT-NBD(WT)多肽可以呈剂量依赖方式地抑制LPS诱导的AR42J促炎细胞因子TNF-αmRNA和TNF-α蛋白的表达,可能与阻止NF-kB p65蛋白表达及核移位有关.本研究的结果可为急性胰腺炎的治疗与研究提供新的途径.
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维生素D对脂多糖致急性肺损伤大鼠肺组织血管紧张素转化酶2和维生素D受体表达水平的影响
目的 观察维生素D(vitamin D,Vit D)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)致Wistar大鼠急性肺损伤(acute lung injury,ALI)肺组织中血管紧张素转化酶2(angiotensinconverting enzyme 2,ACE2)和维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)表达水平的影响.方法 采用尾静脉注射LPS方法制备大鼠ALI模型;将30只健康雄性Wistar大鼠随机(随机数字法)分为6组:正常对照组(NC组)、LPS组:尾静脉注射LPS 5mg/kg、Vit D组:给予Vit D活性形式(骨化三醇)25 μg/kg连续灌胃3d和(LPS+ Vit D) 1-3组:分别于骨化三醇1μg/kg、5μg/kg、25 μg/kg灌胃3d后尾静脉注射LPS 5mg/kg,所有大鼠于注射LPS的24 h后进行后续实验.分别观察大鼠一般情况,肺组织病理及肺干/湿重比变化、肺组织中VDR、ACE2蛋白及基因水平的表达.结果 LPS组大鼠病态表现(呼吸浅快、精神萎靡、口鼻可见血性分泌物)明显,(LPS+ VitD) 1-3组病态表现和肺组织病理损伤均较LPS组明显减轻.LPS组VDR和ACE2蛋白及基因水平的表达均较NC组和Vit D组显著降低(P＜0.05),(LPS+ VitD) 1-3组各组VDR和ACE2蛋白及基因水平的表达均较LPS组有所升高(P＜0.05),但仍显著低于Vit D组(P＜0.05),其中(LPS+ Vit D) 1-3组各组VDR蛋白及基因水平的表达差异无统计学意义(P＞0.05),ACE2的表达差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Vit D能使LPS致ALI大鼠肺组织中ACE2和VDR蛋白及基因表达水平增加,故此推测ACE2和VDR表达增加可能对ALI的发生、发展起保护作用.
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盐酸戊乙奎醚对脂多糖诱导的内皮细胞损伤的保护作用
目的 探讨盐酸戊乙奎醚(PHC)对脂多糖(LPS)诱导的内皮细胞损伤的影响及其作用机制.方法 用RPMI 1640培养基将人脐静脉内皮细胞在5%CO2、37℃培养箱中培养,并分为对照组,LPS组及PHC组.检测细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)、细胞中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮(NO)水平.提取细胞核蛋白,Western blot分析细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)磷酸化蛋白的表达.采用SPSS 13.0统计软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义.结果 与对照组比较.LPS组LDH含量[(1 642±367)U/L vs.(169±33)U/L]、MDA含量[(13.2±1.2)nmol/L vs.(7.2±0.8)nmoL/mL]及NO水平[(143.2±10.3)μmol/L vs.(85.5 4.4.1)μmol/L]明显增多,SOD活性明显下降[(41.2 ±2.7)U/mL vs.(61.1±2.8)U/mL],ERK1/2和JNK磷酸化表达明显增高.PHC可显著降低LDH含量[(392 4.90)U/L],降低MDA[(8.6±1.3)nmol/mL]和NO水平[(92.1 ±6.6)μmol/L],提高SOD活性[(58.0±3.0)U/mL],减弱ERK1/2磷酸化蛋白表达.结论 盐酸戊乙奎醚对脂多糖诱导的内皮细胞损伤具有保护作用,其作用机制可能与抑制ERK1/2磷酸化表达减少过氧化物的产生有关.
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髓系细胞触发受体-1对大鼠肠巨噬细胞凋亡的影响
目的 探讨髓系细胞触发受体-1 (triggering receptor expressed on myeloid cells-1,TREM-1)的表达对大鼠肠巨噬细胞凋亡的影响.方法 体外培养肠巨噬细胞,实验3分组,每组6孔:对照组、LPS组及LPS+LP17组.加入药物LPS(1 mg/L)和LP17 (0.1 mg/L),培养6h后用TUNEL试剂盒及流式细胞仪对大鼠肠巨噬细胞凋亡进行检测,利用SPSS 18.0软件进行统计分析.结果 细胞生长状态良好,分布均匀,细胞活力约为80％～85％,CD14免疫荧光鉴定证实为肠巨噬细胞.经药物处理后,TUNEL检测细胞凋亡情况:LPS组(44.33±7.74)％较对照组(19.17±6.01)％明显增多(P=0.000),LPS+ LP17组(28.33±6.53)％的凋亡细胞比LPS组(44.33±7.74)％明显减少(P =0.004),对照组(19.17 ±6.01)与LPS+ LP17组(28.33±6.53)％的凋亡细胞差异无统计学意义(P =0.050).采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况:LPS组(16.47±1.66)％较对照组(7.70±1.52)％明显增多(P=0.000),LPS+LP17组(11.47±3.12)％的凋亡细胞比LPS组(16.47±1.66)％明显减少(P=0.018),对照组(7.70±1.52)％与LPS+ LP17组(11.47±3.12)％的凋亡细胞差异无统计学意义(P =0.061).结论 LP17能抑制肠巨噬细胞TREM-1的表达,减少肠巨噬细胞凋亡.
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金钠多对脂多糖所致急性肺损伤大鼠的保护作用
目的 研究金钠多对脂多糖(LPS)所致急性肺损伤(ALI)的保护机制及治疗作用.方法 采用尾静脉注射脂多糖,按5 mg/kg剂量注射,复制急性肺损伤大鼠模型.将63只Wistar品系大鼠随机分成3组,分别为空白对照组、脂多糖损伤组、金钠多治疗组.各组再随机分为3组,分别为尾静脉注射后2h、6 h和10 h.利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中可溶性ICAM-1(sICAM-1)水平,肺组织标本分别用免疫组化(定性)和蛋白印迹(定量)方法检测其NFκB核因子.结果 尾静脉注射脂多糖可成功复制出急性肺损伤大鼠模型;治疗组血清sICAM-1水平明显高于空白对照组(P＜0.01),损伤组的血清sICAM-1水平明显高于治疗组和空白对照组(P＜0.01);免疫组化和蛋白印迹实验证实,NF-κB核因子在各组中的阳性表达强度为:金钠多损伤组＞脂多糖治疗组＞空白对照组(P＜0.01).结论 脂多糖可诱导急性肺损伤,金钠多对脂多糖所致的急性肺损伤具有显著的保护作用,其机制可能是抑制了肺组织细胞NF-κB的活性.
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脂肪干细胞在脂多糖诱导急性肺损伤大鼠肺部的定植及对TNF-α、IL-4表达的影响
目的 探讨5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)标记的脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)在脂多糖(LPS)诱导急性肺损伤大鼠肺部的定植情况及对TNF-α、IL-4表达的影响.方法 雄性SD大鼠30只,随机数字表法分为对照组、LPS组和LPS+ADSCs组(均n=10).腹腔注射LPS 8 mg/kg制备大鼠ALI模型,对照组腹腔注射生理盐水4 mL/kg,LPS+ADSCs组于制模30 min后尾静脉注射300μL ADSCs进行干预,对照组及LPS组30 min后尾静脉注射300μL生理盐水.观察大鼠的死亡时间,24 h后取肺组织标本及左心室血,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-4(IL-4)水平.开胸取肺组织,检测肺湿/干质量(W/D)比值,光镜下观察肺组织病理学改变,免疫荧光显微镜观察脂肪干细胞在肺部的定植情况.组间两两比较采用LSD-t检验.结果 LPS组与LPS+ADSCs组比较,病死率差异无统计学意义(50％vs.70％,P>0.05);EdU标记的ADSCs通过大鼠尾静脉注入后24 h在肺部广泛定植;与对照组比较,LPS组肺组织损伤较重,肺W/D比值、血TNF-α 水平均显著增加(均P<0.01),IL-4水平显著降低(P<0.01).与LPS组比较,LPS+ADSCs组肺组织损伤程度明显减轻,肺W/D比值(5.57±0.27 vs.5.98±0.28)及血TNF-α 水平均显著降低[(41.51±4.14)ng/L vs.(45.52±3.74)ng/L],均P<0.05,IL-4水平显著升高[(7.01±1.11)pg/mL vs.(3.27±0.54)pg/mL,P<0.05].结论 ADSCs可定植在LPS诱导ALI大鼠的肺部并能有效减轻TNF-α 的炎症反应,提高抗炎因子IL-4水平.
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脂氧素A4对小鼠巨噬细胞钙池操纵的钙通道及活性氧的影响
目的 研究脂氧素A4对LPS诱导的小鼠RAW 264.7巨噬细胞钙池操纵的钙通道活化及活性氧产生的影响,探讨脂氧素A4保护内毒素性肺损伤的具体机制.方法 小鼠RAW 264.7巨噬细胞,随机分为对照组、LPS组、Thapsigargin组、脂氧素A4+LPs组、脂氧素A4+Thaosigargin组、2-Aminoethoxydiphenylborate+Thapsigargin组.采用细胞内钙离子特异性荧光探针Fluo3/AM和活性氧特异性荧光探针DCFH-DA标记小鼠巨噬细胞.激光共聚焦显微镜动态观察巨噬细胞游离钙浓度变化,流式细胞仪测定活性氧产生变化.结果 脂多糖呈剂量依赖升高细胞内游离钙浓度和活性氧的产生.脂氧素A4抑制脂多糖引起的钙内流(抑制率为93%),脂氧素A4同时可抑制Thapsigargin激活钙池操纵的钙通道引起的钙内流(抑制率为75%).脂多糖诱导巨噬细胞产生大量活性氧(阳性细胞百分比为28.87%±4.5%),脂氧素A4抑制脂多糖诱导巨噬细胞产生活性氧(阳性细胞百分比11.16%±2.5%,P<0.05).结论 脂多糖通过促进内钙释放而开放钙池操纵的钙通道,大量细胞外钙内流引起钙超载,活性氧大量产生,组织细胞损伤.脂氧素A4可能通过抑制钙池操纵的钙通道,使外钙内流减少,保持细胞钙稳态,减少活性氧的生成而起到抗炎促炎症消退作用.
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脂多糖调控 miR-211／Sirt1在加重缺氧诱导心肌细胞凋亡中的作用价值
目的：研究显示 Sirtuin1（ Sirt1）可通过去乙酰化酶活性调控 L 脂多糖（ lipopolysaccharide， LPS）病理过程，进而改善临床急诊脓毒血症患者的预后。通过数据库检索显示microRNA-211（miR-211）与Sirt1具有靶向匹配，然而其生物学关联意义尚无数据。本研究旨在探讨miR-211与Sirt1间的关联，以及它们是否参与LPS加重缺氧对心肌细胞损伤作用。方法原代培养大鼠（ SD）乳鼠心肌细胞，应用 qRT-PCR 法检测 LPS 处理4 h后对大鼠乳鼠心肌细胞（ neonatal nat cardiomyocytes， NRC）与H9c2心肌细胞中miR-211表达的变化，用Western blot法检测LPS处理后对NRC与H9c2心肌细胞中Sirt1蛋白表达的影响；同时应用CCK8法评价LPS对心肌细胞H9c2的细胞增殖情况；以及TUNEL法定量检测NRC与H9c2心肌细胞凋亡活性的影响。结果与对照组相比，20μg／mL、40μg／mL浓度的LPS处理4 h后， H9 c2心肌细胞在24～72 h时间段的增殖能力没有发生改变。然而， LPS预处理后NRC与H9c2在缺氧条件下细胞凋亡明显增加（较LPS未处理NRC与H9 c2组凋亡率增加均超过了100％， P＜0.05）；同时LPS处理后NRC与H9c2细胞中miR-211表达显著上调，且伴随其靶蛋白Sirt1表达明显下降（P分别＜0.05）。结论LPS可以增加缺氧诱导的心肌细胞凋亡，这与LPS通过上调miR-211水平进而抑制Sirt1表达这一作用机制密切相关。
关键词： microRNA-211 SIRT1 心肌细胞 脂多糖 细胞凋亡 -
核因子-κB对胰腺AR42J细胞肿瘤坏死因子-α表达的调控
目的 探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对胰腺腺泡AR42J细胞细胞因子表达的影响及其可能机制,进一步阐明急性胰腺炎的发病机制.方法 用不同质量浓度的LPS(0.001,0.01,0.1,1,10,100 mg/L)刺激AR42J细胞18 h,同时用10mg/L的LPS刺激AR42J细胞不同时间(2,6,12,18,24h),RT-PCR检测核因子-κB(NF-κB)P65和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达的变化,放射免疫法(RIA)检测培养液上清TNF-α蛋白浓度的改变.对NF-κB(P65)mRNA的表达与TNF-α mRNA的表达进行相关和回归分析.结果 RT-PCR结果表明0.001 mg/L的LPS处理AR42J细胞时即可出现TNF-α及NF-κB(P65)mRNA表达的明显上调,且呈量效关系;用10 mg/L的IPS处理后,在2 h后即可出现TNF-α及NF-κB(P65)mRNA表达的明显上调,并且呈时效关系.RIA结果表明用0.01 mg/L的LPS处理AR42J细胞后即可出现TNF-α蛋白表达的明显上调,且呈量效关系;用10mg/L的LPS处理后,在6 h后即可出现TNF-α蛋白表达的明显上调,并且呈时效关系.TNF-α mRNA的表达与P65 mRNA的表达呈正相关.结论 LPS可以以时间剂量依赖方式地刺激AR42J细胞NF-κB(P65)和TNF-α的表达,NF-κB(P65)mRNA的表达与TNF-αmRNA的表达呈正相关.针对NF-κB靶点,抑制其活性,可为包括AP的治疗提供一条新的途径.
关键词： 急性胰腺炎 脂多糖 胰腺腺泡AR42J细胞 核因子-κB 肿瘤坏死因子-α -
益赛普对脂多糖引起大鼠急性肝损伤的保护作用
目的 探讨注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(益赛普,rhu TNFR:Fc)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)致大鼠急性肝损伤的保护作用及作用机制.方法健康成年SD大鼠48只,随机分为4组:对照组,益赛普组,LPS模型组(急性肝损伤组)和益赛普+LPS组(益赛普治疗组),每组12只.大鼠禁食12 h后麻醉并行颈动脉插管,颈动脉插管后连接到ALC-MPA多道牛物信号分析系统监测血压,对照组注射等体积生理盐水;益赛普组24 h前皮下注射益赛普0.4mg/kg,插管稳定后舌下静脉注射等体积生理盐水;LPS模型组舌下静脉注射LPS 10mg/kg;益赛普+LPS组24 h前皮下注射益赛普0.4 mg/kg,然后舌下静脉注射LPS 10 mg/kg,此过程每组6只采用多道生物信号分析系统监测各组大鼠血压变化和大鼠死亡情况,并计算各组存活率,平均血压低于10 mmHg时记为大鼠死亡并即刻取肝,右叶同一部位肝组织10%中性福尔马林固定,部分保存于-80℃.观察6 h仍未死亡即处死.每组的另外6只大鼠在LPS或生理盐水注射后0.5 h采血2 mL,离心后取其上清液,保存于-80℃,用于测定TNF-α含量和活性,3 h再采血用于测定ALT、AST的含量.采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量和用流式细胞术测其活性;生化法测定血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、门冬氨酸转氨酶(AST)含量;同时测定肝组织超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)活性和丙二醛(MDA)含量及观察肝脏的形态学变化.应用单因素方差分析TNF-α含量及其活性、ALT、ASY含量以及MPO和MDA含量,X~2检验分析大鼠存活率.结果 对照组和益赛普组大鼠在观察期间(6 h)全部存活;益赛普+LPS组较LPS组:大鼠存活率提高(67%vs.17%,P<0.05),TNF-α活性低[(7.3±2.8)%vs.(51.3±6.4)%,P<0.05],肝组织的SOD活性增高[(188.4±20.2)U/mg prot vs.(142.5±18.3)U/mg prot,P<0.05];肝组织MPO活性降低[(0.38±0.04)U/g vs.(0.54±0.02)U/g,P<0.05]肝组织MDA含量降低[(1.40±0.10)nmol/mg prot vs.(2.81±0.11)nmol/mgprot,P<0.05],同时益赛普可降低血清AST、ALT,减轻肝组织的病理损伤.结论益赛普对LPS所致急性肝损伤有保护作用,其机制主要是与抑制TNF-α活性和抗氧化作用有关.
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MicroRNA-132增强乙酰胆碱对肺泡巨噬细胞炎症反应的抑制作用
目的 观察调控microRNA-132 (miR-132)联合乙酰胆碱(ACh)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠肺泡巨噬细胞炎症反应的作用.方法 分别采用FAM荧光标记的mimic/inhibitor阴性对照(NC)、miR-132 mimic/inhibitor、mimic/inhibitor NC转染大鼠肺泡巨噬细胞NR8383,通过荧光显微镜观察转染效率,实时荧光定量PCR检测miR-132的表达.转染后细胞给予LPS(1μg/mL)刺激或LPS+ ACh(10 μmoL/L)处理,采用酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β (IL-1β)及白细胞介素-6(IL-6)浓度.两组间均数比较采用独立样本t检验,以P ＜0.05为差异具有统计学意义.结果 通过在NR8383细胞中转染mimic FAM NC确定50 nmol/L为转染mimic的佳浓度.与mimic NC组相比,miR-132 mimic组细胞中miR-132的表达上调了(21.54±2.14)倍(P=0.001).LPS组中结果发现miR-132 mimic上清液中TNF-α(P=0.683)、IL-1β(P=0.770)、IL-6(P=0.872)水平较mimic NC差异均无统计学意义;LPS+ ACh+ mimic NC组TNF-α(P=0.008)、IL-1β(P =0.004)、IL-6 (P =0.003)水平与LPS+mimic NC组相比均下降;LPS+ ACh+ miR-132 mimic组TNF-α(P=0.001)、IL-1β (P =0.001)、IL-6 (P =0.001)水平与LPS+ ACh+ mimic NC组相比均下降.通过转染inhibitor FAM NC确定100nmol/L为转染inhibitor的佳浓度.LPS组miR-132 inhibitor上清液中TNF-α(P=0.800)、IL-1β(P =0.449)、IL-6 (P =0.418)水平较inhibitor NC差异均无统计学意义.LPS+ ACh组结果显示miR-132 inhibitor可逆转ACh介导的TNF-α (P =0.018)、IL-1β (P =0.022)、IL-6 (P=0.032)水平的下降.结论 在体外培养环境,单独给予LPS时过表达miR-132或抑制miR-132活性不影响肺泡巨噬细胞炎症反应,但miR-132可增强ACh对LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应的抑制作用.
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血管紧张素转换酶2改善肝细胞炎症分子机制
目的 探讨血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)2通过抑制P38促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)/激活蛋白(activator protein,AP)-1通路改善脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的肝细胞炎症反应的分子机制.方法 培养永生化大鼠BRL肝细胞,随机分为5组:对照组、LPS(10μg/mL)组、LPS+重组(recombinant,r) ACE2 (LPS处理前30 min予5、10、20 ng/mL rACE2)组、LPS+ACE2抑制剂MLN-4760(LPS处理前30 min予10-7,10-6,105 mmol/L MLN-4760)组、LPS+rACE2(LPS处理前30 min予20ng/mL rACE2)+P38MAPK抑制剂SB203580(LPS处理前30 min予10-5 mmol/L SB203580)组.于LPS处理后6、12、24 h应用Western blot方法检测ACE2、P38MAPK、磷酸化(p)-P38MAPK、AP-1蛋白表达.实时定量PCR方法检测P38MAPK、AP-1、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达.结果 与对照组相比,LPS处理后ACE2、P38MAPK、AP-1蛋白表达呈时间依赖性激活,均于12 h达峰值(均P＜0.05).与LPS组相比,rACE2组AP-1、P38MAPK、p-P38MAPK、肿瘤坏死因子α表达明显下降(均P＜0.05),20 ng/mL浓度的rACE2对AP-1(0.12±0.002 vs.0.04±0.005,P＜0.01)、P38MAPK(0.17±0.02 vs.0.02±0.002,P＜0.01)、p-P38MAPK(0.29±0.01 vs.0.02±0.01,P＜0.01)的抑制作用强.MLN-4760组上述因子表达明显升高(均P＜0.05),并呈剂量依赖性.SB203580去除了rACE2对AP-1、TNF-α表达的抑制作用.结论 rACE2通过下调P38MAPK/AP-1信号通路改善LPS诱导的肝细胞炎症.
关键词： 血管紧张素转换酶2 P38促分裂原活化蛋白激酶 脂多糖 肝细胞炎症 分子机制 -
生长激素抑制大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的机制
目的 研究生长激素(growth horlnone,GH)抑制脂多糖(Lipopolysaceharide,LPS)诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial typeⅡcell,AEC Ⅱ)凋亡的口I能机制.方法 原代培养成年雄性SD大鼠AECⅡ细胞,按如下方式分5组(每组8个复孔):I组:对照组(仅加DMEM培养基);Ⅱ组:LPS10ug/ml损伤组;Ⅲ组:GH1组(UPS 10 ug/ml+GH 50 ng/ml);Ⅳ组:GH2组(LPS 10 ug/ml+GH 100ng/ml);V组:GH3组(LPS 10 ug/ml+GH 200 ng/ml).IPS在其他试剂均加入并置37℃5%CO2培养箱培养1 h后再加入.培养24 h后,分别对AECⅡ细胞进行流式细胞仪检测细胞凋亡和免疫组化法检测Fas蛋白表达.统计方法 采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验,以P<0.05为差异具有统计学意义.结果 (1)Ⅱ～V组的细胞凋亡率及坏死率均明显高于I组(g凋亡率Ⅰ.Ⅱ=12.26,q坏死率Ⅰ,Ⅱ=18.34,q调亡率Ⅰ.Ⅲ=9.63,q坏死率Ⅰ.Ⅲ=5.75,q凋亡率I,Ⅳ=9.15,q坏死率Ⅰ,Ⅳ:5.39,q凋亡率Ⅰ.Ⅴ=10.87,q坏死率Ⅰ,Ⅴ=5.91,P<0.05).但Ⅲ～Ⅴ比Ⅱ组均有明显下降(q凋亡率Ⅱ,Ⅲ=15.24,q坏死率Ⅱ,Ⅲ=16.38,q凋亡率Ⅱ.Ⅳ=15.95,q坏死率Ⅱ.Ⅳ=16.95,q凋亡率Ⅱ.Ⅴ:14.57,q坏死率Ⅱ,Ⅴ=15.61,P<0.05).(2)Ⅱ～Ⅴ组Fas阳性率明显高于Ⅰ组(qⅠ.Ⅱ=35.67,qⅠ,Ⅲ=14.32,qⅠ.Ⅳ=13.87,q Ⅰ,=26.16,P<0.05),但Ⅲ～V组Fas阳性率比Ⅱ组有明显降低(qⅡ,Ⅲ=12.54,qⅡ,Ⅳ=13.02,qⅡ,Ⅴ=6.96,P<0.05).结论 GH可能通过降低AECⅡ细胞的Fas抗原的表达而使LPS所诱导的AECⅡ细胞凋亡减少.
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角质细胞生长因子受体腺病毒表达载体在脂多糖所致肺泡上皮细胞损伤修复中的应用
目的观察KGFR腺病毒表达载体在脂多糖(LPS)致A549细胞损伤模型中转基因表达KGFR的情况及其促使A549细胞对抗LPS损伤的效果,为基因治疗急性肺损伤探索有效途径.方法KGFR腺病毒表达载体感染LPS致伤前后的A549细胞,通过形态学观察转基因作用对LPS致伤前后A549细胞的影响,并运用western blot检测KGFR腺病毒表达载体在LPS致伤前后的A549细胞中转基因表达KGFR蛋白情况.结果KGFR腺病毒表达载体感染LPS致伤前后的A549细胞,转基因组对抗LPS致伤作用明显,western blot检测表明KGFR腺病毒表达载体转基因表达KGFR蛋白效果显著(P<0.05).结论KGFR腺病毒表达载体能够转基因表达KGFR蛋白,并具备转基因治疗急性肺损伤的能力.
关键词： 角质细胞生长因子受体 腺病毒载体 急性肺损伤 脂多糖 基因治疗
