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脂多糖诱导小鼠肺损伤模型巨噬细胞活化及共刺激分子CD40上调研究
目的 观察肺泡巨噬细胞(AM)活化过程和共刺激分子CD40表达变化,探讨其在脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤(ALI)模型中所发挥的作用.方法 BALB/c小鼠分为正常对照组和LPS处理组.光镜观察24、48 h肺组织病理变化;RT-PCR测定活化巨噬细胞(activated macrophage,AMψ)中TLR4表达;电泳迁移率变动分析(EMSA)检测AMψ核提取物中NF-kB的活性;Northern blot检测CD4O mRNA表达,流式细胞术检测CD40蛋白表达;ELISA测定肺泡灌洗液(BALF)中TNF-a、MIP-2及IL-1β的含量.结果 小鼠吸入LPS后,肺泡隔断裂、肺间质充血及肺泡腔中性粒细胞浸润,并检测到AMψ表面TLR4的表达、核转录因子NF-kb活性增强、共刺激分子CD40 mRNA和蛋白显著表达,并随着时间延长出现增加趋势,BALF中炎症因子释放增加,正常对照组无明显变化(P＜0.05).结论 LPS诱导的ALI中,AM活化和共刺激分子CD40上调,导致瀑链式炎症反应,造成肺急性炎症损伤.
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糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞TLR4的表达及对LPS反应性的研究
目的 观察糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体4(TLR4)的表达水平及其对脂多糖(LPS)反应性的变化,探讨该变化在糖尿病机体防御病原体感染中的作用.方法 将32只Wistar雄性大鼠用随机数字表法分为正常组(A组)、糖尿病组(B组)、正常+LPS组(C组)及糖尿病+LPS组(D组).用免疫细胞化学染色法、RT-PCR及Western blot方法检测各组大鼠肺泡巨噬细胞TLR4表达的变化.结果 B组及C组大鼠肺泡巨噬细胞TLR4表达与A组相比均明显增高(P<0.001);D组大鼠肺泡巨噬细胞TLR4表达较B组及C组升高更为明显(P<0.001).结论 与正常大鼠相比,糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞TLR4表达明显增高,LPS刺激后其增高更加显著,提示糖尿病机体处于促炎症状态,相关的机制尚有待深入的研究.
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内毒素诱导的肺损伤与CD26/CD30表达的动态研究
目的 探讨脓毒症小鼠外周血淋巴细胞TH1/TH2应答模式偏移的动态性变化.方法 采用尾静脉注射LPS建立小鼠肺损伤模型,用流式细胞术检测CD26+/CD30+,以判断TH1、TH2细胞的分化情况及TH1/TH2应答模式的偏移状况.结果 LPS组的CD26+T细胞在注射后7 h已有明显增多,并在注射后14 h达到峰值,38 h降至低点,而后各时点表达率的变化则趋于平稳,保持在正常对照组水平附近.CD30+T细胞亦从注射后7 h开始增加,并于注射后38 h达峰值,随后缓慢下降(P＜0.01).肺组织病理切片显示注射后38 h小鼠发生肺组织损伤.结论 TH1/TH2应答模式向TH2方向的偏移以及细胞免疫抑制可能是LPS诱导的肺损伤的重要因素.
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在LPS刺激的枯否细胞中敲减干扰素调节因子3（IRF3）表达可影响多条信号转导通路
目的：探讨 IRF3 shRNA对脂多糖( lipopolysaccharide,LPS)刺激枯否细胞( Kupffer cell,KC) TLR4信号下游 IRF3-IFN-β、NF-κB/p38 MAPK-TNF-α/IL-1β和 IL-10分子的影响。方法采用在体灌注分离培养大鼠原代KC,并以IRF3 shRNA腺病毒体外感染KC。细胞分4组：1组：腺病毒(-)LPS(-)；2组：腺病毒(-)LPS(+)；3组：腺病毒(+)LPS(-)；4组：腺病毒(+)LPS(+)。 KC培养上清液细胞因子的分泌水平采用ELISA分析；mRNA表达采用real-time PCR检测；KC核蛋白质表达采用 Western blot方法。结果 LPS刺激诱导了原代 KC对 IRF3 mRNA和蛋白质的表达, IRF3 shRNA腺病毒应用后,细胞对IRF3 mRNA的组成性表达及LPS刺激诱导的IRF3 mRNA和蛋白质表达均明显受抑,但对IRF3蛋白质核内组成性表达无明显影响；LPS刺激枯否细胞IFN-β mRNA表达和蛋白质分泌均升高。 IRF3 shRNA应用后,抑制了上述LPS的刺激效应,但对细胞IFN-β的组成性表达和分泌无明显影响；LPS刺激诱导了细胞对前炎细胞因子TNF-α和IL-1β mRNA表达及蛋白质的分泌,IRF3 shRNA腺病毒的应用,抑制了LPS刺激诱导细胞TNF-α和IL-1β蛋白质分泌水平,但对LPS刺激细胞TNF-α和IL-1β mRNA表达以及细胞组成性TNF-α和IL-1β mRNA表达和蛋白质分泌无明显影响；LPS刺激后,细胞IL-10 mRNA表达和培养上清液IL-10蛋白质分泌均显著增加。 IRF3 shRNA腺病毒的应用,促进了LPS刺激诱导KC对IL-10的转录表达和分泌,但对细胞组成性IL-10表达和分泌无明显影响；LPS刺激使核内p-p65和p-p38 MAPK蛋白水平升高,但IRF3 shRNA腺病毒应用对LPS刺激细胞上述分子表达及对细胞组成性表达均无明显影响。结论干扰腺病毒能有效抑制LPS刺激原代枯否细胞IRF3表达及其下游信号转导；IRF3有助于促进LPS刺激KC对TNF-α和IL-1β分泌,但抑制LPS刺激后IL-10的表达；LPS诱导细胞NF-κB和p38 MAPK活化不受IRF3信号影响。
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LPS提高单核细胞TRAIL表达及诱导肝细胞凋亡的研究
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand, TRAIL)是近年来新发现的TNF家族中成员[1],与TNF、FasL不同,它除了诱导肿瘤细胞及病毒转染细胞发生凋亡外,近研究发现TRAIL同样能诱导正常肝细胞凋亡[2],其在病毒性肝炎发病机理中的作用受到重视.本实验从脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)致单核细胞TRAIL表达情况作研究,探讨LPS通过TRAIL致肝细胞凋亡途径在重型病毒性乙型肝炎致病机理中的可能作用.
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脂多糖通过TLR4对幼年哮喘大鼠气道炎症的调节作用
以前的研究表明,TH2细胞的优势应答是导致嗜酸性粒细胞性哮喘发生发展的主要免疫学基础[1].近年研究发现,Toll样受体(TLR)信号通路激活诱导TH1免疫应答的作用可用来防治有害的TH2优势应答,如哮喘病的发生发展[2].
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铜绿假单胞菌表面脂多糖适配体的筛选及其抑制巨噬细胞极化的研究
目的 筛选与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)表面脂多糖( LPS)特异性结合的适配体,探讨其抑制巨噬细胞极化的效果.方法 提取PA的LPS成分,通过指数富集的配基系统进化技术 ( SELEX)筛选与其特异性结合的高亲和力 DNA 适配体,利用酶联寡聚核苷酸吸附试验(ELONA)、定量PCR(Q-PCR)等方法探讨其对巨噬细胞极化的影响.结果 本研究筛选出能与PA-LPS特异性结合的适配体PL-6,并发现其能够阻断PA-LPS与相应受体TLR4的结合,抑制巨噬细胞M1型过度极化,维持巨噬细胞稳态.结论 本研究筛选出可与PA-LPS特异性结合的高亲和力适配体,为PA可能引起脓毒症的预防和治疗提供了新的策略.
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双歧杆菌表面分子对LPS在小鼠体内调节胸腺细胞凋亡的观察
目的 研究双歧杆菌表面分子细胞壁肽聚糖(WPG)、脂磷壁酸(LTA)对LPS体内诱导小鼠胸腺细胞凋亡的调节. 方法 用DNA凝胶电泳、TUNEL法检测WPG、LTA对LPS体内诱导小鼠胸腺细胞凋亡的影响,并分别用生物活性法和Griess反应测定WPG、LTA、LPS体外诱生TNF-α、NO2-的含量. 结果 WPG、LTA可显著抑制LPS体内诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡.WPG、LTA单独刺激巨噬细胞时所诱生的TNF-α、NO的量显著低于LPS刺激时所产生的这两种活性介质的量,而WPG、LTA与LPS共同应用时可显著降低LPS诱导巨噬细胞产生的TNF-α、NO的量;诱生型一氧化氮合成酶抑制剂S-甲基异硫脲硫酸盐体外可抑制巨噬细胞产生的NO的量,在体内可部分抑制LPS诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡. 结论 WPG、LTA与LPS共同应用时,可抑制LPS诱导的巨噬细胞产生的TNF-α、NO的量,从而下调LPS体内诱导小鼠胸腺细胞的凋亡.
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双歧杆菌LTA、EPS 对小鼠巨噬细胞活力的影响
脂磷壁酸(LTA)和胞外多糖(EPS)是双歧杆菌的细胞壁表面物质,在抗肿瘤和提高免疫力方面已成为研究热点.据此,本研究采用MTT法、荧光显微镜形态观察及激光扫描共聚焦分子生物学观察法检测LTA和EPS对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫激活能力,并通过脂多糖(LPS)作用组做对照,进一步探讨LTA和EPS提高免疫活性机理及影响程度.
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抗大肠杆菌O157:H7特异性IgY的免疫反应特性初探
分别以水煮法灭活E.coli O157：H7制备菌体抗原、热酚水法提取脂多糖(LPS)和乙酸水解LPS制备O抗原多糖(OPS)3种抗原免疫产蛋母鸡4次.
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双歧杆菌的完整肽聚糖对LPS激活裸鼠腹腔巨噬细胞的影响
目的 了解被LPS激活的裸鼠腹腔巨噬细胞在用双歧双歧杆菌的完整肽聚糖刺激后产生的NO、iNOS及cGMP的水平.方法 以Griess试剂、激光共聚焦显微镜以及放免法分别测定裸鼠腹腔巨噬细胞产生的NO、iNOS及cGMP的水平.结果 完整肽聚糖注射组裸鼠腹腔巨噬细胞在LPS诱导下产生的NO、iNOS及cGMP含量均显著高于对照组(P<0.01).结论 双歧双歧杆菌的完整肽聚糖能协同LPS激活巨噬细胞,使之分泌多量的NO、iNOS及cGMP,这些信号效应分子介导了完整肽聚糖的多种重要生理功能.
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牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导THP-1细胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-6能力及其相关Toll样受体的差异性
目的 探讨牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)脂多糖(LPS)诱导人单核-巨噬样细胞THP-1分泌IL-1β、TNF-α、IL-6能力及相关Toll样受体(TLR)的差异. 方法 采用酚水法提取Pg ATCC33277株脂多糖(Pg-LPS),并用红外光谱法和鲎试验进行鉴定.采用ELISA试剂盒定量检测Pg-LPS作用的THP-1细胞分泌IL-1β、TNF-α和IL-6水平.采用TLR2或TLR4单克隆抗体阻断试验联合ELISA检测,了解Pg-LPS结合靶细胞上Toll样受体的类型.实验中采用大肠杆菌0111:B4株脂多糖(E-LPS)作为对照. 结果 1μg/ml Pg-LPS作用THP-1细胞,分别于0.5、6和6 h检测分泌IL-1β、TNF-α和IL-6的水平明显升高(P
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牙龈卟啉菌脂多糖诱导HL-60细胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-6能力及其相关Toll样受体和信号通路的差异
目的 探讨牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)脂多糖诱导人粒细胞HL-60分泌IL-1β、TNF-c、IL-6能力差异及其相关Toll样受体和信号通路.方法 采用酚水法提取牙龈卟啉菌ATCC33277株脂多糖(Pg-LPS).采用ELISA试剂盒定量检测Pg-LPS作用的HL-60细胞分泌IL-1β、TNF-α和IL-6水平.采用TLR2或TLR4单克隆抗体阻断试验联合ELISA检测,了解Pg-LPS结合靶细胞上Toll样受体的类型.采用JNK、P38MAPK和NF-κB通路特异性阻断剂的阻断试验联合ELISA检测,了解Pg-LPS诱导HL-60细胞分泌IL-1β、TNF-α和IL-6的相关胞内信号传导通路.实验中采用大肠杆菌O111:B4脂多糖(E-LPS)作为对照.结果 1μg/ml Pg-LPS分别作用24、48和48 h或1 μg/ml ELPS分别作用48、48和72 h,HL-60细胞分泌的IL-1β、TNF-α和IL-6水平明显升高(P＜0.01);Pg-LPS诱生的TNF-α高浓度与E-LPS相近(P＞0.05),但诱生的IL-1β和IL-6高浓度明显高于E-LPS(P＜0.05).TLR2单抗可抑制Pg-LPS诱导HL-60细胞分泌IL-1β、TNF-α或IL-6的活性(P＜0.05),但ELPS诱导HL-60细胞分泌上述3种细胞因子的活性仅可被TLR4单抗所抑制(P＜0.05).Pg-LPS诱导HL-60细胞分泌IL-1β、TNF-α和IL-6的信号通路分别为JNK和NF-κB、JNK和P38MAPK及NF-κB、JNK和P38MAPK(P＜0.05),E-LPS则分别为JNK和P38MAPK及NF-κB、P38MAPK和NF-κB、P38MAPK和NF-κB(P＜0.05).结论 Pg-LPS诱导HL-60细胞分泌IL-1β、TNF-α和IL-6活性高于E-LPS.TLR2和TLR4分别可能是Pg-LPS和E-LPS的受体.Pg-LPS诱导HL-60细胞合成上述细胞因子的信号传导通路与E-LPS明显不同,不同细胞因子合成的胞内信号传导通路也不尽相同.
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TLR4在慢性重型肝炎患者中的表达及意义
Toll样受体4(TLR4)是细胞壁脂多糖(LPS)的特异性受体,可通过特定的细胞信号转导途径介导细胞免疫,以造成机体的损伤.本研究通过检测慢性重型肝炎患者外周血单个核细胞(淋巴细胞、单核细胞)表面的TLR4表达水平,探讨其在慢性重型肝炎中的意义及作用机制.
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猕猴实验性内毒素休克早期炎症相关细胞因子水平的检测
LPS(脂多糖)是内毒素的主要成分,虽不直接引起组织损伤,但可通过刺激某些内源性炎症介质,特别是细胞因子的过度分泌介导一系列病理生理反应,如血压过低、发热、组织坏死、血管内皮损伤、多器官功能衰竭,终导致死亡.
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LPS刺激诱导人卵巢癌细胞株Toll样受体4表达及细胞免疫调节
目的 探讨脂多糖(LPS)刺激对体外培养的人卵巢癌细胞株SKOV3的生长、Toll样受体4(TLR4)的表达、细胞活性氧(ROS)表达及6种炎性细胞因子分泌水平变化的影响.方法 用流式细胞仪测定不同浓度LPS刺激SKOV3 4 h后TLR4的表达水平;用LPS分别刺激SKOV3细胞不同时间后,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪分析TLR4表达、细胞周期分布、ROS表达水平以及细胞因子分泌水平.结果 TLR4表达与LPS作用浓度之间存在浓度依赖性和大量效曲线关系;LPS刺激组与正常组的细胞增殖、细胞周期PrI值(细胞增殖指数,S+G_2/M)、ROS表达水平、细胞因子分泌水平均有显著性差异.结论 LPS具有诱导卵巢癌细胞TLR4表达、活性氧表达、炎症因子分泌以及细胞增殖和抑制的作用.
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交叉保护性抗LPS多克隆抗体的制备与LPS多表位模拟肽的筛选
目的获得具交叉保护性的抗细菌脂多糖(LPS)多克隆抗体与模拟LPS多表位的噬菌体展示环肽克隆. 方法制备具交叉反应性的兔抗鼠伤寒沙门菌抗血清,鉴定抗血清对大肠杆菌和铜绿假单胞菌攻击小鼠的交叉保护性.以亲和纯化的多克隆抗体为靶,亲和筛选噬菌体随机环七肽库.双夹心ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性噬菌体克隆. 结果兔抗血清能与多种来源的LPS反应,对用大肠杆菌和铜绿假单胞菌攻击的小鼠有显著的保护性.用亲和层析纯化的多克隆抗体为靶分子进行3轮筛选,随机挑选46个克隆,其中20个克隆显示与多抗结合.鼠伤寒沙门菌LPS可抑制阳性噬菌体克隆与多抗结合,所有克隆的IC50(达到50%抑制率的LPS浓度)为125ng/ml.挑选其中10个克隆测序并推导氨基酸序列,其中5个克隆具X-QFYP-X-A保守序列;3个克隆具LFTFAHY序列;2个克隆具YQYYPAA序列,所有序列非极性氨基酸含量平均值为80.0%. 结论获得能与多种LPS反应且具交叉保护作用的兔多克隆抗体,筛选得到可模拟鼠伤寒沙门菌LPS多表位噬菌体展示环七肽.
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MyD88/PI3-K/NF-κB途径介导脂氧素A4拮抗LPS诱导大鼠内皮细胞的白细胞介素合成
目的 研究脂氧素A4(LXA4)对脂多糖(LPS)诱导血管内皮细胞合成白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8的影响,并探讨其机制.方法 对体外培养大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC),用LXA4预孵育,再加入LPS;或单用LPS刺激PMVEC.在孵育后用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清中的IL-1β、IL-6、IL-8蛋白表达;用RT-PCR法检测IL-1β、IL-6、IL-8的mRNA表达.应用Western blot法检测磷酸化的磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-K)、髓细胞分化因子88(MyD88)的表达.应用凝胶电泳迁移率试验(EMSA)测定核因子-κB(NF-κB)和活化蛋白-1(AP-1)的DNA结合活性.结果 LXA4呈剂量依赖性地抑制LPS诱导的PMVEC的IL-1β、IL-6、IL-8的蛋白合成与mRNA表达,抑制PI-3K的表达,抑制NF-κB和AP-1的DNA结合活性,但不影响LPS诱导的MyD88表达.结论 LXA4通过下调PI3-K的表达和NF-κB、AP-1的DNA结合活性,拮抗LPS对PMVEC的IL-1β、IL-6、IL-8合成的诱导作用.
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板蓝根抑制脂多糖诱导的p38蛋白激酶活性研究
目的探讨板蓝根对内毒素介导的信号传导的影响. 方法取出BALB/c小鼠腹腔内的单核细胞,分别用板蓝根提取液Ⅲ组分(1mg/ml)+LPS 100μg/ml;板蓝根提取液Ⅲ组分(1mg/ml)+金黄色葡萄球菌(106CFU/ml);只用LPS 100μg/ml;不加LPS和其它药物,直接用DMEM培养液,培养6*!h.取培养上清液检测TNF、IL-6、NO水平,收集细胞检测胞内p38 MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)活性.然后将板蓝根液按倍比稀释至1∶8倍时,加入LPS 100μg/ml,培养6*!h后收集细胞测p38 MAPK活性. 结果加入板蓝根提取液的单核细胞p38 MAPK活性未见明显增强,TNF、IL-6、NO水平无明显上升,与单独加入LPS后这些指标显著增高相比,差异有极显著性(P<0.01).而加入金黄色葡萄球菌组单个核细胞p38 MAPK活性,产生TNF、IL-6、NO浓度仍然较高.板蓝根液倍比稀释后,p38 MAPK活性逐渐上升. 结论板蓝根可特异性抑制由内毒素介导的p38活性,并呈浓度依赖性.
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Toll样受体4基因多态性与脓毒症的关系
目的 用SPSS 16.0进行统计学分析,多组比较采用方差分析,两两比较采用采用LSD-t检验和秩和检验.结果 深圳地区G-杆菌感染患者TRL4 2244,2299位点均发生不同程度的变异,与文献报道的健康中国人群相比,2299A→G基因型频率有明显差异(P<0.05).但无论从死亡率、感染性休克发生率、ICU平均住院时间、ICU平均费用进行SNP阳性和阴性两组比较,均无统计学意义(P值分别为0.741,0.405,0.160,0.129).结论 TRL4基因5'调控区2244,2299位点确实在深圳地区脓毒症患者中存在广泛存在的遗传学变异,2299A→G基因型频率可能具有地区和人群分布差异.影响脓毒症患者病情发展和预后的因素较复杂,基因多态性可能仅仅是众多的影响因素之一.
