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脂肪来源干细胞膜片与支持材料结合能力的初步探讨
目的:探讨大鼠脂肪来源干细胞体外构建细胞膜片方法,并分析其同牙本质磨片和CBB(ceramic bovinebone,CBB)颗粒的结合能力和增殖影响.方法:从出生7d大鼠体内提取脂肪组织并获得纯化的脂肪来源干细胞(ADSCs,adipose-derived mesenchymal stem cell),采用四唑盐(MTT)比色法检测ADSCs增殖能力的变化;AD-SCs经多向诱导分化后检测其向成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞分化能力;ADSCs体外构建细胞膜片后,电镜下观察ADSCs膜片与CBB颗粒和牙本质磨片的结合能力,MTT比色法检测ADSCs和ADSCs膜片在材料上的增殖能力.结果:纯化的ADSCs具有良好的增殖能力,经体外诱导培养后向成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞分化,电镜结果表明ADSCs膜片与牙本质磨片结合能力优于CBB颗粒,ADSCs膜片在牙本质磨片上的增殖能力优于CBB颗粒.结论:体外培养的大鼠脂肪来源干细胞具有种子细胞的特性,体外构建细胞膜片后与牙本质磨片的结合能力和增殖能力高于CBB颗粒,为细胞膜片治疗牙周缺损奠定基础.
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脂肪来源干细胞分化潜能的现状研究
与骨髓间充质干细胞一样,来源于中胚层的脂肪,亦具有多向分化潜能,其内含有大量能自我更新和向多系分化潜能的细胞群称为脂肪来源干细胞.其取材方便,来源丰富,可在体外稳定增殖传代.并与骨髓间充质干细胞有相似的多向分化表面标志CD105、STRO-1以及CD166受体.研究发现它具有向多系分化潜能,除可以分化为间充质来源的脂肪、骨、软骨、脂肪以及骨骼肌、心肌等细胞,在特殊的环境条件诱导下,可向神经细胞分化,用以修复骨、软骨、心肌、骨骼肌、血管以及神经等组织.因而,脂肪来源干细胞有望成为组织工程、细胞治疗以及基因转染良好的种子细胞.
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脂肪来源干细胞对辐射胸腺损伤中cyclin-D1和p53基因mRNA转录水平的影响
目的 分析脂肪来源干细胞(ADSCs)干预后辐射诱发胸腺损伤修复后的胸腺细胞周期蛋白D1、p53基因的表达.方法 C57BL/6小鼠随机分为:对照组、照射组、照射+ADSCs组和假照射+ADSCs组8只.照射组为辐射诱发胸腺淋巴瘤动物模型组,照射+ADSCs组为尾静脉注射EGFP质粒转染ADSCs.检测胸腺细胞凋亡和细胞周期.结果 在ADSCs注射后第7天,照射组小鼠胸腺G1期细胞的百分比较对照组明显降低(P＜0.05),而照射+ADSCs组小鼠胸腺G1期细胞的百分比较照射组明显增多;cyclinD1基因在ADSCs治疗组胸腺组织中的相对表达量较照射组增高,且差异有统计学意义(P＜0.01);而p53基因在照射组胸腺组织中的相对表达量较ADSCs治疗组增高,且差异有统计学意义(P＜0.05).结论 ADSCs可能通过p53、cyclinD1等基因的表达水平变化来调控细胞周期,形成细胞G1期阻滞,抑制肿瘤的形成.
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脂肪来源干细胞免疫原性和免疫调节作用的实验研究
目的 探讨脂肪来源干细胞(ADSCs)在体外的免疫原性,以及ADSCs在家兔同种异体皮片移植中的免疫调节作用.方法 将家兔淋巴细胞分别与自体和异体ADSCs混合培养48h后加入CCK-8试剂,并用酶标仪检测OD值;在家兔同种异体移植皮片下注射自体ADSCs,观察移植皮片的坏死时间,并于术后第7日切取移植皮片的周边组织进行组织学观察.结果 家兔淋巴细胞与自体、异体ADSCs混合培养后用酶标仪检测OD值分别为(1.527±0.402)和(1.615±0.351),两组OD值差异无统计学意义;家兔同种异体移植皮片下注射ADSCs的移植皮片的坏死时间为(7.170±1.472)d,未注射ADSCs的对照组移植皮片的坏死时间为(5.830±1.169)d,两组皮片坏死时间差异具有统计学意义:术后第7日组织学观察见实验组皮下浸润的炎症细胞较少,皮下组织结构完整、清晰;对照组皮下浸润的炎症细胞较多.结论 脂肪来源干细胞在体外的免疫原性低,对家兔同种异体皮片移植有免疫调节作用.
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脂肪组织来源干细胞恶性转化为恶性纤维组织细胞瘤
目的:探讨脂肪组织来源干细胞(ASCs)体外恶性转化及转化的细胞体内病理特征.方法:从Balb/C小鼠脂肪组织培养出ASCs,用3-甲基胆蒽(MCA)培养基处理第二代ASCs 1周,使其发生恶性转化,将转化的ASCs注入裸鼠皮下,肿瘤长出后取出肿瘤组织进行病理学检测.结果:经MCA处理1周后的ASCs,6个月后发生恶性转化,细胞成瘤后提示为恶性纤维组织细胞瘤(MFH).结论:MFH的发生可能来源于ASCs的恶性转化.
关键词： 门恶性纤维组织细胞瘤 脂肪来源干细胞 恶性转化 肉瘤 -
脂肪来源干细胞对cyclin-D1、c-myc、p53、ATM和γ-H2AX蛋白在辐射诱发胸腺损伤修复中的影响
目的:明确脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)在辐射诱发的C57小鼠胸腺瘤的形成过程中是否通过增强DNA损伤修复功能进而影响辐射诱导胸腺瘤的形成.方法:清洁级C57BL/6小鼠32只,随机分为4组:对照组8只,仅以假照射;照射组8只,采用深部X射线治疗机照射;照射+ ADSCs组8只,收集转染EGFP表达质粒48 h后的ADSCs,将ADSCs的浓度调整为2.0×106个/mL,取0.5 mL经尾静脉注射入末次照射后第1天的胸腺瘤模型小鼠;假照射+ADSCs组8只,ADSCs的注射方法同照射+ADSCs组.末次照射第7天后分别处死4组小鼠,各组小鼠胸腺组织中的细胞周期蛋白D1 (cyclin-D1)、p53、c-myc、毛细血管共济失调突变期(ATM)和γ-H2AX蛋白水平采用Western blot进行检测.结果:照射组小鼠胸腺组织中ATM、γ-H2AX、cyclin-D1和c-myc水平高于照射+ADSCs组小鼠胸腺组织,而p53水平低于照射+ADSCs组小鼠胸腺组织,且差异有统计学意义(P＜0.05).通过流式细胞术检测,照射组小鼠胸腺G1期细胞的百分比相比于对照组明显降低(P＜0.05),而照射+ADSCs组小鼠胸腺G1细胞的百分比较照射组增多.结论:ADSCs可能通过减轻DNA损伤程度,减少p53和c-myc蛋白的表达,使细胞G1期增加,并阻滞在G1期,修复胸腺细胞的DNA,抑制肿瘤的形成.
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ADSCs抑制辐射诱生胸腺瘤的作用分析
目的:探讨脂肪来源干细胞(ADSCs)对辐射诱导形成胸腺瘤的影响.方法:清洁级C57BL/6小鼠160只随机分为4组:假照射组、照射组、照射+ ADSCs组、假照射+ADSCs组,各40只,末次照射后第1、3、7、14天后分别处死4组小鼠,荧光显微镜下观察ADSCs在胸腺瘤组织中的定位;末次照射第1、7、14、21、28天及6个月后分别处死4组小鼠,石蜡包埋HE染色观察胸腺组织的病理变化,并行免疫组化分析.结果:照射组小鼠胸腺瘤的发生率(75％,12/16)明显高于ADSCs注射组(20％,3/15)(P＜0.05).在X线照射后第7天和6个月后,照射组和照射+ ADSCs组胸腺组织中CD31染色阳性的血管管状结构及增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞数较假照射组和假照射+ADSCs组明显增多,并且照射+ADSCs组小鼠胸腺组织的PCNA阳性细胞数相对于照射组小鼠胸腺组织较低(P＜0.05).结论:本实验成功建立辐射诱发的小鼠胸腺瘤模型.ADSCs具有保护胸腺辐射损伤,抑制辐射诱发胸腺瘤的作用.
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ADSCs对辐射诱发C57小鼠胸腺瘤免疫功能的影响及其机制
目的:观察脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)对辐射诱发小鼠胸腺瘤免疫功能的影响及其可能的机制,方法:清洁级C57BL/6小鼠32只,随机分为4组:对照组、照射组、照射+ADSCs组、假照射+ADSCs组,各8只,末次照射后第7天后分别处死4组小鼠,计算小鼠胸腺指数.刀豆素A(ConA)诱导的胸腺淋巴细胞转化率采用MTY法测定,运用流式细胞仪检测胸腺淋巴细胞的细胞周期以及T淋巴细胞亚群的变化.结果:照射+ ADSCs组相对于照射组小鼠的胸腺淋巴细胞转化率和胸腺指数显著增高(P＜0.05),并且CD4+T淋巴细胞的含量显著增加(P＜0.05),CD8+T淋巴细胞明显下降(P＜0.05),CD4+/CD8+T淋巴细胞比值显著升高(P＜0.05).结论:ADSCs可能通过调节小鼠胸腺内细胞水平的变化,保护小鼠胸腺细胞的免疫功能.
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补阳还五汤联合脂肪来源干细胞移植对脑缺血大鼠神经功能的影响
目的 探讨补阳还五汤联合脂肪来源干细胞(ADSCs)移植对脑缺血损伤大鼠的神经保护作用.方法 采用线栓法制备大鼠脑缺血模型,大鼠随机分为假手术组、模型组、ADSCs移植组(移植组)、补阳还五汤联合ADSCs移植组(联合组).各组又分7、14、21d 3个时间点的亚组,观察各组大鼠不同时间点的神经功能评分、脑梗死面积及脑组织病理形态学变化.结果 与模型组比较,移植组、联合组大鼠造模后14、21d神经功能评分均显著降低(P＜ 0.05或P＜ 0.01),且联合组大鼠21d神经功能评分明显优于移植组(P＜0.05);各时间点移植组与联合组大鼠脑梗死面积明显小于同时相的模型组(P＜0.01),且14、21 d联合组优于移植组(P＜0.05);造模后HE染色显示模型组大鼠脑组织缺血周边神经元数量减少,细胞明显水肿,治疗后脑组织损伤明显减轻,联合组的病理损伤轻.结论 补阳还五汤联合ADSCs移植能减轻脑缺血后神经功能损伤,具有脑保护作用.
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脂肪源性神经干细胞诱导分化为γ-氨基丁酸能神经元的体外研究
目的 探讨诱导脂肪源性神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化为GABA能神经元的体外培养方法,为细胞移植修复神经系统损伤提供种子细胞.方法 贴壁培养C57BL/6小鼠(附睾脂肪垫)脂肪来源的干细胞(adiposederived stem cells,ADSCs),流式细胞仪进行表型鉴定(CD45、CD9O、CD105)及标志物纤连蛋白(fibronectin)鉴定后,在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、2％ B27的Neurobasal培养基中诱导成NSCs.用免疫荧光细胞染色法进行NSC特异性标记物Nestin、增殖能力BrdU检测,再次添加脑源性神经营养因子、骨形成蛋白2后,维甲酸(RA)诱导分化为γ-氨基丁酸能神经元,并进行其标志物GABA的检测.结果 分离纯化的ADSCs CD90、CD105表达强阳性,CD45表达阴性；诱导后的干细胞球经Nestin及BrdU鉴定为NSCs,且具有较强的增殖能力；神经干细胞诱导分化后的神经元GABA抗体染色呈阳性.结论 在特定神经营养因子作用下,ADSCs在体外诱导生成的NSCs可被诱导分化为GABA能神经元.
关键词： 脂肪来源干细胞 神经干细胞 γ-氨基丁酸能神经元 -
脂肪来源干细胞体外成骨诱导和成脂诱导分化
目的 探讨脂肪组织来源的多能干细胞(adipose tissue-derived stromal ceHs,ADSCs)的多向分化潜能.方法 取小香猪腹部皮下脂肪组织,通过Ⅰ型胶原酶消化、离心等步骤分离培养ADSCs,经过原代培养和传代培养.分别加入成骨诱导剂和成脂诱导培养.经过倒置显微镜观察诱导后细胞形态变化,并通过Gomori改良钙钴法、yon Kossa染色和油红O染色对其成骨细胞和脂肪细胞表型进行鉴定,进一步比较细胞的转化率.结果 ADSCs呈成纤维细胞样贴壁生长,其经成骨、成脂诱导培养2周后形态、体积发生明显改变.Gomori改良钙钴法染色显示其细胞质内富含碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)颗粒,诱导后15 d和19 d,ALP阳性细胞分别为(25.0±7.5)%和(49.7±6.9)%,von Kossa染色表明聚集的细胞团中央能形成钙化结节;倒置显微镜,成脂诱导3、7、14 d后脂肪细胞转化率分别为(22.3±12.5)%、(49.6±7.1)%和(89.4±9.3)%.油红O染色可见细胞质内出现橙红色脂滴,14 d油红O染色阳性率高达(92.5±9.1)%.结论 ADSCs经体外诱导培养后可向成骨细胞和脂肪细胞分化,并具有明显的成骨和成脂表型,表明ADSCs具有多向分化潜能.
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脂肪干细胞及血管内皮细胞提高游离脂肪移植成活的实验研究
目的 探讨脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)及血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)对脂肪移植术后血管新生及脂肪成活的影响.方法 取乳房切除术患者自愿捐赠的脂肪组织,采用胶原酶消化法分离培养ADSCs,取第3代细胞进行实验;同时制备游离脂肪颗粒.取健康4～6周龄雄性裸鼠80只,随机分为4组(n=20),分别于裸鼠背部皮下注射1 mL脂肪颗粒+0.3 mL生理盐水(对照组)、1 mL脂肪颗粒+2×106个人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs) +0.3 mL生理盐水(ECs组)、1 mL脂肪颗粒+2×106个ADSCs+0.3 mL生理盐水(ADSCs组)、1 mL脂肪颗粒+1×106个HUVECs+1×106个ADSCs+0.3 mL生理盐水(ADSCs+ECs组).注射后观察各组裸鼠存活情况,大体观察背部移植区色泽、形状.2、4、8、12周时背部移植区行超声影像学观察,取标本采用排水法测量其体积,组织学观察移植脂肪大体结构变化情况,免疫荧光染色观察血管新生情况.结果 各组裸鼠均存活至实验完成.移植后各时间点各组超声检测结果无明显差异,移植脂肪内部均未见明显血流信号,未见囊肿、钙化、实性占位等异常表现.移植后各时间点,ADSCs组及ADSCs+ECs组移植脂肪体积均高于ECs组及对照组(P＜0.05);且8、12周时ADSCs组明显高于ADSCs+ECs组(P＜0.05).HE染色示移植后各组组织学形态变化趋势相似,但ADSCs组组织重塑速度快于其他各组.免疫荧光染色示随时间延长各组新生血管逐渐增加,各时间点ECs组、ADSCs组、ADSCs+ECs组微血管密度均高于对照组(P＜0.05);4周时ADSCs组微血管密度高于ECs组及ADSCs+ECs组(P＜0.05);8、12周时ADSCs组及ADSCs+ECs组高于ECs组(P＜0.05),ADSCs组及ADSCs+ECs组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 ADSCs可提高移植脂肪存活率,且该促进作用可能与促进血管新生相关.
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复合脂肪来源干细胞的脱细胞异种神经联合富血小板血浆修复兔面神经损伤的实验研究
目的 探讨复合脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的脱细胞异种神经联合富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)修复兔面神经损伤的早期效果.方法 取 15 只 3 月龄雌性 SD 大鼠双侧坐骨神经进行脱细胞处理,作为异种神经移植体.取成年新西兰大耳白兔颈背部脂肪垫,采用Ⅰ型胶原酶单独消化法分离培养 ADSCs;兔耳静脉采血后经两步离心法提取 PRP;观察不同体积分数 PRP 对 ADSCs 增殖的影响,以及诱导其为类雪旺细胞可行性.取第 3 代 ADSCs,CM-Dil 活细胞染色剂标记后,荧光显微镜观察细胞标记及传代后荧光衰减情况.另取 32 只新西兰大耳白兔建立左侧面神经 1 cm 长缺损模型,随机分成 4 组(n=8),A、B、C、D组分别采用 CM-Dil-ADSCs 复合脱细胞异种神经+自体PRP、CM-Dil-ADSCs 复合脱细胞异种神经、脱细胞异种神经、自体神经移植修复神经缺损.术后 1、8 周静态下测量各组动物左侧上唇与面正中线成角(θ 角);4、8 周神经电生理检测记录神经传导速度;8 周荧光显微镜观察 A、B 组再生神经远近端 CM-Dil-ADSCs 数量,各组再生神经甲苯胺蓝染色计数有髓神经纤维、透射电镜观察再生神经纤维结构.结果 5％～20％ PRP 均能促进 ADSCs 增殖,经 20％ PRP诱导后细胞 S-100 免疫荧光染色呈阳性.ADSCs 经 CM-Dil 标记后荧光显微镜下观察示细胞标记率达90％ 以上,被标记细胞传代后细胞增殖良好,传代后荧光稍衰减.术后各组动物均存活至实验完成.术后 1 周各组动物面部均发生不同程度功能障碍,A、B、C、D 组左侧 θ 角分别为(53.4±2.5)、(54.0±2.6)、(53.7±2.4)、(53.0±2.1)°,均显著低于健侧(P<0.05);术后 8 周分别为(61.9±4.7)、(56.8±4.2)、(54.6±3.8)、(63.8±5.8)°,与健侧及术后 1 周比较差异均有统计学意义(P<0.05).大体观察各组动物再生神经完整性及连续性均良好.术后 4、8 周神经电生理检测示,A、D 组神经传导速度均显著快于 B、C 组,B 组快于 C 组(P<0.05),A、D 组间比较差异无统计学意义(P>0.05).术后 8 周荧光显微镜观察示,A 组移植神经远、近端横断面均可见大量 CM-Dil-ADSCs通过,B 组通过细胞相对较少.甲苯胺蓝染色示,A、D 组有髓神经纤维密度均显著高于 B、C 组,B 组高于 C 组(P<0.05);A、D 组间差异无统计学意义(P>0.05).透射电镜观察示,D 组有髓神经纤维鞘直径大、壁厚,形态规则;A 组髓鞘形态与 D 组相似;B、C 组髓鞘形态不规则,直径小、壁薄.结论 ADSCs 可以作为种子细胞在体内存活,并可在 PRP 诱导下分化为类雪旺细胞,与脱细胞异种神经复合后修复兔周围神经损伤可获得较好效果.
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人脂肪来源干细胞对小鼠压疮愈合影响的实验研究
目的 探讨人脂肪来源干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs)对小鼠压疮创面愈合的影响.方法 取自愿捐赠的人脂肪组织,采用机械分离联合胶原酶消化法获取 hADSCs 并传代.取第 3 代细胞行成骨、成脂、成软骨分化以及流式细胞仪鉴定.取健康自愿者捐赠的外周血,采用离心法制备富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP),并行血小板计数.取 45 只 C57BL/6 小鼠采用磁铁夹压法于背部制备压疮模型,随机分为 3 组(n=15);hADSCs 组、PRP 组及对照组创面分别注射 100 μL 经携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记后的 hADSCs(1×106个)、人 PRP、PBS.注射后观察压疮创面愈合情况,5、9、13 d 计算创面愈合率;5、11、21 d 取标本行 HE 染色、Masson 染色以及 CD31、S100 免疫组织化学染色,观察创面血管、神经再生情况.hADSCs 组于 11 d 时荧光示踪法观察细胞定植及成活情况.结果 经诱导分化及流式细胞仪鉴定分离培养细胞为 hADSCs.PRP 血小板计数显著高于正常外周血(t=5.781,P=0.029).大体观察,注射后 hADSCs 组创面愈合优于 PRP 组及对照组,5、9、13 d,hADSCs 组创面愈合率明显高于 PRP 组及对照组(P<0.05).组织学观察示,与 PRP 组及对照组相比,hADSCs 组炎性细胞浸润、炎性反应明显减轻,胶原沉积明显增多,且 21 d 时可见皮肤附属器再生;注射后各时间点,hADSCs 组胶原表达量均显著高于 PRP 组及对照组(P<0.05).免疫组织化学染色示,各时间点 hADSCs 组新生血管数、S100 阳性细胞百分比均明显多于 PRP 组和对照组(P<0.05).荧光示踪法显示注射 11 d 后 hADSCs 可定植于创面并成活.结论 局部移植的 hADSCs 通过促进血管新生和神经再生,进而促进小鼠压疮创面愈合、提高愈合质量.
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脂肪来源干细胞治疗难愈性创面的研究进展
目的 总结近年脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)应用于难愈性创面治疗中的研究进展.方法 查阅近年有关ADSCs治疗难愈性创面的文献,分析总结其修复机制及治疗进展.结果 ADSCs与单支架技术、片材技术等方法联合应用促进难愈性创面愈合已取得巨大进展,ADSCs可通过自身旁分泌、促血管生成、抗氧化凋亡等多种机制,加快创面血管生成,促进难愈性创面愈合.结论 ADSCs来源充足,易提取且易培养,无免疫原性,具有多向分化潜能和显著的促血管生成潜能,已成为再生医学理想的种子细胞.但仍需提高干细胞传递技术,开发更有利于临床使用的生物材料,以提高难愈性创面的治愈率.
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大鼠脂肪来源干细胞对紫外线造成的软骨细胞DNA损伤的修复作用研究
目的 探讨大鼠脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)对紫外线照射造成的软骨细胞DNA损伤的修复作用.方法 取3～4周龄SD大鼠(体质量100 ～ 120 g)腹股沟脂肪,利用Ⅰ型胶原酶消化法体外分离培养ADSCs并传代;取第3代细胞采用流式细胞仪检测其表面相关标记,行成骨及成脂诱导鉴定其多向分化潜能.另取SD大鼠关节软骨,利用酶消化法分离培养软骨细胞并传代,并行甲苯胺蓝染色鉴定.取第3代软骨细胞,采用40 J/m2剂量紫外线照射;照射后细胞分别以正常培养基培养(照射组)、以含ADSCs培养上清的培养基培养(ADSCs上清组)或与ADSCs共培养(ADSCs组)24 h.以不进行紫外线照射的正常第3代软骨细胞作为对照(对照组).采用MTS法检测细胞增殖情况,免疫荧光染色、Western blot法检测软骨细胞DNA损伤标志蛋白磷酸化组蛋白2A变异体(phosphorylated histone family 2A variant,γH2AX)的表达情况.结果 经流式细胞仪检测及成骨、成脂诱导鉴定,所培养细胞为ADSCs.对照组、照射组及ADSCs上清组吸光度(A)值分别为2.20±0.10、1.34±0.04、1.57±0.06,照射组及ADSCs上清组显著低于对照组,照射组显著低于ADSCs上清组,比较差异均有统计学意义(P＜0.05).免疫荧光染色示,照射组、ADSCs上清组及ADSCs组γH2AX蛋白荧光强度明显高于对照组,但ADSCs上清组及ADSCs组γH2AX蛋白荧光强度明显弱于照射组,ADSCs组和ADSCs上清组则无明显区别.Western blot法检测示,照射组、ADSCs上清组及ADSCs组γH2AX蛋白相对表达量均明显高于对照组,但ADSCs上清组及ADSCs组显著低于照射组,差异均有统计学意义(P＜0.05);ADSCs组和ADSCs上清组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 大鼠ADSCs有助于恢复紫外线照射后的软骨细胞的增殖,降低DNA损伤标志蛋白γH2AX的表达,对紫外线照射所致软骨细胞损伤具有修复作用.
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重组腺病毒介导BMP-9及促红细胞生成素双基因共转染促进脂肪来源干细胞体外成骨的研究
目的 探讨重组腺病毒介导BMP-9及促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)双基因共转染对脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)体外成骨分化的影响.方法 取4月龄新西兰兔腹股沟脂肪组织,采用酶消化法与贴壁法分离培养ADSCs并鉴定其多向分化能力.将第3代ADSCs分为5组:A组为正常细胞,B组为空质粒转染细胞作为对照,C、D组分别采用BMP-9、EPO重组腺病毒转染细胞,E组采用BMP-9、EPO重组腺病毒共转染细胞.转染培养7d后倒置相差显微镜观察各组细胞生长变化;计算48 h时病毒转染效率,14 d荧光显微镜下观察各组细胞荧光表达情况;14d时Western blot检测各组细胞BMP-9及EPO蛋白表达.取转染培养14d的5组细胞进行成骨诱导培养,于诱导培养3、7、14d检测各组细胞ALP活性;3周时茜素红染色观察钙结节形成情况,实时荧光定量PCR检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)基因表达.结果 转染培养7d后倒置相差显微镜下见A、B组部分细胞变为椭圆形、圆形和不规则形;C、D组可见少量长梭形细胞;E组长梭形细胞明显增多,仅见少量圆形细胞.荧光显微镜下观察BMP-9、EPO及BMP-9/EPO重组腺病毒均能稳定转染ADSCs,转染效率为80％～93％.Western blot检测示E组BMP-9及EPO蛋白相对表达量显著高于其他组,差异有统计学意义(P＜0.05).成骨诱导培养3、7、14 d时各组细胞ALP活性明显升高,E组优于其余各组(P＜0.05);3周时茜素红染色示E组钙结节数亦显著高于其余各组(P＜0.05),实时荧光定量PCR示E组OPN和OCN基因相对表达量明显高于其他组,C、D组高于A、B组,比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 重组腺病毒介导BMP-9及EPO基因均可转染ADSCs并稳定表达,双基因共转染后能显著促进成骨相关基因和蛋白的表达.
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脂肪来源干细胞复合3D打印支架构建工程化组织的研究进展
目的 综述脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)复合3D打印支架在脂肪、骨、软骨、血管、肝细胞等组织工程领域的研究进展.方法 广泛查阅近年国内外与ADSCs复合3D打印支架构建工程化组织研究相关的文献,并进行总结分析.结果 研究表明,ADSCs可在3D打印支架中分化成多种组织细胞,参与促进各种损伤修复再生,但相关研究尚处于早期阶段.结论 利用ADSCs与3D打印支架构建工程化组织有望修复脂肪、骨、软骨等损伤组织器官结构并重建功能.
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BMP-14联合Noggin shRNA共转染对脂肪来源干细胞成骨分化能力的影响
目的 在体外环境下同时下调细胞中Noggin基因和增加BMP-14基因,观察对脂肪来源干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)成骨分化能力的影响.方法 取健康成年SD大鼠5只,体质量250～300 g,采用Ⅰ型胶原酶消化法获取原代ADSCs,体外培养、扩增.使用慢病毒载体将目的基因转染大鼠ADSCs,根据目的基因不同将实验分为3组,A组为空载体病毒Lv-增强型绿色荧光蛋白转染对照组,B组为Lv-BMP-14转染组,C组为BMP-14+Noggin shRNA转染组.分别于转染后3、7、14d,采用实时荧光定量PCR检测BMP-14及成骨相关基因[Ⅰ型胶原、ALP、骨钙素(osteocalcin,OCN)]的表达,转染后14 d采用茜素红染色鉴定其成骨分化能力.结果 转染后3d,各组BMP-14 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05);7、14d,C组BMP-14 mRNA相对表达量高于A、B组,B组高于A组,比较差异均有统计学意义(P＜0.05).转染后3d,C组各成骨相关基因mRNA相对表达量显著高于A、B组(P＜0.05);A、B组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).转染后7、14 d,C组各成骨相关基因mRNA相对表达量显著高于A、B组,B组高于A组,除转染后7dA、B组间Ⅰ型胶原mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05)外,其余各组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05).转染后14 d茜素红染色示,A、B、C组钙结节量呈递增趋势.结论 BMP-14具有增强大鼠ADSCs向成骨细胞分化的能力;沉默细胞中的Noggin基因、联合BMP-14基因共同作用于大鼠ADSCs,其体外成骨分化能力明显强于BMP-14单基因转染,两者有显著的协同作用.
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兔坐骨神经匀浆上清液对脂肪干细胞的诱导分化作用
目的 探讨兔坐骨神经匀浆上清液对脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的诱导分化作用.方法 取4月龄健康新西兰大白兔(体重2.0～2.5 kg)体外分离、培养ADSCs并传至第3代;用bFGF预诱导后,加入正常坐骨神经匀浆上清液(B组)及损伤3、7、14 d的坐骨神经匀浆上清液(分别为C、D、E组)对其进行诱导,空白对照组(A组)仅加入D-Hank液.观察细胞形态变化,并采用实时荧光定量PCR检测各组细胞神经组织蛋白(S-100)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)及巢蛋白(Nestin)基因表达,免疫细胞化学染色检测S-100蛋白表达.结果 C、D、E组细胞经诱导后逐渐出现雪旺细胞或神经细胞样形态改变,以D组变化为明显;A、B组细胞形态未见明显改变,仍以梭形为主.S-100免疫细胞化学染色示,C、D、E组染色均为阳性,以D组阳性细胞多;A、B组细胞无阳性表达.实时荧光定量PCR检测示,S-100基因表达量随损伤时间延长呈上升趋势,C、D组达高峰,之后缓慢下降;C、D组表达量显著高于A、B、E组(P＜0.05),C、D组间差异无统计学意义(P＞0.05).NSE基因表达量呈相同趋势,D组达高峰,之后缓慢下降;D、E组表达量显著高于A、B、C组(P＜0.05),D、E组间差异亦有统计学意义(P＜0.05).Nestin基因表达量各组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 兔损伤坐骨神经匀浆上清液在体外能够有效诱导ADSCs分化为雪旺细胞和神经细胞,伤后早期(3～7 d)可作为细胞移植的佳时间.
