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苦参碱改构体X对人鼻咽癌CNE1细胞的凋亡诱导作用
目的:探讨苦参碱改构体X体外诱导人鼻咽癌CNE1细胞凋亡的作用与机制.方法:用0,29,58,116,232,464μmol·L-1不同剂量改构体X处理对数生长期CNE1细胞48 h,采用MTT法检测苦参碱改构体X对CNE1细胞增殖的抑制作用,使用流式细胞仪检测改构体X对CNE1凋亡率和细胞周期的影响,Western blot法检测改构体X对CNE1细胞内Bcl-2、Bax及p53等凋亡过程中相关蛋白表达的影响.结果:苦参碱改构体X作用CNE1 48 h后,MTT结果显示,改构体X对CNE1细胞增殖有抑制作用并具有浓度依赖性;流式细胞仪分析结果显示,改构体X 58,116 μmol· L-1浓度组细胞凋亡率高出苦参碱组70.02％,75.73％,高于阴性对照组(P＜0.05,P＜0.01);细胞周期测定结果显示改构体X各剂量组均可不同程度地将CNE1细胞周期抑制在G1期,与阴性对照组相比具差异显著性(P＜0.05,P＜0.01);Western blot检测表明,苦参碱改构体X作用CNE1 48 h后,凋亡相关蛋白Bcl-2降低,Bax,p53增加,与阴性对照组相比有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).结论:苦参碱改构体X在体外可诱导CNE1细胞凋亡,其促凋亡机制可能与阻滞细胞周期、增加促凋亡蛋白Bax和p53表达并降低抑制凋亡蛋白Bcl-2表达有关.
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ZnPcH_1-PDT对鼻咽癌CNE1细胞杀伤作用的实验研究
目的 探讨新型酞菁类光敏剂锌酞菁H_1(ZnPcH_1)介导的光动力疗法(ZnPcH_1-PDT)对鼻咽癌CNE1细胞的杀伤作用.方法 采用人鼻咽癌CNE1细胞作为研究对象,应用MTF比色法和细胞集落形成实验检测PDT对CNE1细胞增殖的影响,采用AO/EB荧光染色法、TUNEL、DNA倍体分析检测细胞的死亡方式.结果 MTT比色法及细胞集落形成实验结果显示,ZnPcH_1-PDT可抑制鼻咽癌CNE1细胞增殖抑制率,并随ZnPcH_1的增加而增高(P<0.05);AO/EB荧光染色法、TUNNEL、DNA倍体分析结果均表明ZnPcH_1-PDT能够诱导CNE1细胞凋亡,凋亡率呈时间依赖性.结论 ZnPcH_1-PDT能够有效地抑制鼻咽癌CNE1细胞增殖,诱导该细胞凋亡,拥有良好的应用前景.
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X射线照射对MRE11在鼻咽癌细胞株 CNE1中表达的影响
目的：研究X射线照射后肿瘤细胞中MRE11基因及其蛋白表达的规律，并探讨其与肿瘤放疗失败的相关性，为提高肿瘤放射治疗疗效开辟新途径，提供新的靶点。方法选取人鼻咽癌CNE1细胞株进行体外培养及X线照射。按单次照射0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy剂量分组，照射后4 h收集，利用RT-PCR技术检测MRE11mRNA的表达；CNE1细胞株单次照射4 Gy于0 h、1.5 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h时间点收集固定，利用免疫荧光技术检测MRE11蛋白的表达，并采用Image-Pro Plus 5.0软件分析测定各组荧光的平均光密度值（mOD）。结果RT-PCR检测CNE1细胞株分别经0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy X线照射后4 h，各组之间MRE11 mRNA表达无统计学差异。免疫荧光技术检测CNE1细胞株经4 Gy X线照射后0 h、1.5 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h时间点MRE11蛋白的表达，荧光强度先增强后减弱，4 h荧光强度强。结论CNE1细胞株MRE11 mRNA的表达与X线照射剂量递增无相关性。但CNE1细胞株经X线照射后MRE11蛋白的表达随时间的延长先增强后减弱，且在照射4 h表达强，24 h后恢复到未照射水平。
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高剂量X射线对人鼻咽鳞癌CNE1细胞株HIF-1α表达影响的研究
目的:探讨高剂量X射线照射前后低氧诱导因子1α(HIF-1α)在人鼻咽鳞癌CNE1细胞株中的表达情况.方法:体外培养人鼻咽鳞癌CNE1细胞株,待细胞进入对数生长期后行6 MVX射线照射,照射方法为2 Gy/次,隔日1次,共25次,累积剂量50 Gy,收集照射前后细胞采用免疫荧光染色、RT-PCR和蛋白质印迹法检测高剂量X线照射前后CNE1细胞株中HIF-1α基因及其蛋白的表达.结果:照射前后HIF-1α基因的表达的半定量值分别为0.23±0.02和0.37±0.04,t=-5.422,P=0.006；其蛋白的表达的半定量值分别为0.05±0.01和0.08±0.01,t=-3.674,P=0.021;X线照射50 Gy后HIF 1α在CNE1细胞中的表达比照前明显增高,P＜0.05；共聚焦显微镜观察到X线照射50 Gy后的CNE1细胞中绿色荧光强度高于照射前.结论:X射线照射可以引起HIF-1α在CNE1细胞中表达升高.
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绿色荧光蛋白报道基因转染鼻咽癌细胞系CNE1后的表达:用做转染报道基因的可行性鉴定
目的:将经过"人类化"改造的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因质粒导入鼻咽癌CNE1细胞系内,观察GFP报道基因转染鼻咽癌细胞系CNE1后的表达情况.方法:实验于2004-07/2007-07在广东医学院病理学实验室完成.将带有GFP报道基因的质粒PAT-GFP及PAT-GFP-LMP1在电容960 μ F,280 V条件下电导转染到鼻咽癌CNE1细胞系中,用选择培养液(嘌呤霉素筛选)继续换液培养直至长出抗性细胞克隆,胰酶消化收集细胞.存488 nm光激发下,用荧光显微镜检测及流式细胞仪观察转染细胞在活的、固定后或裸鼠体内移植后3组细胞的GFP的表达情况并计算转染效率,并用免疫组化法及Western blot法观察插入目的基因LMP1的表达情况.结果:温度在28～32℃的条件下活细胞有GFP基因稳定而持续地表达,但表达较低,表达率为(16.20±1.70)%,且目的基因LMP1的插入明显影响GFP基因的表达,表达率为(3.48±0.28)%,而在固定后或裸小鼠体内移植后均无表达;目的基因LMP1则能稳定而持续地表达.结论:绿色荧光蛋白报道基因GFP在CNE1细胞系中能稳定而持续地表达,且不影响插入目的基因的表达,可用做转染报道基因.
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组蛋白H3Ser10磷酸化对人鼻咽癌细胞增殖和转化的调控作用
目的:探讨组蛋白H3第10位丝氨酸(serine 10,Ser10)磷酸化在调控鼻咽癌CNE1细胞增殖和恶性转化中的作用及可能的作用机制.方法:采用蛋白质印迹法检测表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)作用下鼻咽癌CNE1细胞中组蛋白H3Ser10磷酸化水平的改变;构建组蛋白H3野生型(H3WT)和突变型(H3S10A)真核表达质粒,转染CNE1细胞,采用杀稻瘟菌素筛选获得稳定过表达野生型或突变型组蛋白H3细胞株;蛋白质印迹法检测转染组蛋白H3野生型和突变型重组质粒后对CNE1细胞中组蛋白H3Ser10磷酸化水平的影响;采用CCK-8(cell counting kit-8)法和软琼脂集落形成实验检测过表达野生型和突变型组蛋白H3对CNE1细胞增殖和克隆形成能力的影响;分别采用蛋白质印迹法和双荧光素酶报告基因系统检测过表达野生型和突变型组蛋白H3对CNE1细胞中c-Jun、c-Fos和Bcl-2蛋白表达以及激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)转录活性的影响.结果:EGF可诱导CNE1细胞中组蛋白H3Ser10磷酸化水平的上调;成功构建了稳定过表达野生型和突变型组蛋白H3的CNE1细胞株,组蛋白H3Ser10位点的突变可明显抑制EGF作用下组蛋白H3的磷酸化水平;与转染空质粒细胞相比,过表达野生型组蛋白H3可促进EGF作用下CNE1细胞增殖和软琼脂克隆形成能力,并且上调c-Jun和c-Fos蛋白的表达以及提高AP-1的转录活性,但过表达突变型组蛋白H3则没有引起上述明显的改变.结论:组蛋白H3,尤其是组蛋白H3Ser10磷酸化,在调控EGF诱导的CNE1细胞增殖和恶性转化中具有重要作用,其机制与促进c-Jun和c-Fos基因的转录,进而增强AP-1的活性有关.
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苦参碱改构体X调控Caspase-3,Caspase-8和Caspase-9蛋白表达诱导人鼻咽癌CNE1凋亡的研究
目的 研究苦参碱改构体X体外诱导人鼻咽癌CNE1细胞凋亡的机制.方法 用不同剂量改构体X处理CNE1细胞48h,透射电镜观察CNE1细胞超微结构变化;Western blot检测改构体X对CNE1细胞内Caspase-3,-8,-9蛋白表达的影响.结果苦参碱改构体X作用CNE1 48 h后,细胞出现皱缩,核内异染色质明显增多,核周隙增大,凋亡小体形成等细胞凋亡特征形态,高剂量组较低剂量组细胞凋亡程度更加明显;Western blot检测显示,与阴性对照组相比,除低剂量改构体X对Caspase-8无上调作用外,其他剂量组可上调凋亡相关蛋白Caspase-3,-8,-9的表达(P<0.01),且具有剂量依赖性.结论 苦参碱改构体X可通过上调促凋亡蛋白Caspase-3,-8,-9的表达诱导CNE1细胞凋亡.
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ZnPcH1-PDT对CNE1细胞增殖抑制作用研究
目的 本文探讨新型酞菁类光敏剂ZnPcH1介导的光动力疗法(ZnPcH1-PDT)对鼻咽癌细胞的杀伤作用.方法 采用人鼻咽癌CNE1细胞作为研究对象.应用MTT比色法和细胞集落形成实验检测PDT对细胞的杀伤作用.结果 ZnPcH1-PDT对鼻咽癌CNE1细胞有杀伤作用,呈量效关系(P＜0.05).结论 ZnPcH1-PDT能够有效地抑制鼻咽癌细胞的增殖,且呈量效关系.
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EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌CNE1细胞增殖的影响
目的 探讨EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)对人高分化鼻咽癌CNE1细胞增殖的影响.方法 采用电穿孔基因转染技术.将带有绿色荧光蛋白GFP报道系统的EB病毒LMP1基因真核表达质粒导入CNE1,以载体质粒转染及CNE1细胞为对照组,用免疫组化检测LMP1蛋白的表达;用细胞体外增殖实验检测细胞OD比值;用裸小鼠成瘤实验观察移植瘤体积倍增时间和生长率.结果 内动物实验细胞移植后CNE1GL组潜伏期缩短,第7、8、9周时,其平均肿瘤体积生长显著高于对照组(P＜0.05);体外细胞增殖实验3组细胞OD比值差异无显著性(P＞0.05).结论 EBV-LMP1对CNE1细胞的体内增殖能力可能有促进作用.
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X线诱导人鼻咽鳞状细胞癌CNE1细胞株MDR-1及P-gp的表达研究
目的 检测X线照射前后鼻咽鳞状细胞癌CNE1细胞株中多药耐药基因(MDR)-1及P-糖蛋白(P-gp)的表达情况.方法 对CNE1细胞进行X线照射,在X线照射后、CNE1细胞培养24h后进行检测,半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测X线照射前后CNE1细胞中MDR-1 mRNA的表达;Western blotting检测X线照射前后CNE1细胞中P-gp的蛋白表达;共聚焦显微镜观察照射前后CNE1细胞中P-gp的蛋白表达情况.结果 RT-PCR检测结果显示,X线照射前后CNE1细胞中MDR-1mRNA的吸光度(A)值分别为0.17 ±0.01和0.34±0.03,差异具有统计学意义(t=16.541,P＜0.001).Western blotting检测结果显示,X线照射前后CNE1细胞中P-gp蛋白的A值分别为0.02±0.01和0.04±0.01,差异具有统计学意义(t=4.612,P=0.016).共聚焦显微镜观察X线照射后CNE1细胞中P-gp的蛋白表达绿色荧光强度高于照射前.结论 X线照射可引起CNE1细胞中MDR-1及P-gp表达的升高,提示X线照射可使鼻咽鳞状细胞癌CNE1细胞产生多药耐药性.
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CNE1、CNE2、C666-1和Hone-1细胞的放射生物学特性测定
目的:测定人鼻咽癌细胞CNE1、CNE2、Hone-1及C666-1的放射牛物学特征参数.方法:采用平板集落形成法测定CNE1、CNE2、Hone-1及C666-14种鼻咽癌细胞在0、1、2、3、 4、 6、8、10 Gy照射后的存活分数;通过单击-多靶模型和线性-二次模型分别拟合细胞存活曲线;并计算Do、Dq、N、α、β、α/β值及2 Gy照射时的存活分数(SF2)等放射生物学参数值.结果:4种细胞在2种数学模型拟合的细胞存活曲线差异均有统计学意义(P均<0.05);其参数Do、Dq、N、α、β、α/β和SF2分别在1.818～2.379、0.192～0.880、1.276～2.388、0.085～0.392、0.026～0.036、2.36～15.08和0.416～0.733.结论:较大的放射敏感性差异可能存在于不同甚至相同分化程度的鼻咽癌细胞之间,提示临床鼻咽癌放疗剂量的个体化需求.
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二烯丙基二硫诱导人鼻咽癌CNE1细胞凋亡
目的 探讨二烯丙基二硫(DADS)诱导人鼻咽癌CNEl细胞凋亡的生物学效应.方法 通过MTT法检测DADS对CNE1细胞生长的影响;用光学显微镜、流式细胞仪研究DADS诱导细胞凋亡的作用.免疫组织化学法检测细胞内Bcl-2、Bax蛋白的表达,Western blot法检测细胞内Caspase-3蛋白的表达.结果 DADS能抑制CNE1细胞的生长.DADS处理CNE1细胞后,细胞呈凋亡特征性改变.流式细胞分析显示DADS呈浓度依赖性诱导CNE1细胞凋亡.免疫组织化学结果表明DADS处理细胞后,Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达下降.随药物浓度的增加Caspase-3蛋白表达增强.结论 DADS具有诱导CNE1细胞凋亡的作用,其机制可能与Bcl-2/Bax下降,促进Caspase-3活化有关.
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鼻咽癌CNE1细胞微波吸收谱测量及其生物效应研究初步
电磁生物学是一门实验科学,主要通过实验方法的建立和实验数据的获得开展电磁生物效应的研究.本文进行鼻咽癌细胞系CNE1对微波辐照的吸收谱测量,搭建以HP83630扫频信号源,标量网络分析仪AV3617为主要器件的程控自动化测试系统,在此基础上设定了可重复操作的实验方法.通过实验发现:CNE1对扫频源微波的大功率吸收峰(即频率窗)出现在37.257 GHz附近,重复性良好;而且列连续微波辐照在几个峰值吸收频率点处均有明显时间窗效应.
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抑制ATM表达致鼻咽癌细胞CNE1辐射增敏的细胞周期阻滞研究
背景与目的:细胞周期调控是决定细胞辐射敏感性的决定性因素之一.共济失调毛细血管扩张症突变基因(ataxia-telangiectasia mutant, ATM)功能与细胞DNA损伤修复、细胞周期检查点调控密切相关.我们前期研究通过反义RNA抑制ATM基因表达可增加鼻咽癌细胞系CNE1辐射敏感性,本研究拟探讨其辐射增敏的细胞周期阻滞调控机制.方法:ATM反义组细胞CNE1/pDOR-atm及对照组细胞CNE1/pDOR经2 Gy、 5 Gy X线照射后不同时间点(1h、4h、8h、24h、48h)收获,应用流式细胞仪(flow cytometer, FCM)检测各细胞周期百分比及凋亡率.结果:两组细胞X线照射后均未出现明显G1期阻滞和细胞凋亡,但分别在照射后1h、4h、8h出现明显S期阻滞,24h、48h出现明显G2期阻滞,其中反义组S期细胞百分率总均数水平低于对照组(P<0.05),而G2/M期细胞百分率总均数水平高于对照组(P<0.05).结论:反义RNA抑制ATM表达致CNE1辐射增敏的细胞周期调控机制可能与减少S期细胞比例,增加G2/M期细胞比例有关,与G1期阻滞和细胞凋亡的调控无关.
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抑制ATM/PI3K功能区表达对鼻咽癌细胞CNE1辐射增敏的研究
背景与目的:共济失调毛细血管扩张症突变基因(ataxia-telangiectasia mutant,ATM)与细胞辐射敏感性密切相关,已有报道,ATM蛋白(ATM基因编码产物)表达抑制可引起多种恶性肿瘤细胞辐射敏感性的改变.本研究观察ATM/PI3K区反义RNA对鼻咽癌细胞系CNE1 ATM蛋白的抑制作用及辐射增敏作用.方法:构建含反义ATM/PI3K区序列逆转录病毒重组体pDOR-atm,经阳离子脂质体转染人CNE1细胞,并命名为CNE1/pDOR-atm.应用半定量RT-PCR法分析反义组和对照组细胞中ATM mRNA的水平,应用流式细胞仪检测表达ATM蛋白的阳性细胞百分率及平均荧光强度,应用集落形成实验及线性二次模型(linearquadratic model,L-Q模型)检测细胞辐射敏感性的变化.结果:在反义组细胞CNE1/pDOR-atm中ATM mRNA指数(mRNA index,RI)平均为0.23±0.02,在对照组细胞CNE1/pDOR中RI平均为0.51±0.03(P＜0.05).在反义组中ATM蛋白阳性细胞百分率平均为70.8%,ATM蛋白平均荧光强度为1.81±0.12;而对照组中分别为99.3%,4.51±0.18(P＜0.01),提示反义组细胞中ATM mRNA水平及蛋白表达抑制.反义组细胞α值为0.40 Gy-1,对照组为0.36 Gy-1,2 Gy辐射增敏比达3.0,提示反义组细胞辐射敏感性增加.结论:抑制CNE1细胞的ATM/PI3K区表达可以达到有效的辐射增敏目的.
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胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1表达对鼻咽癌细胞系C N E1发生发展的研究
目的 探讨胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBP-rP1)对鼻咽癌细胞系CNE1细胞的增殖、侵袭、迁移能力的影响.方法 构建2条特异性针对IGFBP-rP1基因的小干扰RNA(siRNA32、siRNA34)及其阴性对照siRNA,将CNE1细胞分为4个转染组:siRNA32组(siRNA32转染)、siRNA34组(siRNA34转染)、阴性对照组(阴性对照siRNA转染)、空白组(不做任何处理),分别培养24 h或48 h后检测相关指标.结果 siRNA32组和siRNA34组IGFBP-rP1 mRNA及蛋白表达水平显著低于阴性对照组和空白组(P<0.05);siRNA32组和siRNA34组CNE1细胞迁移数、穿过PVP-F膜的CNE1细胞数显著低于阴性对照组和空白组(P<0.05);培养24、48 h后,siRNA32组和siRNA34组CNE1细胞增殖OD值显著低于阴性对照组和空白组(P<0.05);培养48 h后,siRNA32组和siRNA34组G0/G1期、G2/M期细胞所占比例显著高于阴性对照组和空白组(P<0.05);siRN A32组和siRN A34组S期细胞所占比例显著低于阴性对照组和空白组(P<0.05).结论 抑制IGFBP-rP1表达能降低鼻咽癌CNE1细胞的增殖、侵袭、迁移能力,为临床治疗鼻咽癌提供一种新的思路.
关键词： 胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1 鼻咽癌 CNE1细胞 -
鼻咽癌细胞系CNE1和CNE2Z中EBV-LMP1的表达
目的:探讨人高分化鼻咽癌细胞系CNE1和人低分化鼻咽癌细胞系CNE2Z中EB病毒编码的LMP 1基因表达情况.方法:用免疫组化法及Western bolt法分别检测鼻咽癌细胞系CNE1和CNE2Z中LMP 1基因的表达情况.结果:免疫组化及Western bolt 法均显示,CNE2Z细胞中LMP 1呈强阳性表达,而CNE1细胞中LMP 1呈阴性表达.结论:人高分化鼻咽癌细胞系CNE1中没有LMP 1的表达而人低分化鼻咽癌细胞系CNE2Z中LMP 1呈阳性表达,鼻咽癌的恶性程度可能与LMP 1的表达有关.
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重组突变型IкBαcDNA对CNE1鼻咽癌细胞凋亡的诱导作用
目的:探讨突变型IкBα cDNA对CNE1鼻咽癌细胞凋亡的作用.方法:应用逆转录-聚合酶链式反应技术(RT-PCR)首先从CNE2鼻咽癌细胞中扩增突变型IкBα cDNA并将其克隆到pCLXSN逆转录病毒载体.然后,用脂质体介导的方法将含有该突变型IкBα cDNA的重组逆转录病毒载体转移到CNE1鼻咽癌细胞并用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞术分析转染细胞凋亡情况.结果:通过RT-PCR技术,从CNE2鼻咽癌细胞扩增到IкBα cDNA并成功将其克隆到pCLXSN载体.将该重组逆转录病毒载体转染CNE1细胞约48小时后,Annexin V阳性细胞数为66.67%,而仅转染空白pCLXSN载体的CNE1细胞,Annexin V阳性细胞数为4.1%.结论:突变型IкBα cDNA能够诱导CNE1鼻咽癌细胞凋亡的发生.
