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电压依赖性钾通道与Miconazole在低氧性肺血管收缩中的作用
目的观察大鼠肺动脉平滑肌细胞(PaSMCs)膜上电压依赖性钾通道(Kv)与细胞色素P450氧化酶抑制剂Miconazole在低氧性肺血管收缩中的作用.方法采用急性酶分离法分离出大鼠肺动脉平滑肌细胞(PaSMCs),利用全细胞膜片钳技术记录PaSMCs的Kv通道的电流特性;用低氧液体灌流PaSMCs造成急性低氧模型,记录低氧作用前后Kv通道的电流变化;用不同浓度的Miconazole作用于PaSMCs,记录加药前后的电流变化.结果低氧液体灌流以及不同浓度的Miconazole对Kv均有明显的抑制作用,且Miconazole的抑制作用具有一定的浓度依赖性,在加用Kv的特异性的阻断剂4-氨基吡啶(4-AP)后再加用该药不能进一步抑制Kv电流.结论低氧和Miconazole均作用于Kv通道的同一部位,支持PaSMCs膜上的Kv通道在低氧性肺血管收缩中起重要作用,而细胞色素P450氧化酶可调节细胞内的氧化还原状态,可能系一重要的氧感受器.
关键词： 低氧性肺血管收缩 电压依赖性钾通道 Miconazole 膜片钳 -
膜片钳技术在口腔肿瘤细胞研究中的应用
膜片钳技术是通过记录离子通道的离子电流来反映细胞膜上离子通道的特性,可以对通道的电导、动力学特性、离子选择性、药理学特性以及通道的调节机制等方面进行深入细致的研究,从而为研究细胞膜的生理学特性,鉴别细胞膜表面蛋白及其功能提供了线索.本文就膜片钳技术的原理、记录方法等进行综述,阐述了膜片钳技术在口腔肿瘤细胞研究中的应用价值及前景.
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应用红外可视脑片膜片钳技术观察精氨酸加压素对大鼠PO/AH区温度敏感神经元放电活动的影响
目的 应用红外可视脑片膜片钳技术观察精氨酸加压素对大鼠视前区-下丘脑前部(PO/AH)温度敏感神经元放电活动的影响.方法 应用红外微分干涉相差技术和膜片钳技术实时观察57只雄性SD大鼠下丘脑PO/AH区神经元形态,鉴定温度敏感性.精氨酸加压素(AVP)和V1a受体阻断剂胞外给药,观察对温度敏感神经元放电活动的影响.结果 红外可视条件下,下丘脑PO/AH区神经元的胞体清晰可见.AVP引起热敏神经元放电频率升高(P<0.01),冷敏神经元放电频率下降(P<0.01);V1a受体阻断剂能降低热敏神经元的放电频率(P<0.01)和提高冷敏神经元的放电频率(P<0.05).结论 AVP通过V1a受体影响PO/AH区温度敏感神经元的放电活动,而引起体温降低.
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Koch三角心肌细胞瞬间外向钾电流电生理学特征研究
目的 探讨Koch三角区心肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)电生理学特征.方法 采用单细胞膜片钳技术研究家兔Koch三角区心肌细胞Ito电流-电压及电流密度-电压关系曲线、稳态激活以及稳态失活特征.结果 ①起搏细胞(PC)、过渡细胞α(TCα)、过渡细胞β(TCβ)、心房肌细胞(AC)和浦肯野样细胞(PL) +20 mV时的大峰值电流(pA)幅值及峰值电流密度(pA/pF)任意两类细胞间差异均有统计学意义(P<0.05);除TCα、TCβ与PL相比外(P>0.05),各类细胞两两比较电流密度(pA/pF)差异均有统计学意义(P<0.05).②五种细胞稳态激活曲线之半数激活电压(V_(mlto1/2),mV)在各组细胞间差异均有统计学意义(P<0.05).但TCα与PC以及TCβ与AC和PL相比差异无统计学意义(P>0.05).③五种细胞稳态失活曲线之半数失活电压(VhIto1/2,mV)TCα、TCβ与PC和PL分别相比以及PC、AC、PL间相比差异均有统计学意义(P<0.05);TCα与TCβ、TCβ与PC、AC和PL以及PC与PL之间相比差异均有统计学意义(P<0.05),但TCα与PC、AC相比差异无统计学意义(P>0.05).结论 家兔Koch三角区各种心肌细胞之Ito存在异质性;不同心肌细胞间又具有相对特殊性及Ito梯度.
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巴曲酶对原代培养的大鼠皮层神经元钙激活钾通道的作用研究
目的 观察巴曲酶对原代培养新生SD大鼠皮层神经元上钙激活钾通道(Kca)作用.方法 采用细胞贴附和内面向外两种膜片钳单通道记录技术检测巴曲酶对Kca作用.结果 在钙浴液内,细胞贴附式膜片上,钳制膜电位+30 mV,加入不同浓度巴曲酶0.15 mmol/L、0.25 mmol/L、0.50 mmol/L、0.75 mmol/L、1.0 mmol/L,通道开放概率由0.005分别增加为0.013±0.002、0.082±0.011、0.131±0.012、0.211±0.010、0.062±0.009(P＜0.01),在0.75 mmol/L以内表现出浓度依赖性.在无钙浴液内,细胞贴附式膜片上,钳制膜电位+50 mV,随巴曲酶浓度增加为0.15 mmol/L、0.40 mmol/L、0.60 mmol/L、1.0 mmol/L时,通道开放概率由0.005分别增加为0.013±0.001、0.112±0.007、0.193±0.010、0.301±0.009(P＜0.05).6例内面向外式膜片上,钳制膜电位+40 mV,分别加入巴曲酶0 mmol/L、0.25 mmol/L、0.50 mmol/L 3 min后,通道开放概率分别为0.012±0.007、0.011±0.009、0.013±0.008(P>0.05),巴曲酶在胞内Kca开放概率,平均开放/关闭时间,电流幅值均无明显变化.结论 巴曲酶通过影响胞内游离钙水平间接调节Kca,可能对神经元有直接保护作用.
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钙激活钾通道在钙离子致神经细胞损伤中的作用
采用膜片钳单通道记录方法,观察原代培养新生SD大鼠皮层神经元的钙激活钾通道(KCa)特征及胞内不同游离钙水平对通道开放动力学的调节.结果显示:培养SD大鼠皮层神经元的KCa以大电导活动占优势,胞内游离钙为10-8 mol/L时,通道几乎不开放,在10-6 mol/L时达大激活.由此表明神经元上KCa通道开放概率明显依赖于胞浆中钙离子和膜电位,KCa对胞内钙离子浓度变化极为敏感.钾通道的开放剂可能有一定的神经细胞保护作用.
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果蝇晚三龄幼虫脑神经元的快速分离与鉴定
目的 探索果蝇晚三龄幼虫脑神经元急性分离的新方法,并对分离制备的脑细胞进行形态学观察和电生理学记录.方法 解剖果蝇晚三龄幼虫脑组织,用胶原酶化学消化并辅以机械微振荡法分离制备单个细胞,用果蝇细胞培养液适当孵育.在倒置相差显微镜下对其进行形态学观察和分类,结合全细胞膜片钳技术对其电生理学特征进行初步研究.结果 成功制备出三类大小和形态各异、活性较好的果蝇脑神经元,未见神经胶质细胞;以三型细胞为电生理学研究对象,记录到五种类型的全细胞外向钾电流.结论 新建立的果蝇晚三龄幼虫脑细胞急性分离方法简便易行,稳定可靠.
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胞外不同钠浓度对培养新生小鼠心肌细胞钠电流的影响
目的:探讨细胞外液不同的钠浓度对培养新生小鼠心肌细胞Na+电流的影响.方法:采用膜片钳技术,在浴液不同的钠离子浓度下,记录培养新生小鼠的心肌细胞钠电流的激活、失活以及恢复曲线.结果:相对于低钠浴液,高钠浴液记录的培养新生小鼠心肌细胞钠电流明显延迟,电流幅度增加也不明显,激活曲线不圆滑.结论:胞外高钠不是记录钠电流合适的实验方案.
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吗啡慢性处理对大鼠前额叶皮层神经元瞬时外向钾电流的影响
目的:本实验用全细胞膜片钳技术观察吗啡对大鼠前额叶皮层神经元瞬时外向钾电流(IA)的影响.方法:实验中用终浓度为10μmol/L的吗啡处理细胞48h,采用全细胞膜片钳技术记录IA,进行以下方面的实验:培养大鼠皮层神经元IA的特性及鉴定;吗啡对神经细胞IA的电流密度-电压曲线(Ⅰ-Ⅴ曲线)的影响.结果:记录到一快速激活并快速失活的外向电流,该电流可被2mmol/L的特异性IA阻断剂4-AP阻断;吗啡慢性处理能引起大鼠皮质神经细胞IA增强,当膜电位在-25 mV～+65 mV时,吗啡慢性处理组电流密度明显高于对照组.结论:吗啡能引起神经细胞IA增强,使神经元处于超极化状态,导致其活动抑制.
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RNA干扰HeLa细胞IKCa1基因对中电导钙激活钾通道电流的影响
目的:本研究旨在探讨RNA干扰HeLa细胞IKCa1基因对中电导钙激活钾通道电流(IKCa1)的影响.方法:采用携带IKCa1基因的pGenesil-IKCa1质粒及pGenesil-HK对照质粒分别转染HeLa细胞.实验分为Control组(无质粒转染组),pGenesil-HK组和pGenesil-IKCa1组.在荧光显微镜下观察报告基因GFP在HeLa细胞中的表达情况并将GFP阳性率作为转染效率的评价指标,采用RT-PCR技术检测IKCa1基因的表达水平,应用膜片钳电生理技术记录IKCa1.结果:①pGenesi1-HK组和pGenesil-IKCa1组转染率分别为75.3％和72.4％,两组之间阳性率差异无统计学意义(P＞ 0.05);②pGenesil-IKca1组IKCa1基因的mRNA表达水平明显低于Control组及pGenesil-HK组(P＜0.01);③在HeLa细胞能记录到IKCal电流,该电流具有钙离子依赖性且能被Clotrimazole完全阻断,与Control组及pGenesil-HK组相比,pGenesil-IKCa1组的IKCa1电流电压曲线下移,钳制电压为+60 mV时电流密度为(10.05±3.37)pA/pF,明显低于Control组(21.78±5.54)pA/pF和pGenesil-HK组(20.54±5.29)pA/pF(P＜ 0.01).结论:通过RNA干扰能有效抑制宫颈癌HeLa细胞IKCa1电流,为今后开展以IKCa1为靶点的宫颈癌的基因治疗提供新的靶点和电生理实验依据.
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人肠系膜血管平滑肌细胞BKCa通道在HEK293细胞上的表达方法研究
目的:本研究旨在HEK 293细胞系上成功表达人肠系膜血管平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium-activated potassium channels,BKCa),建立一种稳定高效表达人肠系膜血管平滑肌细胞BKCa的HEK 293细胞系方法,进一步揭示在工具细胞表达上的BKCa的基本特性,为以后的诸多实验提供参考价值.方法:应用基因工程技术构建人肠系膜血管平滑肌细胞BKCa通道基因表达载体,用脂质体转染法转染HEK 293细胞,建立了稳定高效表达BKCa通道的HEK 293细胞系的方法.结果:在HEK 293细胞系上表达的BKCa单通道电流的电导值为229.56±4.62 pS,具有电压依赖性,钙离子敏感性等特性;在HEK 293细胞系表达的BKCa全细胞宏观电流具有明显的电压依赖性和外向整流特性.结论:成功建立了一种在HEK293细胞系上表达的BKCa通道的实验方法,并成功记录到BKCa通道的单通道电流和全细胞宏观电流,且与天然细胞上BKCa通道电流特性基本一致.
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一种有效记录人心房肌细胞小电导钙激活钾通道电流的方法
目的:探讨一种有效的记录人心房肌细胞小电导钙激活钾通道(small conductance Ca2+-activated K+ channels,SK)电流的全细胞膜片钳方法.方法:以人心房肌细胞为研究对象,采用传统全细胞膜片钳技术,记录人心房肌细胞的小电导钙激活钾通道的宏观电流.传统全细胞模式形成后,分别记录在浴液中加入apamin(100nM)前后的电流,两者相减就得到了apamin敏感的SK2的电流.结果:采用传统全细胞膜片钳技术,能有效记录人心房肌细胞上apamin敏感的宏观电流.该电流是内向整流,去极化激活时,无明显失活现象,无尾电流出现,这些都符合SK2电流特性.结论:本实验提供了一种简单、有效的记录入心房肌细胞SK2宏观电流的方法,为今后深入的研究提供了实验基础.
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辣椒素对不同年龄大鼠内脏感觉神经元上辣椒素受体通道的影响
目的 探讨辣椒素对不同年龄SD大鼠内脏感觉神经元上辣椒素受体(TRPV1)介导的离子通道的影响.方法 急性分离7～9 d和21～23 d大鼠迷走神经结状神经节神经元,利用全细胞膜片钳技术在分离的神经元上记录辣椒素激活TRPV1受体后通道电流的,变化.结果 ①7～9 d和21～23 d大鼠内脏感觉神经元的膜电容分别为(18.57±8.60)和(19.85±9.47)pF,(P>0.05);②辣椒素能够激活7～9 d和21～23 d大鼠内脏感觉神经元上TRPVl并产生相似的内向电流.两组产生的峰电流密度分别为(48.59±18.87)、(55.91±20.52)pA/pF(P>0.05);③反复应用辣椒素使TRPV1受体发生失敏现象.结论 大鼠内脏感觉神经元的TRPV1受体通道在出生后已经发育成熟,且对辣椒素激活的通道电流有相似的变化.
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小鼠嗅感觉神经细胞的急性分离
目的: 建立一种急性分离小鼠嗅感觉神经细胞的方法.方法: 利用酶消化结合机械吹打方法,急性分离昆明小鼠嗅粘膜的嗅感觉神经细胞.结果: 本实验方法能分离出具有正常形态特征的嗅感觉神经细胞,细胞在体外可以存活5小时左右,可用于膜片钳等实验研究.结论: 本研究建立了一种快速、可靠、简便易行的急性分离成年小鼠嗅感觉神经细胞的方法,此法不损伤细胞膜的电生理学特性.
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甘氨脱氧胆酸对肝细胞钙激活性钾通道的影响
目的观察甘氨脱氧胆酸(GDC)对大鼠肝细胞钙激活性钾通道(KCa)开放概率的影响.方法体外培养大鼠肝细胞,以GDC为处理因素,应用膜片钳技术通过贴附式和内面向外式膜片测定大鼠KCa开放概率.结果①细胞贴附式膜片下,浴液中Ca2+浓度10-7mol/L,GDC终浓度为50,100,250μmol/L时,概率由0.038±0.09分别增加到0.620±0.338,0.591±0.163,0.895±0.176(n=4,P均＜0.01).浴液中不加GDC,改变Ca2+浓度(10-7、10-6、10-5mol/L),KCa的开放概率并不发生明显改变,而在此液中加入GDC(终浓度100μmol/L),KCa开放概率由0.042±0.015增加到0.385±0.330和0.551±0.163(n=4,P均＜0.05).浴液中不含Ca2+,并加入EGTA,GDC浓度为50,100,250μmol/L,KCa开放概率显著增加(n=4,P均＜0.05),但比浴液中有Ca2+时增加程度小.②内面向外式膜片下,浴液中无Ca2+,加入GDC(10,50,100,250μmol/L),KCa开放概率无明显改变(n=2,P＞0.05).结论①GDC对KCa有明显的激活作用,并有浓度依赖性.②GDC既有引起胞外Ca2+内流,也能诱导内贮Ca2+的释放.③GDC对KCa的激活是通过Ca2+实现的.
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上调Cx43对心肌细胞间通讯及离子通道的影响
目的 通过重组腺病毒介导缝隙连接蛋白Cx43在体外培养的心肌细胞中过度表达,观察心肌细胞间通讯及细胞离子通道变化.方法 通过RT-PCR法克隆SD大鼠缝隙连接蛋白Cx43基因的全长cDNA,用基因重组的方法构建腺病毒pAdEasy-1-Cx43.行心肌细胞基因转染后,分别用RT-PCR和蛋白质免疫印迹技术检测Cx43在心肌细胞中的mRNA和蛋白表达,用免疫荧光技术分析Cx43在心肌细胞膜上的分布.采用划痕标记荧光染料示踪(SLDT)技术观察培养心肌细胞群之间的罗氏黄(lucifer yellow,LY)染色传输,检测上调Cx43对心肌细胞间通讯的影响;采用单细胞膜片钳技术分析各离子通道电流的变化,观察上调Cx43对心肌细胞膜离子通道表达的影响.结果 腺病毒重组质粒pAdEasy-1-Cx43构建成功;转染心肌细胞后,pAdEasy-1-CX43转染组Cx43 mRNA及蛋白表达上调,且心肌细胞膜上分布较多;细胞划痕荧光染料示踪提示转染后,心肌细胞间通讯增强;膜片钳全细胞膜电流提示转染后钙内流降低,钾离子电流未发现有明显改变.结论 成功构建腺病毒重组质粒pAdEasy-1-Cx43载体,隙连接蛋白Cx43表达上调增强了心肌细胞间通讯以及钙内流,为Cx43改善心室肌电重构,减少或预防室性心律失常发生的进一步研究打下了基础.
关键词： 重组腺病毒转染 缝隙连接蛋白Cx43 细胞划痕荧光染料示踪 细胞间通讯 膜片钳 -
芍药甙对离体大鼠下丘脑腹内侧核神经元电活动的影响
目的:研究芍药甙(PF)对正常大鼠下丘脑腹内侧核(VMH)神经元兴奋性的影响.方法:应用脑片全细胞膜片钳技术记录了35个正常的VMH神经元的自发放电,观察PF对它们的作用.结果:[1]当脑片用含PF(300μmol/L)的人工脑脊液灌流后,有22个神经元放电频率明显减少,平均放电频率从(7.1±2.2)Hz减少到(3.2±0.7)Hz(P＜0.01);在去极化方波刺激下放电数目也明显减少,洗脱后恢复;[2]PF对VMH的葡萄糖受体神经元(GRN)表现为明显的抑制作用,与其对非葡萄糖受体神经元的作用相比,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:PF能够降低VMH GRN的放电频率,调节下丘脑饱中枢神经元的兴奋性,从而影响动物的摄食行为.
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一种适合膜片钳记录的成年大鼠背根神经节细胞培养方法
目的 建立一种适合膜片钳研究的成年大鼠背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)细胞培养方法 .方法 分离并培养成年大鼠DRG神经元,显微镜下观察培养神经元的形态,膜片钳技术记录培养神经元的基本膜电生理特性及ATP激活电流.结果 培养的DRG神经元形态结构完整;其静息膜电位在正常范围内,可记录到诱发动作电位及钠电流;在膜片钳全细胞记录模式下,能稳定地记录到ATP诱发电流.结论 培养的成年大鼠DRG神经元适合膜片钳试验.
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IL-1β通过过氧化氢双相调节大鼠主动脉平滑肌细胞大电导钙敏感钾通道活性研究
目的 观察不同时间点白介素(IL)-1β对大鼠主动脉平滑肌细胞(ASMCs)内过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)浓度及大电导钙敏感钾通道(large conductance Ca2+-activated K+channel,BKCa)活性影响,探讨IL-1β时间依赖双相调节BKCa通道活性机制.方法 ①分组:生理盐水对照组(saline组)、IL-1β处理30 min组、过氧化氢酶(catalase)+ IL-1β处理30 min组、IL-1β处理48 h组、catalase+ IL-1β处理48 h组;②检测IL-1β处理大鼠ASMCs不同时间点细胞内H2O2水平变化;③运用膜片钳技术,观察各实验组BKCa通道单通道电流开放概率(NPo)变化.结果 ①与saline组(36.7±7.23) μmol/ml的结果相比较,IL-1β与ASMCs共培养30 min组H2O2的水平增至(79.1±8.93) μmol/ml(P＜0.01);共培养48 h组,H2O2水平明显上调至(116.4±12.77) μmol/ml(P ＜0.01);H2O2清除剂catalase可完全逆转IL-1β对H2O2影响.②与saline组比较,IL-1β单独处理ASMCs 30 min组NPo明显增加(P＜0.05);加入catalase预处理细胞,与saline组比较NPo无明显变化,与IL-1β单独处理ASMCs 30 min组比较NPo减少(P＜0.05).IL-1β单独处理ASMCs 48 h组,与saline组比较,NPo明显减少(P＜0.05);加入catalase预处理细胞,与saline组比较NPo减少(P＜0.05),同时与IL-1β单独处理ASMCs 48 h组比较NPo增加有统计学意义(P＜0.05).结论 IL-1β短时间处理ASMCs上调BKCa通道活性,低浓度H2O2介导这一过程;长时间处理则下调BKCa通道活性,其机制部分通过高浓度H2O2实现;BKCa通道可能是防治冠脉痉挛有前景的药物作用靶点.
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钾离子通道β亚单位KCNE4对KCNQ1及HERG电流的影响
目的:研究钾离子通道β亚单位KCNE4对KCNQ1及HERG通道电流的影响.方法:构建离子通道细胞模型,单独表达基因KCNQ1、HERG,以及联合表达基因KCNQ1+ KCNE4、HERG+ KCNE4.采用全细胞膜片钳方法记录通道电流曲线,比较组间电流的大小及通道的动力学特征.采用免疫荧光细胞定位方法,检测KCNF4对通道蛋白表达的影响.结果:KCNF4与KCNQ1共表达显著减低KCNQ1通道电流.单独表达KCNQ1通道的细胞,膜电位+60 mV时,平均电流密度为(24±2.9)pA/pF,共表达KCNQ1+ KCNF4时,细胞电流密度降至(7.3±1.1) pA/pF.与KCNQ1电流相比,+40 mV时KCNQ1/KCNF4激活时间常数的快成分(Tfast)增加,但慢成分(Tslow)减慢,KCNQ1/KCNF4无尾电流产生,表明KCNE4参与了KCNQ1通道动力学的调整.单独表达KCNF4亚单位的细胞没有产生任何电流.当KCNF4与HERG共表达时,电流的大小、电流电压关系曲线及通道稳态激活曲线都与HERG通道无明显差异,电流密度为(26.7±3.9) pA/pF,半数激活电压(V1/2)为(-3.10±0.68)mV,斜率因子为8.89±0.33.从通道的失活时间常数以及失活后恢复时间常数与测试电压的关系曲线可见,KCNF4对HERG通道的动力学特征均无影响.免疫荧光染色结果显示,KCNF4没有影响KCNQ1蛋白的表达.结论:KCNF4亚单位可显著改变KCNQ1通道的电压敏感性,表现出抑制作用,KCNE4对KCNQ1蛋白在细胞膜上的表达及HERG通道电流均无影响.
