华支睾吸虫病患者粪便虫卵核糖体DNA内转录间隔区序列分析

目的 通过PCR方法扩增华支睾吸虫病患者粪便虫卵核糖体DNA (ribosomal DNA,rDNA)内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列进行分析,探讨其用于华支睾吸虫感染检测的价值. 方法 提取2例华支睾吸虫患者粪便中的虫卵DNA作模板,以rDNA ITS基因片段为目的片段进行PCR扩增,对扩增片段进行测序分析. 结果 从2例患者粪便虫卵样本中均扩增出1 123 bp的条带,经序列比对确定患者粪便中的虫卵为华支睾吸虫卵.测序分析发现本研究的两个样本与中国黑龙江分离株(KF740425)相似性为100％. 结论 本研究从2例华支睾吸虫病患者粪便虫卵中成功扩增出rDNA ITS基因,为从分子生物学角度检测华支睾吸虫病提供了资料.

胆囊结石联合胆汁病理检查诊断华支睾吸虫感染

目的 探讨胆囊结石联合胆汁病理检查诊断胆囊结石患者合并华支睾吸虫感染的可行性.方法 采用粪便直接涂片、胆汁离心镜检和胆囊结石病理切片镜检等方法,检查350例胆囊结石患者的粪便、胆汁和结石标本中的华支睾吸虫虫卵,分析3种方法的检出率. 结果 粪便直接涂片法、胆汁离心镜检和胆囊结石病理切片镜检华支睾吸虫虫卵的检出率分别为29.4％ (103/350)、41.5％ (145/350)和44.2％(155/350).与胆汁离心镜检法相比,粪便直接涂片法检出率低(x2=11.05,P＜0.05),胆囊结石病理切片镜检的检出率差异无统计学意义(x2＝0.583,P＞ 0.05).胆汁、胆石联合检出率为67.7％ (237/350),明显高于其它方法(x2=48.77,P＜0.05). 结论 胆囊结石与胆汁联合病理检查虫卵可提高胆囊结石患者感染华支睾吸虫的诊断率.

三苯双脒对华支睾吸虫感染鼠的疗效及其对虫体超微结构的影响

目的 观察三苯双脒对感染华支睾吸虫仓鼠的疗效及其对华支睾吸虫成虫超微结构的影响. 方法 药效实验:99只仓鼠各感染30条华支睾吸虫囊蚴,分组后灌胃顿服给药治疗,观察各组疗效:1)59只仓鼠于感染后24 d随机分成7组,每组8～9只,分别为三苯双脒50.0、100.0和200.0 mg/kg组,吡喹酮100.0、200.0和300.0 mg/kg组以及对照组；2)40只仓鼠感染后24 d随机分成5组,每组8只,分别为三苯双脒12.5和25.0 mg/kg组,吡喹酮50.0和75.0 mg/kg组以及对照组.各组受治鼠于治疗后2周剖杀,收集胆道系统内的残留华支睾吸虫,计算各组的平均虫数和减虫率.超微结构观察实验:每只大鼠灌胃50条华支睾吸虫囊蚴6周后,分为治疗组和对照组:其中治疗组10只,经三苯双脒300.0mg/kg治疗后,分别于4、8、24、48和72h剖杀大鼠,从胆总管中检获华支睾吸虫；对照组10只,于相同时间点剖杀取虫.检获的华支睾吸虫经处理后,置于透射电镜下观察. 结果 三苯双脒12.5、25.0、50.0、100.0和200.0 mg/kg组的减虫率分别为50.0％、89.7％、95.7％、99.3％和100％,平均虫数与对照组相比差异均有统计学意义.吡喹酮50.0、75.0、100.0、200.0和300.0 mg/kg组的减虫率分别为53.1％、78.6％、81.5％、88.1％和100％.经三苯双脒作用后,大鼠体内华支睾吸虫成虫体壁皮层和皮层细胞内杆状颗粒、盘状颗粒和膜样小泡减少,皮层内线粒体出现空泡,皮层乳突破溃剥落,皮层细胞核变形,核膜消失. 结论 三苯双脒对华支睾吸虫感染鼠有较好疗效,且优于吡喹酮.三苯双脒可引起华支睾吸虫体壁皮层和皮层细胞亚结构破坏.

实时荧光PCR检测胆囊结石患者胆囊壁华支睾吸虫DNA的研究

目的 运用实时荧光PCR技术检测胆囊结石患者胆囊壁中的华支睾吸虫DNA,并评估其检测效价.方法 随机选取60例胆囊结石患者的胆囊壁、胆汁及胆石标本,运用实时荧光PCR技术对3种标本分别进行华支睾吸虫DNA检测,另取部分胆囊壁标本进行常规病理检查.结果 60例胆囊结石患者的胆囊壁、胆汁及胆石标本中,实时荧光PCR检测华支睾吸虫DNA阳性率分别为51.67％ (31/60)、56.67％(34/60)和60.00％ (36/60),3组标本相比差异无统计学意义(x2=0.857,P＞0.05).胆囊壁病理切片检查虫卵阳性率为8.33％(5/60),与以上3种方法相比,差异有统计学意义(x2=42.512,P＜0.01).结论 在胆囊结石患者胆囊壁组织中发现华支睾吸虫卵,实时荧光PCR能检测到华支睾吸虫DNA.

广西贵港市299例华支睾吸虫病流行病学分析

目的 了解贵港市华支睾吸虫病临床病例流行病学特点.方法 回顾性分析2009-2011年在贵港市疾病预防控制中心就诊的可疑华支睾吸虫病例.采集疑似华支睾吸虫病患者当天第一次粪便30 ～50 g,用水洗自然沉淀集卵法镜检虫卵,虫卵阳性确诊为华支睾吸虫病.用Stoll法计数克粪虫卯数(EPG),划分感染度.结果 3年共确诊299例.重度感染59例,中度感染144例,轻度感染96例.患者年龄7 ～ 80岁,其中,30～59岁年龄组病例占79.93％(239/299).男性占93.98％(281/299),个体职业者占30.10％(90/299),汉族占81.61％( 244/299),市区占64.88％ (194/299),农村占35.12％( 105/299),60％的乡镇有病例.有并发症或合并症148例,占49.50％.有食鱼生史占94.65％(283/299),从首次食鱼生至确诊时间,短20 d,长70年.结论 贵港市华支睾吸虫病患者以中青年男性为主,市区病例多于农村.

两种检测华支睾吸虫囊蚴方法的比较

目的 比较肌肉压片法和消化法检测野生淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的检出率.方法 从华支睾吸虫病重流行区广西横县旺天塘采集野生淡水鱼样本,分别采用肌肉压片法和消化法检测每尾鱼感染华支睾吸虫囊蚴情况.计算华支睾吸虫囊蚴的检出率,采用配对卡方检验对2种方法的检出率进行比较.结果 共检测了210尾鱼,总检出率为36.67％(77/210),其中肌肉压片法检出率为34.29％(72/210),消化法检出率为32.38％(68/210),差异无统计学意义(x2=0.64,P＞0.05).结论 两种方法检测野生淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的检出率差异无统计学意义.

广西梧州市人群华支睾吸虫感染情况调查

目的 了解梧州市华支睾吸虫感染情况,探讨华支睾吸虫病感染方式、途径等流行病学特征,为开展华支睾吸虫病防控提供科学依据.方法 根据梧州市地理方位、居民生活习惯选择万秀、长洲和蝶山三个城区作为调查点,用改良加藤氏厚涂片法粪检华支睾吸虫虫卵,阳性者计算克粪虫卵数( eggs per garm of faces,EPG).结果 共调查3 078人,华支睾吸虫平均感染率为4.48％.其中万秀区感染率为6.45％；长洲区感染率为4.23％；蝶山区感染率为2.79％.男性和女性的感染率分别是6.13％和2.74％.所有年龄组均有感染,以20～岁组至60～岁组较高,EPG1～999占90.57％.结论 梧州市是华支睾吸虫病轻度流行区,食鱼生是感染华支睾吸虫主要途径,应积极开展综合性防治工作.

华支睾吸虫富甘氨酸2a类抗原Cs4重组蛋白的免疫学特性与定位

目的 对华支睾吸虫富甘氨酸2a(glycine rich antigen 2a,GRA2a)类抗原Cs4重组蛋白(rCs4)进行免疫学特性分析,并对GKA2a类抗原进行组织定位.方法 使用蛋白质印迹(Western印迹)分析rCs4与华支睾吸虫病患者混合血清的免疫反应性,并分析GRA2a类抗原的分泌性.应用ELISA法检测rCs4免疫小鼠血清中抗rCs4特异性IgG水平,并动态检测华支睾吸虫感染兔0～44周的血清中抗rCs4特异性IgG水平.通过免疫荧光实验(immunofluorescence assay,IFA)对华支睾吸虫GRA2a类抗原进行组织定位.结果 纯化的rCsd可被华支睾吸虫病患者混合血清识别.rCs4单抗(mAb Cs4-31)与华支睾吸虫排泄分泌抗原和可溶性抗原在相对分子质量(Mr)26 000与55 000之间分别有13、15个反应条带,均呈阶梯状分布.ELISA检测rCs4免疫小鼠抗rCs4和ESA的IgG效价均达1:64 000,感染兔的抗rCs4特异性抗体平均水平自感染第4周开始上升,于第6周达到高峰,此后逐步递减,至第20周已呈较低水平.IFA检测发现GRA2a类抗原定位于华支睾吸虫成虫的表皮.结论 Cs4蛋白是华支睾吸虫在感染早期的分泌型蛋白,具较好的抗原性.GRA2a类抗原定位于华支睾吸虫成虫表皮.

PCR和实时荧光PCR法检测华支睾吸虫的比较研究

目的 利用PCR技术建立快速、灵敏、特异的检测华支睾吸虫的方法,并比较PCR和实时荧光PCR检测华支睾吸虫的灵敏性和特异性,探讨其在华支睾吸虫检测中的应用价值.方法 根据华支睾吸虫的特异性基因序列,设计了PCR引物及实时荧光PCR的特异性引物和探针,分别进行灵敏性和特异性实验.结果 设计的引物能够扩增华支睾吸虫DNA,而且探针的特异性很高.实时荧光PCR对华支睾吸虫的检测阈值为3 fg/μl,灵敏度比PCR高两个数量级.结论 PCR和实时荧光PCR检测华支睾吸虫的灵敏性和特异性均很高,操作简便,为华支睾吸虫的检测提供了有效的技术手段和方法.

华支睾吸虫成虫7 kDa蛋白的纯化及其特性

华支睾吸虫病免疫诊断及分子生物学研究进展

华支睾吸虫病是亚洲东部的一种感染人的寄生虫病,主要分布在中国、日本、韩国和越南北部.传统的病原学诊断方法存在着一些弊病,免疫诊断抗原的提纯以及免疫诊断方法的改进则提高了诊断的敏感性和特异性,为华支睾吸虫病的诊断提供了科学的辅助手段.本文对华支睾吸虫病的免疫诊断抗原、诊断方法以及在分子生物学方面的研究进展作一简要综述.

三苯双脒在大鼠血浆和胆汁中代谢动力学研究

目的 研究三苯双脒在大鼠血浆和胆汁中的药物代谢动力学. 方法 20只雄性SD大鼠随机分为对照组和给药组(每组10只).给药组大鼠经口灌胃三苯双脒(200 mg/kg):其中5只大鼠于给药后0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、24.0和36.0 h取眼眶血;另5只大鼠给药后,收集0.5～1.0、1.0～1.5、1.5 ～2.0、2.0～2.5、2.5～3.0、3.0～3.5、3.5 ～4.0、4.0 ～4.5、4.5 ～5.0、5.0～5.5、5.5 ～6.0、6.0 ～6.5、6.5～7.5、7.5～8.5、8.5 ～9.5、9.5～ 10.5 h的胆汁;对照组大鼠不给药,其中5只大鼠与给药组相同时间下同步取眼眶血,另5只大鼠与给药组相同时间下同步收集胆汁.优化高效液相色谱检测条件,测定大鼠血浆和胆汁中对-(1-二甲氨基乙亚氨基)苯胺(简称氨脒)的浓度,绘制血药浓度-时间曲线、胆汁药物浓度-时间曲线以及胆汁排泄速率和积累排泄量曲线. 结果 氨脒在血浆中的达峰时间(Tmax)为(0.9±0.2)h,血药峰浓度(Cmax)为(8.1±2.1) mg/L;氨脒在胆汁中的Tmax为(1.2±0.4)h,胆汁药物Cmax为(11.2±2.1) mg/L.大鼠给药后0.5～3.0 h的胆汁排泄速率快,11h内胆汁中氨脒的累积排泄量为(40.1±12.0) μg,氨脒累积排泄率为0.57‰.结论 三苯双脒代谢产物氨脒在大鼠胆汁中的平均浓度高于在血浆中的浓度,且滞留时间较长,有利于杀灭寄生于胆道中的华支睾吸虫.

华支睾吸虫钙结合蛋白Cs16的重组表达及血清诊断应用的初步评价

目的 以原核和真核表达系统克隆、表达华支睾吸虫含有EF手型结构域的钙结合蛋白(Cs16),纯化并初步评价其在华支睾吸虫病免疫诊断中的作用. 方法 以华支睾吸虫成虫cDNA为模板,PCR扩增含有EF手型结构域的Cs16基因,分别构建原核重组质粒pGEX-4T-1-Cs 16和真核重组质粒pPIC9K-Cs 16,将酶切和测序鉴定正确的重组质粒分别转入大肠埃希菌BL21和毕赤酵母GS115后,表达并纯化目的蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)验证其纯度及免疫原性.以华支睾吸虫重组蛋白Cs16为包被抗原,采用ELISA检测24例华支睾吸虫病患者血清中相应抗体的反应性及其与日本血吸虫病患者血清的交叉反应性. 结果 PCR扩增获得Cs16基因片段,大小为515 bp.构建的重组质粒pGEX-4T-1-Cs16和pPIC9K-Cs 16经酶切和测序鉴定正确.SDS-PAGE结果显示,2个重组质粒在大肠埃希菌BL21和毕赤酵母GS115中均为可溶性表达,重组蛋白Cs16相对分子质量约为16 000.Western blotting结果显示,2个重组蛋白能分别被抗GST抗体和抗His抗体特异性识别.ELISA检测结果显示,原核表达和真核表达重组蛋白Cs16的敏感性分别为70.8％ (17/24)和54.2％ (13/24),特异性分别为95.2％ (20/21)和100％ (21/21),差异均有统计学意义(P＜0.05).与日本血吸虫病患者血清的交叉反应为1/10. 结论 获得了原核和真核Cs 16重组抗原,其在华支睾吸虫病的诊断上具有潜在的应用价值.

华支睾吸虫病流行区胆石症患者胆囊结石类型及华支睾吸虫感染情况

目的 探讨华支睾吸虫病流行区胆石症患者胆囊结石类型与华支睾吸虫感染的关系. 方法 选取2009年5月至2012年10月在广州市南沙区第六人民医院普外科实施内镜微创取石保胆手术的胆石症患者598例.胆石样品以红外光谱法分析结石成分,判断结石类型.胆石研碎后用光镜检查华支睾吸虫虫卵,计算不同类型结石的虫卵检出率.比较不同类型的结石患者,以及碳酸钙类结石患者中华支睾吸虫虫卵阳性和阴性患者的临床特点和生化特征.选取部分虫卵阳性的碳酸钙类结石行扫描电镜观察. 结果 598例胆囊结石患者中,234例(39.1％)为胆固醇类结石,133例(22.2％)为胆色素类结石,112例(18.7％)为碳酸钙类结石,86例(14.4％)为混合类结石,33例(5.5％)为其他类结石.5类胆结石华支睾吸虫卵检出率分别为6.4％ (15/234)、44.3％ (59/133)、59.8％ (67/112)、36.0％ (31/86)和30.0％ (10/33).碳酸钙类结石的虫卵检出率高,胆固醇类结石的虫卵检出率低.碳酸钙类结石和混合类结石患者的血清CO2结合力高于胆固醇类结石患者(P＜0.05),碳酸钙类结石患者胆汁CO2结合力和pH值高于其他4组结石患者(P＜0.05).碳酸钙类结石患者中华支睾吸虫虫卵阳性者的血清CO2结合力、胆汁CQ结合力和pH值均高于虫卵阴性者(P＜0.05).光镜和扫描电镜观察均发现,碳酸钙类结石华支睾吸虫卵与碳酸钙结晶相互黏附.结论 碳酸钙类胆囊结石患者的华支睾吸虫感染率高于其他结石类型的患者.

华支睾吸虫排泄-分泌产物对小鼠巨噬细胞一氧化氮产生和核转录因子κB活化的影响

目的 研究华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)排泄-分泌产物(ESPs)对小鼠巨噬细胞系RAW264.7-氧化氮(NO)产生与核转录因子κB (NF-κB)活化的影响. 方法 用20 μg/ml华支睾吸虫ESPs水溶性浓缩物及其有机溶剂提取物(ESPs-ex)和0.1 μg/ml明尼苏达沙门氏杆菌脂多糖(LPS-SM)分别刺激RAW264.7细胞,未刺激对照组加入等量Hank,s平衡盐缓冲液(HBSS).实验同时用0.3 mmol/L诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)抑制剂SMT作为干预.细胞培养18h后,用Griess法检测各组细胞培养上清液NO2-浓度.将pNiFty2-SEAP质粒转染至4组刺激后RAW264.7细胞,培养18h后,检测培养上清液中可溶性胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的吸光度(A620值),倒置显微镜观察细胞内SEAP催化显色情况. 结果 经ESPs-ex和LPS-SM刺激后,细胞培养上清液中NO2-浓度分别为(14.30±1.62)和(14.10±2.17) μmol/L,均较未刺激对照组[(7.70±0.95) μmol/L]显著增加(P＜0.05);加入SMT后,两组NO2-浓度显著下降,分别为(8.97±0.81)和(4.96±1.36) μmol/L(均P＜0.05).经ESPs刺激后,上清液中NO2-浓度为(4.06±0.62) μmol/L,较未刺激对照组显著降低(P＜0.05);加入SMT后,NO2浓度为(3.99±0.87)μmol/L,无明显变化(P＞0.05).ESPs刺激后,上清液SEAP的A 620值为0.836±0.005,显著高于未刺激对照组(0.097±0.009)(P＜0.05);镜下可见细胞内出现广泛、强烈的蓝色显色反应.ESPs-ex和LPS刺激后,上清液SEAP的A620值分别为0.112±0.004和0.116±0.009,略高于未刺激对照组(P＞0.05);镜下见部分细胞内出现蓝色显色反应. 结论 华支睾吸虫ESPs能够促进RAW264.7细胞活化NF-κB,其水溶性浓缩物可抑制NO产生,ESPs-ex和LPS-SM可促进NO产生.

基于核糖体DNA ITS区和COX1基因鉴别华支睾吸虫囊蚴

目的 基于核糖体DNA ITS区和COX1基因,PCR鉴别鱼体内华支睾吸虫囊蚴. 方法 于2013年5月底采集广西横县某水库的麦穗鱼,用消化法从鱼肉组织中分离单个华支睾吸虫囊蚴及其他吸虫囊蚴;PCR检测华支睾吸虫核糖体DNA ITS区和COX1基因,并分析检测的灵敏性和特异性. 结果 分离到不同发育阶段的华支睾吸虫囊蚴并经PCR检测证实.用针对核糖体DNA ITS区和COX1基因的PCR均能检测到单个华支睾吸虫囊蚴DNA,其特异性扩增条带大小分别为437/549、156/249和195/166 bp.用核糖体DNA ITS1和ITS2区的通用引物和特异性引物扩增华支睾吸虫囊蚴DNA的阳性数之比分别为0.905和0.952.针对COX1基因的特异性扩增均检测到目标DNA,并且扩增条带较亮.用该方法对其他吸虫囊蚴检测的对比试验显示特异性引物均未出现任何非特异性扩增反应;用ITS区通用引物检测其他吸虫囊蚴则显示出严重的非特异性扩增反应. 结论 通过形态观察结合PCR法识别出了不同发育阶段的华支睾吸虫囊蚴.用华支睾吸虫核糖体DNA ITS区的特异性引物进行PCR检测的灵敏性和特异性均优于相应通用引物.针对COX1基因的特异性PCR检测的灵敏性和特异性与核糖体DNA ITS区的检测结果相当.

广东珠三角地区胆囊结石患者的华支睾吸虫感染情况及其胆汁成分分析

目的 分析广东珠三角地区胆囊结石患者的华支睾吸虫感染情况和胆汁成分. 方法 采集2011年6月至2012年11月广州市南沙区第六人民医院普外科诊断的406例胆囊结石患者的粪便、血液、胆汁和胆囊结石标本.粪样采用改良加藤厚涂片法(Kato-Katz法)检查有无华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)虫卵.血样采用胶体金免疫法检测华支睾吸虫抗体情况.胆汁离心后,取沉淀涂片,于显微镜下观察有无虫卵.胆囊结石采用研碎镜检法观察有无华支睾吸虫卵.取胆汁上清测定总钙(TCa)、离子钙(iCa)、HCO3-、Mg2+、pH、总胆红素(TBIL)、总胆汁酸(TBA)、总胆固醇(CHO)、谷氨酰转肽酶(GGT)和碱性磷酸酶(ALP)的含量. 结果 406例胆囊结石患者的华支睾吸虫感染率为52.2％(212/406),其中男性患者的华支睾吸虫感染阳性率为64.7％(130/201),高于女性患者(40.0％,82/205)(P＜0.05).胆汁上清检测结果显示,≤30岁的华支睾吸虫阳性患者胆汁中TBIL[(1458.0±681.0)μmol/L]、CHO[(4.1±1.3)mmol/L]和Mg2+含量[(4.8±1.8)mmol/L],31～40岁阳性患者的TCa[(3.0±1.3)mmol/L]、iCa[(1.5±0.7)mmol/L]、TBA[(114.6±54.5)mmol/L]、CHO[(5.1±1.7)mmol/L]、TBIL[(1396.0±615.0)μmol/L]、GGT[(1562.0±583.0)U/L]和ALP含量[(263.0±94.0)U/L]以及41～50岁阳性患者的CHO含量[(5.4±2.2)mmol/L]均低于对应阴性组[(2759.0±969.0)μmol/L,(7.5±2.5)和(7.5±2.2)mmol/L;(3.8±1.6)、(1.9±1.0)、(144.1±63.4)和(9.9±2.5)mmol/L,(1892.0±584.0)μmol/L,(2457.0±988.0)和(535.0±196.0)U/L;(7.9±2.3)mmol/L](P＜0.05);31～40岁阳性患者的HCO3-[(22.7±5.1)mmol/L]和pH(7.6±0.4)以及＞50岁的pH(7.6±0.4)均高于对应阴性组[(17.3±6.9)mmol/L和7.4±0.2,7.5±0.3](P＜0.05)；其余各年龄段阳性患者的胆汁成分与阴性组的差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 广东珠三角地区胆囊结石患者中华支睾吸虫感染率较高,且胆囊结石患者中,华支睾吸虫感染者与非感染者的胆汁成分有差别.

华支睾吸虫含串联重复序列的Cs22抗原蛋白的克隆及特征分析

目的 通过免疫学筛选华支睾吸虫成虫λ-ZAP cDNA表达文库和EST数据验证,寻找新的抗原基因,并对其免疫学特征进行初步鉴定.方法 使用华支睾吸虫病患者混合血清筛选获得阳性噬菌体克隆,测序后与EST数据进行比对,逆转录PCR (RT-PCR)获得Cs22全长基因序列.PCR跳跃技术获得重复序列次数为2和3次的cDNA片段,将含成熟肽和串联重复序列部分分别克隆至原核表达质粒pET28a(+)中,转化至宿主菌后,诱导表达获得重组蛋白rCs22-2r、rCs22-3r、rCs22M-2r和rCs22M-3r,使用组氨酸标签亲和纯化柱(Ni-NTA树脂)纯化.ELISA法鉴定重组蛋白rCs22-2r和rCs22-3r的免疫原性；检测35份华支睾吸虫虫卵粪检阳性的患者血清,15份日本血吸虫病、15份卫氏并殖吸虫病和13份猪囊尾蚴病的患者血清以及31份健康人血清,评价重组蛋白rCs22-2r和rCs22-3r的免疫学诊断价值.使用仅含串联重复多肽序列部分重组蛋白rCs22M-2r和rCs22M-3r,ELISA法分别检测华支睾吸虫病患者和健康人混合血清的特异性抗体,初步确定抗原决定簇位置. 结果 获得华支睾吸虫Cs22抗原基因的全长序列,其含有EQQDGDEEGMGGDGGRGKEKGKVEGEDGAGEQKEQA 36个氨基酸组成的串联重复多肽序列,共重复13次.生物信息学分析表明,Cs22蛋白为GPI锚定蛋白.ELISA结果显示,重组蛋白rCs22-2r和rCs22-3r具有一定的免疫原性；ELISA 检测血清特异性抗体结果显示,华支睾吸虫病患者血清和健康人血清的阳性率均分别为45.7％ (16/35)和3.2％(1/31),与日本血吸虫病和猪囊尾蚴病患者血清无交叉反应,与卫氏并殖吸虫病患者血清仅1份有交叉反应.ELISA 法检测重组蛋白rCs22M-2r和rCs22M-3r结果显示,两者能区分华支睾吸虫病患者血清与健康人血清. 结论 获得华支睾吸虫Cs22抗原基因全长序列,其重组抗原蛋白具有一定的免疫学诊断价值,抗原决定簇位于串联重复多肽.

华支睾吸虫PPMPⅠ型抗原重组Cs2蛋白免疫诊断价值的评价

目的 应用华支睾吸虫PPMPⅠ型抗原重组Cs2蛋白(rCs2)建立2种华支睾吸虫病免疫学检测方法,并进行初步评价.方法 以可溶性rCs2作为诊断抗原,建立间接ELISA检测方法,并研制胶体金免疫层析检测(GICA)动力流体型试条,检测血清中的特异性抗体.采用ELISA法和GICA试条共检测35例华支睾吸虫虫卵粪检阳性患者、15例日本血吸虫病患者、15例卫氏并殖吸虫病患者和13例猪囊尾蚴病患者的血清,以及33份健康人血清.为进一步评价诊断价值,8只新西兰兔各感染600个华支睾吸虫囊蚴,随机均分为感染组和治疗组,感染第56天,治疗组各兔给予吡喹酮治疗[150 mg/(kg·d)×2 d],用ELISA法和GICA法检测两组兔0~44周抗rCs2特异性抗体的消长.结果 ELISA法的敏感性为71.4%(25/35),特异性为93.4%(71/76),总符合率为86.5%(96/111),与日本血吸虫病、卫氏并殖吸虫病和猪囊尾蚴病患者血清的交叉反应阳性率分别为1/15、1/15和1/13.GICA试条检测法的敏感性为85.7%(30/35),特异性为92.1%(70/76),总符合率为90.1%(100/111).经ELISA检测,感染组兔自感染后第4周抗rCs2特异性抗体水平开始上升,于第6周达到高峰,随后快速下降,至第20周已呈较低水平;治疗组的特异性抗体消长趋势同感染组,同一时点的2组实验兔的抗体水平差异无统计学意义(P>0.05).GICA试条检测结果表明,2组兔血清均仅在4~16周检出阳性.结论 以PPMPⅠ型抗原rCs2建立的间接ELISA方法和GICA动力流体型试条对华支睾吸虫病具有较好的诊断价值.

7种抗蠕虫药物的体外抗华支睾吸虫作用

目的 观察吡喹酮、三苯双脒、左旋咪唑、蒿甲醚、青蒿琥酯、阿苯达唑和甲苯达唑体外对华支睾吸虫成虫的作用.方法 70只大鼠于感染华支睾吸虫囊蚴(50～100个/只)5～7周后解剖,从胆总管内采集华支睾吸虫成虫,亨氏盐平衡溶液培养.取24孔培养板,每孔放置华支睾吸虫3～4条,加入不同浓度的上述药物,于药物处理后1、4、24、48和72 h,在倒置显微镜下观察成虫的活动和形态变化.结果 吡喹酮可迅速减弱华支睾吸虫的活动,使口吸盘丧失吸附皿壁能力,虫体蜷缩、皮层出现空泡.吡喹酮对华支睾吸虫的低致死浓度为0.1g/ml.三苯双脒0.5、1和10g/ml组虫体接触药物后迅速麻痹伸直呈松弛状.三苯双脒对华支睾吸虫的低致死浓度为0.05 g/ml.左旋咪唑10和20g/ml组华支睾吸虫的活动经药物作用后逐渐减弱,虫体松弛,但48 h后,大部分虫体和口吸盘明显恢复活动.左旋咪唑的浓度高达50g/ml时,虫体立即伸直麻痹,其表现与三苯双脒组相仿.蒿甲醚和青蒿琥酯10g/ml和50g/ml组虫体和口吸盘的活动减弱,虫体收缩,继则松弛,体表出现空泡,培养72 h后两组均有半数以上虫体死亡.阿苯达唑和甲苯达唑10g/ml和50 g/ml组华支睾吸虫除口吸盘在培养的24 h内呈兴奋的伸缩活动外,未见其他变化,培养72 h内无虫死亡.结论 吡喹酮和三苯双脒对体外培养的华支睾吸虫具有很强的杀死作用;左旋咪唑对华支睾吸虫低致死浓度为三苯双脒的50倍;较高浓度的蒿甲醚和青蒿琥酯有较缓慢抑制虫体活动的作用,并可杀死部分成虫;较高浓度的阿苯达唑和甲苯达唑无杀虫作用,仅见口吸盘兴奋.