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β-Arrestin 2缺失导致的小鼠骨重塑与骨组织GPER1表达下降关联
目的 探讨β-arrestin 2缺失对小鼠骨重塑的影响及其发生机制.方法 采用16、26、30周龄β-arrestin 2敲除雌鼠和野生型雌鼠,通过双能X射线吸收法(DXA)检测其全身骨密度,微CT检测股骨微结构,RT-PCR检测骨形成、骨吸收相关因子和G蛋白耦联雌激素受体1的表达.结果 β-Arrestin 2敲除雌鼠在16周龄已出现全身骨密度降低,16、26、30周分别降低了8.10％、7.53％、8.56％.骨微结构检测显示3个周龄雌鼠骨体积分数均降低(分别为53.3％、49.4％、55.7％),骨小梁数量均减少(分别为53.2％、52.1％、49.3％),与各自的对照组野生型小鼠相比,差异均具有显著性(P＜0.05).相反随着周龄的增长,敲除雌鼠骨小梁模式因子、间距、结构模型指数差异逐渐增大,至30周时与对照野生型小鼠相比差异统计学显著(分别增加了32.0％、54.3％、23.7％,P＜0.05).胫骨RT-PCR检测显示护骨素,破骨细胞分化因子(RANKL)和G蛋白耦联雌激素受体1(GPER1) mRNA表达均降低,与对照组有明显差异(P＜0.05).结论 β-Arrestin 2缺失导致的小鼠骨重塑与GPER1表达相关,提示其可能通过G蛋白耦联雌激素受体信号通路影响骨重塑.
关键词： β-arrestin2 骨密度 骨微结构 护骨素 G蛋白耦联雌激素受体1 -
护骨素对高糖环境人脐静脉内皮细胞的保护作用及机制研究
目的 探讨护骨素对高糖环境人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的影响及其机制.方法 (1)HUVECs分别在正糖(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖(33 mmol/L葡萄糖)、高糖+护骨素(0.5、1、2μg/ml)、高渗(5.5 mmol/L葡萄糖+27.5 mmol/L甘露醇)环境培养48 h,以流式细胞术及Hoechst 33 258核染色检测各组细胞凋亡情况,Western印迹分析各组Bcl-2、Bax蛋白表达水平；(2) HUVECs分别在正糖、高糖、高糖+护骨素(2 μg/ml)、高糖+雷帕霉素(10 ng/mL)、高糖+雷帕霉素(10 ng1/ml)+护骨素(2μg/ml)环境培养24 h,Western印迹分析各组mTORC1下游核糖体蛋白S6激酶(S6K)、p-S6K、真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1 (4EBP1)及p-4EBP1蛋白表达水平;(3) HUVECs分别在正糖、高糖、高糖+护骨素(2μg/ml)环境培养24 h,Western印迹分析各组mTORC1上游马铃薯球蛋白(tuberin)、p-tuberin蛋白表达水平.结果 (1)与正糖组比较,高糖组细胞凋亡率、Bax表达水平显著增加(P＜0.05),Bcl-2表达显著降低(P＜0.05)；高糖+护骨素组细胞凋亡率、Bax表达水平明显低于高糖组,而又高于正糖组(P＜0.05),Bcl-2表达明显高于高糖组,而又低于正糖组(P＜0.05)；高渗组与正糖组比较无统计学差异；(2)与正糖组比较,高糖组p-S6K、p-4EBP1表达水平显著增高(P＜0.05)；高糖+护骨素组p-S6K、p-4EBP1表达水平明显低于高糖组,而又高于正糖组(P＜0.05)；高糖+雷帕霉素组与高糖+护骨素组比较无统计学差异；(3)与正糖组比较,高糖组p-tuberin表达水平显著增高(P＜0.05)；高糖+护骨素组p-tuberin表达水平明显低于高糖组,而又高于正糖组(P＜0.05).结论 护骨素对高糖环境HUVECs具有保护作用,其机制可能通过下调tuberin-mTORC1活性,从而实现对高糖损伤的血管内皮细胞的保护效应.
关键词： 高糖 人脐静脉内皮细胞 护骨素 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1 -
淫羊藿次甙Ⅱ对小鼠成骨细胞护骨素表达的影响
以17β-雌二醇为阳性对照组,观察不同浓度淫羊藿次甙Ⅱ对成骨细胞护骨素(OPG)表达的影响,结果发现20.ng/dl淫羊藿次甙Ⅱ上调成骨细胞OPGmRNA的表达,且优于阳性对照组(P<0.05),淫羊藿次甙Ⅱ也显著增加成骨细胞OPG分泌水平,20 ng/dl淫羊藿次甙Ⅱ组的促分泌活性显著优于阳性对照组,提示淫羊藿次甙Ⅱ作为淫羊藿甙在体内的主要代谢产物,在体外较低剂量即可显著促进成骨细胞OPG的表达,具有良好的抗骨质疏松作用.
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RNA干扰基因敲低雌激素受体β对雌激素诱导人成骨样细胞护骨素表达的影响
RNA干扰敲低人成骨样细胞株MG63中雌激素受体β后,RT-PCR法发现不同浓度的17β-雌二醇均能上调MG63细胞中的护骨素mRNA表达水平,其中以10-7 mol/L的作用强.而这种作用不能被G蛋白抑制剂suramin所抑制.提示雌激素受体β可能不涉及雌激素上调MG63细胞护骨素表达的调控作用.
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肿瘤坏死因子α对人成骨样细胞NF-κB和护骨素表达的调节
用肿瘤坏死因子α(TNF-α)干预培养的MG-63细胞(人成骨肉瘤来源).结果显示:TNF-α上调MG-63细胞核蛋白p65表达,下调护骨素(OPG)mRNA和蛋白质表达.吡咯二硫氨基甲酸酯不能阻止TNF-α下调MG-63细胞OPG的作用.
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尼尔雌醇对人成骨样MG63细胞护骨素和骨钙素基因表达的影响
目的研究尼尔雌醇对人成骨样MG63细胞护骨素(OPG)、骨钙素(BGP)基因表达的影响.方法 MG63细胞以不同浓度的尼尔雌醇及雌激素受体纯拮抗剂ICI 182780分别干预24 h、48 h及72 h,用半定量RT-PCR法检测OPG、BGP mRNA的表达量.结果尼尔雌醇可上调MG63细胞OPG mRNA的表达,并存在剂量依赖和饱和效应,其中以10-8 mol/L的作用强.而且OPG mRNA表达有时间依赖性,以48 h表达量为高.尼尔雌醇未显示对MG63细胞BGP mRNA表达的影响.结论尼尔雌醇上调MG63细胞OPG mRNA表达是其作为抗骨质疏松药物的重要机制.
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人护骨素-谷胱甘肽转硫酶融合蛋白基因的构建与表达
目的克隆人护骨素(OPG)成熟肽段编码区基因并研究在大肠杆菌中OPG-谷胱甘肽转硫酶(GST)的融合蛋白的表达.方法采用RT-PCR从人骨肉瘤细胞系MG63的总RNA中扩增OPG成熟肽段编码区cDNA,构建原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌后经0.1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后收集菌体蛋白,以SDS-PAGE电泳及Western印迹鉴定蛋白表达,应用谷胱甘肽-Sepharose 4B柱亲和层析纯化目的蛋白.结果获得人OPG成熟肽段编码区cDNA,转化菌株可表达人OPG-GST融合蛋白,蛋白表达量约为菌体总蛋白的15.5%.Western印迹表明在相对分子质量66 000处融合蛋白能与人OPG多克隆抗体特异性结合.经亲和层析后获得纯度为95.7%的OPG-GST融合蛋白.结论获得人OPG成熟肽段全长cDNA,在大肠杆菌中表达OPG-GST融合蛋白并以亲和层析法进行纯化.
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雌二醇对成骨细胞护骨素基因表达的影响
目的研究在MG-63细胞和成人成骨细胞培养的不同阶段,雌激素对护骨素(OPG)基因mRNA表达的影响,探讨雌激素对成骨细胞的作用机制.方法在细胞培养的不同时间,测定细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素(OC)含量和进行Van Gieson胶原染色,以确定细胞培养的增殖、成熟、矿化阶段,于成熟阶段用17β-雌二醇(E2)对培养细胞进行处理,用半定量RT-PCR技术测定雌二醇对成骨细胞OPG基因mRNA表达的影响.结果 ALP活性、骨钙素含量及胶原染色均表明,细胞培养汇片后12天达到成熟.正常成人髂骨分离的成骨细胞(HOB)及成骨肉瘤细胞株MG-63均能表达OPG,且表达量与培养的时程有关.培养12天时,两种细胞OPG基因mRNA表达均达高峰(P＜0.01).10-8 mol/L的E2能使MG-63细胞OPG基因mRNA的表达增加至基础值的10倍(P＜0.001),HOB的OPG基因mRNA表达增加至基础值的7～8倍(P＜0.01).结论 OPG在成骨细胞表达.雌激素使成骨细胞OPG基因mRNA表达的增加是雌激素缺乏导致骨质疏松的重要机制之一.
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脂联素调控人成骨细胞OPG/RANKL表达的信号转导机制
目的 研究脂联素调控人成骨细胞护骨素(OPG)和NF-кB受体活化凶子配体(RANKL)表达的作用机制.方法 人成骨细胞OPG和RANKL mRNA的表达以实时PCR检测,p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、c-Jun氨基端激酶(JNK)的磷酸化水平用Western印迹法检测.廊用小分子RNA干扰技术(siRNA)阻断脂联素受体(AdR)表达,并以p38 MAPK抑制剂(SB203580)和JNK抑制剂(SP600125)干预,以观察脂联素对人成骨细胞OPG/RANKL作用的调节机制.结果 用siRNA沉默AdRl的表达可消除脂联素促进人成骨细胞RANKL表达和抑制OPG表达的作用;脂联素干预前予SB203580阻断p38 MAPK后,也可消除脂联素对成骨细胞RANKL和OPG的作用,而SP600125并无作用.结论 在人成骨细胞中,脂联素通过AdR1/p38 MARK途径促进RANKL表达和抑制OPG的表达.
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17β-雌二醇对新生大鼠成骨细胞护骨素和破骨细胞分化因子表达的调节
体外培养成骨细胞,用不同浓度(10-11～10-6 mol/L)17β-雌二醇干预,RT-PCR测定护骨素、破骨细胞分化因子(ODF)mRNA的表达水平.雌二醇作用后,成骨细胞护骨素表达上调(P＜0.05),以10-8mol/L显著;ODF表达无明显变化.雌激素治疗骨质疏松症的作用可能与其在生理浓度时促进成骨细胞护骨素表达有关.
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女性护骨素基因启动子区G209A与T245G多态性和骨密度及骨转换的关系
研究护骨素基因启动子区G209A与T245G多态性和女性骨密度及骨转换生化指标的关系,结果显示G209A与T245G多态性和骨密度及骨转换生化指标无关.
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增龄及去卵巢对C57BL/6J小鼠护骨素表达的影响
目的 观察增龄和去卵巢状态下小鼠血清护骨素(OPG)水平和骨组织中OPG表达的变化.方法 4组C57BL/6J小鼠,每组15只:成年雄鼠组(6月龄),老年雄鼠组(20月龄);假手术雌鼠组和去卵巢雌鼠组鼠在9月龄时分别行假手术和卵巢切除术,手术6个月后处死小鼠.双能X线检测小鼠骨量变化,实时RT-PCR观察OPG mRNA表达水平,ELISA测定血清中OPG的蛋白水平.结果 老年组小鼠和去卵巢组小鼠骨密度明显下降.老年组雄性小鼠血清中OPG水平和成年组[(729±180)ng/L vs (565±131)ng/L]比较明显上升(P＜0.01).和假手术组比较(644±140)ng/L,去卵巢组小鼠OPG水平(908±338)ng/L也升高(P＜0.05).老年组雄鼠骨中OPG mRNA的表达拷贝数为成年组的43.75%(P＜0.05).与假手术比较,去卵巢组雌鼠骨中OPG mRNA的表达拷贝数下降了75%(P＜0.01).结论 增龄以及去卵巢状态下,小鼠血清中OPG以及骨中OPG mRNA表达水平均有明显变化.
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淫羊藿甙对大鼠成骨细胞护骨素、RANKL表达的影响
目的 观察淫羊藿甙对体外培养大鼠成骨细胞护骨素(OPG)、核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)mRNA表达的影响.方法 用酶消化法分离24h内新生SD大鼠颅盖骨成骨细胞,进行原代培养.在培养液中加入不同浓度的淫羊藿甙(10-10～10-4mol/L),培养48 h后,抽提总RNA,采用半定量RT-PCR法检测成骨细胞中OPG和RANKL mRNA表达的变化.结果 淫羊藿甙可明显促进成骨细胞OPG mRNA的表达,抑制RANKL mRNA的表达,且呈浓度依赖性,均以10-7mol/L时作用显著(P＜0.05).预先用淫羊藿甙干预成骨细胞,可逆转地塞米松的降低OPG mRNA(O.570±0.093 vs 1.083±0.081)、升高RANKL mRNA(1.079±0.050 vs 0.718±0.082)的作用(均P＜0.05).结论 淫羊藿甙可以上调OPG基因表达,下调RANKL基因表达,从而调节骨吸收,这可能是淫羊藿甙防治骨质疏松症的重要机制之一.
关键词： 淫羊藿甙 地塞米松 成骨细胞 护骨素 核因子-κB受体活化因子配体 -
诱骗受体和护骨素基因多态性与克罗恩病易感性和疾病表型的相关性
目的 探讨浙江籍汉族人群中诱骗受体1、诱骗受体2和护骨素基因多态性与CD易感性的关系.方法 纳入2008年4月至2017年7月于温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属第一医院、温州市中心医院和温州市人民医院消化内科确诊为CD的285例患者,另外纳入同期在温州医科大学附属第二医院进行体检的572名健康对照者.采用SNaPshot技术检测研究对象诱骗受体1(rs12549481)、诱骗受体2(rs1133782)和护骨素(rs3102735)3种单核苷酸多态性(SNP).在CD组和健康对照组之间,采用非条件logistic回归分析各SNP的突变等位基因和基因型频率差异,评价其与CD临床病理特征、糖皮质激素和英夫利西单克隆抗体疗效的关系.结果 CD组诱骗受体2(rs1133782)的突变等位基因A和基因型GA+ AA频率分别为11.93％(68/570)和22.81％(65/285),分别高于健康对照组的8.22％(94/1 144)和15.91％(91/572),差异均有统计学意义(OR=1.513,95％ CI 1.088～2.104,P=0.013;OR =1.562,95％ CI.094 ～2.230,P=0.014);两组间诱骗受体1(rs12549481)和护骨素(rs3102735)突变等位基因和基因型频率差异均无统计学意义(P均＞0.05).狭窄型CD患者诱骗受体1 (rs12549481)的突变等位基因C和基因型TC+ CC频率分别为13.89％(25/180)和27.78％(25/90),分别低于非狭窄非穿透型CD患者的27.68％ (62/224)和48.21％ (54/112),差异均有统计学意义(OR=0.421,95％CI0.252 ～0.705,P=0.001;OR=0.413,95％ CI0.229 ～ 0.747,P=0.003);穿透型CD患者诱骗受体2 (rs1133782)的突变等位基因A和基因型GA+ AA频率分别为7.23％ (12/166)和13.25％(11/83),分别低于非狭窄非穿透型CD患者的15.62％ (35/224)和30.36％ (34/112),差异均有统计学意义(OR=0.407,95％CI 0.205～0.809,P=0.009;OR=0.350,95％C1 0.165 ～0.743,P=0.005);CD不同疾病行为亚组之间,护骨素(rs3102735)的突变等位基因和基因型频率差异均无统计学意义(P均＞0.012 5).诱骗受体1 (rs12549481)、诱骗受体2(rs1133782)和护骨素(rs3102735)基因多态性与糖皮质激素和英夫利西单克隆抗体疗效均无关联(P均＞0.05).结论 诱骗受体1(rs12549481)基因突变可能与狭窄型CD相关.诱骗受体2 (rs1133782)基因突变可能与CD尤其是穿透型CD相关.护骨素(rs3102735)基因多态性与CD发病风险无关.上述基因SNP可能与糖皮质激素和英夫利西单克隆抗体疗效均无关.
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模拟乳腺癌骨转移微环境中CGRP对成骨细胞OPG和RANKL表达影响
目的:以乳腺癌细胞与成骨细胞共培养模拟乳腺癌骨转移微环境,观察在此微环境中降钙素基因相关肽( calcitonin gene-related peptide,CGRP)对成骨细胞护骨素 (osteoprotegerin,OPG)及细胞核因子êB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand, RANKL;又称破骨细胞分化因子)表达的影响.方法:将转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231或MDA-MB-435与成骨细胞MG63共培养,建立模拟乳腺癌骨转移微环境.行CGRP(1×108 mol/L)干预,应用RT-PCR和Western Blotting技术检测干预后OPG和RANKL在mRNA和蛋白水平表达的变化.结果:MG63与MDA-MB-231或MDA-MB-435共培养环境中,RANKL mRNA及蛋白水平升高,而OPG mRNA和蛋白水平表达下降;CGRP处理后,共培养环境中RANKL mRNA及蛋白水平降低,OPG mRNA和蛋白水平升高 (均P<0.05).结论:乳腺癌细胞能调节成骨细胞OPG/RANKL轴的表达,进而可能促进破骨细胞的活性,造成溶骨性破坏;CGRP 干预可逆转此调节作用,在乳腺癌骨转移的治疗中有潜在应用价值.
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兔关节盘前移位后髁突软骨细胞中OPG和OPGL的表达及意义
目的:探讨关节盘前移位后髁突软骨中护骨素(osteoprotegerin,OPG)及其配体(osteoprotegerin ligand,OPGL)表达的变化及意义.方法:20只日本大耳白兔,16只用弹力丝牵引关节盘前伸部,建立颞下颌关节盘前移位的动物模型,分别于术后1、2、4、8周处死.2只行模拟手术作为手术对照组,术后2周处死;另2只不行手术,作为空白对照.取颞下颌关节标本,HE染色,观察其镜下结构,SP免疫组化法检测髁突软骨中OPG和OPGL的表达与分布,并对各标本OPG和OPGL的表达进行灰度测定.用单因素方差分析法对所得数据进行统计学分析.结果:各实验组动物术后体重无明显减轻,伤口愈合良好,大体及显微镜下观察,关节盘明显前移位.OPG和OPGL在各组髁突软骨的增殖层及肥大层浅层均有表达,其中关节盘移位组OPG、OPGL染色较强,染色灰度值与对照组均有显著性差异(P＜0.05),但OPG/OPGL比率基本稳定.结论:关节盘移位后OPG和OPGL的表达均有升高,可能参与关节盘移位后髁突软骨病变的发展及转归.
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核因子кB受体活化因子配体、护骨素在不同年龄男性下颌骨的表达
目的:观察核因子кB受体活化因子配体(RANKL)、护骨素(OPG)在不同年龄男性下颌骨的表达.探讨RANKL、OPG与男性牙槽骨骨质疏松的关系.方法:选取湘雅医院2008年5月-2009年7月口腔门诊拔牙去骨及病房正颌外科手术男性患者46例.排除牙周病、影响骨代谢的全身系统性疾病及药物服用史,无抽烟、酗酒等不良生活习惯.分为3组,其中青少年组10～29岁,17例,中年组30～59岁,15例,老年组60～89岁,14例.采用RT-PCR方法,观察下颌骨RANKL、OPG的表达.采用SPSS16.0软件包对数据进行总体方差分析和组间比较.结果:①与青少年组相比,中年组和老年组RANKL mRNA分别升高2.1倍和5.3倍,OPG mRNA分别升高3.3倍和4.8倍,差异具有显著性(P<0.05).RANKL和OPG值与年龄呈正相关.②中年组RANKL/OPG比值低于青少年组和老年组,差异无显著性(P>0.05).结论:①男性下颌骨RANKL mRNA和OPG mRNA水平随年龄增长而升高,RANKL和OPG值与年龄呈正相关.②中年组颌骨改建活跃,与青少年组相比,骨形成大于骨吸收;③老年组颌骨吸收与骨形成均处于低水平,骨吸收大于骨形成.
关键词： 下颌骨 男性 护骨素 细胞核因子кB受体活化因子配体 -
葡萄糖对MG63细胞株护骨素、护骨素配体及其相关因子表达的影响
目的:观察不同葡萄糖浓度对人成骨肉瘤MG63细胞株护骨素(OPG)、护骨素配体(OPGL)及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、转化生长因子-β(TGF-β)表达的影响.方法:MG63细胞经不同浓度(5.5、16.7、33.3 mmol/L)葡萄糖处理后,用RT-PCR法检测上述基因表达情况.结果:高糖能下调MG63细胞中OPG及TGF-β的表达(P＜0.05),上调OPGL、M-CSF和TRAIL的表达(P＜0.05). 结论:高糖环境可能导致成骨细胞中OPG及TGF-β的表达减少, OPGL、M-CSF和TRAIL等细胞因子的表达增多,使破骨细胞的数目和活性增加,骨吸收增强和骨量丢失,这可能是糖尿病骨质疏松症的一个重要的发病机制.
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上海地区汉族人群护骨素基因G1181C多态性与冠状动脉性心脏病及其严重程度的相关性
目的 探讨护骨素基因G1181C位点单核苷酸多态性(SNPs)与冠状动脉性心脏病(CAD)及其严重程度的相关性.方法 368例胸痛患者根据冠状动脉造影检查结果分为非CAD组(146名)和CAD组(222例).CAD组中单支、双支、三支、四支病变分别为72、59、77、14例.CAD组再根据病史分为急性冠状动脉综合征(ACS)组156例和稳定型CAD组66例.采用介质纯化法提取白细胞DNA,聚合酶链反应(PCR)扩增包含G1181C位点的DNA片段,连接酶检测反应(LDR)检测PCR产物,识别多态性位点.结果 非CAD组与CAD组间,非CAD组与ACS组间,ACS组与稳定型CAD组间,非CAD组与不同病变冠状动脉数量组间,护骨素基因G1181C的各基因型频率和分布的差异均无统计学意义(P值均＞0.05).结论 研究中未发现护骨素基因G1181C位点SNPs多态性与CAD及其严重程度相关.
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血液透析患者血清护骨素、胎球蛋白A与心血管病变关系的研究进展
心血管疾病发病率和死亡率在血液透析患者中仍然很高,其发生与过多的骨钙化在血管调节中的变化相关,护骨素作为肿瘤坏死因子受体超家族的一员,具有抗破骨细胞作用,是一个重要的血管钙化调节因子.在血液透析患者中,高水平的护骨素与血管钙化及心血管疾病的病死率密切相关.胎球蛋白A是磷酸钙的一种有效的系统性抑制剂,可防止钙磷沉积,在血液透析患者中,其水平和普遍性与严重的血管钙化相关.护骨素及胎球蛋白A可作为标记物,在长期血液透析患者中,与其全因死亡率和心血管疾病死亡率相关.
