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hERG钾通道蛋白转运与LQTS的研究进展
hERG钾离子通道由Warmke和Ganetzky[1]在1994年用小鼠同源的果蝇钾通道基因“ether-a-go-go”(EAG)筛选人类海马cDNA文库时被分离出来.有研究发现hERG编码的钾通道与快速型延迟整流钾电流(Ikr)相似,并证实其编码Ikr通道的的α亚基,hERG编码的α亚基与minK编码的β亚基及minK相关蛋白( minK related-protein,MiRP1)共同组成快速激活延迟整流钾通道[1-2].hERG钾通道与LQTS的发生密切相关.
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异长春花苷内酰胺注射给药对心血管系统影响的实验研究
目的：观察异长春花苷内酰胺大剂量注射给药对麻醉Beagle犬心血管系统的影响，并考察其体外对离子通道的抑制作用。方法：采用生理记录仪观察异长春花苷内酰胺静脉注射前后不同时间点Beagle犬收缩压（Sys），舒张压（Dia），平均动脉压（MBP），心率（HR），心电图PR间期、QRS间期、QT间期、QTcb间期、QTcv间期等指标的变化；应用全细胞膜片钳技术考察不同浓度异长春花苷内酰胺对CHO-hERG细胞上hERG钾离子通道和HEK-293-Nav1.5细胞上Nav1.5钠离子通道的抑制作用。结果：与空白对照组相比，异长春花苷内酰胺60、18 mg·kg-1剂量组、溶媒对照组（含吐温-80）于给药后15 min Sys、Dia、MBP、HR明显降低（P<0.05），给药结束后各项指标可见恢复。与溶媒对照组相比，各给药剂量组在各观测时间点无显著性差异。与空白对照组及自身给药前相比，60、18、6 mg·kg-1剂量组、溶媒对照组于给药后15 min QT、QTcb、QTcv间期明显延长（P<0.05），给药结束后可见一定程度的恢复。与溶媒对照组相比，各给药剂量组QT、QTcb和QTcv间期在各观测时间点无显著性差异。异长春花苷内酰胺对hERG钾离子通道和Nav1.5离子通道抑制作用较弱，IC50为560.8μmol·L-1及>900μmol·L-1，远远大于阳性对照药。结论：异长春花苷内酰胺大剂量单次静脉注射对Beagle犬可能有一定的降低血压、减慢心率及延长QT间期的作用，停药后可恢复。其中血压降低、心率减慢与溶媒中所含吐温-80有关。体外对hERG钾离子通道和Nav1.5离子通道无明显影响，提示异长春花苷内酰胺对动物QT间期的影响可能为其它作用机制所致。
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氨基糖甙类药物恢复HERG通道无义突变体的功能
目的 本研究旨在探讨氨基糖甙类药物对纯合和杂合的HERG无义突变体的作用效应.方法 采用聚合酶链反应法制备HERGR1014X突变体,并克隆至真核细胞表达载体中.将突变体的cDNA瞬时转染至HEK293细胞,应用全细胞膜片钳技术记录通道电流.药物拯救采用将转染24h后的HEK293细胞在含G-418或庆大霉素(终浓度为400μg/mL)的培养液中孵育24h.结果 R1014X能表达典型的HERG样电流,尽管与野生型(wild type,WT)HERG相比,大尾电流幅值明显F降(3.9±1.4 pA/pF,n=8,vs.47.8±6.3 pA/pF,n=12,P＜0.01).经过G-418和庆大霉素干预后,R1014X的大尾电流密度分别增加至12.7±3.3 pA/pF(n=7,P＜0.05)和18.3±3.7 pA/pF(n=8,P＜0.05).药物干预使R1014X的激活动力学特性亦得到恢复.Western blot和共聚焦检测进一步证实,氦基糖甙类能促进全长的HERG通道蛋白的表达.G-418和庆大霉素对杂合的WT/R1014X通道作用效应不同:庆大霉素能使WT/R1014X的电流增加2.2倍(n=12,P＜0.05),G-418却无明显效应.结论 氯基糖甙类药物能恢复无义突变的HERG通道的功能性表达,且对纯合和杂合通道均有效,这为遗传性心律失常的治疗提供了新的思路.
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不同浓度药物PTC124和G418对HERG通道无义突变体的作用
目的：通过对HERG基因无义突变体应用不同剂量PTC124和G418来观察其通道功能的恢复情况，并探讨药物的作用机制。
方法：制备HERG基因R1014X突变体，将野生型（WT）HERG及R1014X分别瞬时转染至HEK293细胞，转染24 h后将其置入含不同浓度的PTC124和G418的培养液中孵育24 h。逆转录聚合酶链反应法检测各组细胞HERG信使核糖核酸（mRNA）的表达，蛋白印迹法检测野生型和R1014X给药前后通道蛋白的表达，全细胞膜片钳技术记录通道电流以评价HERG基因编码通道的功能性表达。
结果：与野生型相比，R1014X突变体编码的通道蛋白的蛋白条带变短，蛋白量及mRNA水平无明显差异（P>0.05）。药物PTC124和G418均能恢复R1014X完整蛋白的表达，并呈剂量依赖性变化（P<0.05），PTC124的作用弱于G418（P<0.05）。药物干预后，R1014X突变体HERG通道的功能得到不同程度的恢复，其大尾电流密度由（4.75±0.88） pA/pF分别增加至（9.62±0.73） pA/pF （PTC124，P<0.05）和（22.57±2.26） pA/pF （G418,P<0.05），G418作用使通道的半激活电压得到恢复（P<0.05），差异均有统计学意义。
结论：药物PTC124和G418能不同程度恢复HERG基因无义突变的结构和功能性表达，其恢复HERG基因的蛋白表达呈剂量依赖性变化。 -
HERG基因新突变与家族性QT延长综合征
目的对一祖孙四代的QT延长综合征(LQTS)家系进行临床研究及分子遗传学分析,并揭示该家系成员基因型与基因表型之间的关系.方法搜集整理先证者及该家系成员的临床资料,采用PCR-SSCP进行基因突变位点的初步检测,并应用直接测序的方法进行验证.结果该家系26例中达到临床诊断标准者6例,可疑诊断1例.其共同的心电图特征为:QTc≥0.46s,T波宽大双峰,U波明显.基因检测结果表明,7例成员HERG基因的10号外显子均出现一个新的单碱基的转换突变(CGA2587TGA),该无义突变导致快速激活延迟整流性钾通道(IKr),缺失了296个氨基酸.结论该研究发现了LQTS 一个新的致病基因突变位点,并验证了LQTS 2型患者的心电图特点.推测该家系中致病基因携带者心电图U波的出现可能同IKr 蛋白质C末端的缺失有关.
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HERG编码的钾离子通道与新药评价
由人类ether-à-go-go相关基因(HERG)编码的钾离子通道在人类生理、病理过程中扮演着十分重要的角色.在心肌细胞中,HERG钾通道影响心脏动作电位的复极过程,是绝大多数能引起心肌细胞QT间期延长药物的作用靶标,它已成为新药研发早期,评价候选化合物心脏毒性的分子靶标.
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抗心律失常药物作用的靶点——HERG K+通道
快速延迟整流钾电流(rapidly activating component of delayed rectifier potassium current,IKr)在心肌动作电位复极化过程中发挥重要作用.HERG基因编码心脏快速延迟整流钾通道的α亚基,HERG基因突变导致遗传性长QT间期综合征(long QT syndrome,LQTS),另外IKr/HERG通道是绝大多数能引起心脏QT间期延长药物的作用靶标,其他一些化学结构不同的药物也可阻断该通道,引起QT间期延长,甚至发展成获得性心律失常.本文从门控机制及功能、HERG通道相关的心律失常、药物与通道相互作用机制、优化通道靶点的策略等四个方面综述IKr/HERG通道在抗心律失常方面的新研究进展.
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苦参碱、氧化苦参碱和白藜芦醇对HERG钾通道表达的影响
由于HERG钾通道在心律失常的发生与治疗中具有双重作用,因此成为近年来研究的热点.本文主要通过免疫荧光化学染色法、激光共聚焦显微镜及Western blotting法分别定性、定量地检测不同浓度的苦参碱、氧化苦参碱和白藜芦醇对稳定转染在HEK-293细胞中HERG钾通道表达的影响.研究发现,苦参碱(1 μmol·L-1)和氧化苦参碱(1 μmol·L-1)均能够促进定位于HERG-HEK细胞膜上的HERG钾通道的表达(n=5,P＜0.05),苦参碱(100 μmol·L-1)能够抑制定位于HERG-HEK细胞膜上的HERG钾通道表达(n=5,P＜0.05),氧化苦参碱(100 μmol·L-1)对HERG钾通道表达没有影响,白藜芦醇不影响HERG-HEK细胞中HERG钾通道表达.结果表明,低浓度的苦参碱促进HERG钾通道表达,高浓度的苦参碱抑制HERG钾通道表达,低浓度的氧化苦参碱促进HERG钾通道表达,白藜芦醇不影响HERG钾通道表达.这为苦参碱、氧化苦参碱和白藜芦醇抗心律失常作用机制及安全性提供了理论依据.
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槐果碱对HERG钾通道电生理功能的影响
HERG(human ether-a-go-go-related gene)钾通道在心律失常的发生及治疗中具有重要作用, 因此已成为近些年来的研究热点.本研究应用全细胞膜片钳技术记录在HEK(human embryonic kidney) 293细胞上稳定表达的HERG钾通道的电流和动力学曲线(激活、失活、复活和去活化)来研究不同浓度槐果碱对HERG电流及动力学曲线的影响, 以了解槐果碱抗心律失常的作用机制.结果表明, 槐果碱浓度依赖性地抑制HERG时间依赖性电流(Istep)及其尾电流(Itail).在0 mV时, 10、 30、 100及300 μmol·L-1槐果碱对Istep的抑制率分别为(10.7±2.8)%、 (11.3±5.5)%、(47.0±2.3)%及(53.7±2.5)%, 对Itail的抑制率分别为(1.1±3.0)%、 (17.1±3.3)%、 (32.7±1.9)%(P《0.05, n=12)及(56.0±2.4)%(P《0.05, n=13).100 μmol·L-1槐果碱作用后失活时间常数减小, 失活速率变快;复活时间常数在大部分指令电压下明显减小(P《0.01, n=12),复活速度加快;瞬时失活时间常数减小(P《0.05, n=12);稳态激活、去活化无明显改变.由此可看出,槐果碱通过影响通道的失活过程抑制HERG钾电流,使得心肌细胞复极时间延长,改善快速性心律失常.
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氟西汀对hERG钾通道的阻断作用及佛波酯的抑制作用
目的：探讨氟西汀对hERG( ether-a-go-go-related gene)钾通道的作用及蛋白激酶C( PKC)激动剂佛波酯( PMA )对氟西汀作用的影响。方法采用全细胞膜片钳技术记录氟西汀0.01,0.1,1和10μmol·L－1处理后稳定表达hERG钾通道的HEK293细胞( hERG-HEK293稳态细胞)上hERG钾通道电流(IKr)的变化,研究氟西汀对IKr作用的浓度依赖性和电压依赖性,并观察氟西汀1μmol·L－1处理后hERG钾通道激活、失活和复活动力学的变化。在此基础上,观察PMA 1μmol·L－1对氟西汀1μmol·L－1作用IKr后的影响。结果氟西汀0.01,0.1,1和10μmol·L－1对hERG-HEK293稳态细胞上IKr具有浓度依赖性和电压依赖性的抑制作用,半数抑制浓度( lC50)约为0.8μmol·L－1,Hill系数约为1.1。氟西汀1μmol·L－1可以减小IKr激活、失活和复活电流,并影响hERG钾通道的激活和复活过程。在氟西汀对IKr电流的抑制作用达到稳态后,PMA 1μmol·L－1可抑制氟西汀对hERG钾通道的阻断作用。结论氟西汀对hERG-HEK293稳态细胞上hERG钾通道具有明显的阻断作用,该作用可被PKC激动剂PMA抑制。
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当前对小分子药物致QTc间期延长评价的探索
对QT间期延长的评估是小分子药物研发过程中的关键一步.ICHS7A/S7B为指导这个心血管风险评估提供了主要框架.ICH指南描述了通过体外hERG抑制、离体动作电位时间和在体心电图等三步法来评估QT间期延长.狗、猴、猪、兔、雪貂和豚鼠是常用实验动物用于体内的电生理研究,尤其使用清醒的比格犬.在这些指南中标准研究的基础上,大量新的非在体研发方法也在使用.例如受体结合对hERG抑制、离体兔子心脏或豚鼠心脏灌流等方法.这些模型和临床都有较好的相关性,并且具有成本低廉、实验周期短的特点.因此能够帮助快速准确的预测潜在的心脏病风险,从而加速小分子研发的进程.
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先天性长QT综合征HERG基因真核表达质粒的构建及体外表达
目的 构建携带HERG目的基因的真核表达重组质粒pcDNA3-HERG,并观察HERG基因在心肌细胞中的表达情况.方法 应用基因重组技术,将原核克隆载体pGEM-HERG中HERG基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3,以酶切和聚合酶链反应(PCR)方法鉴定重组质粒pcDNA3-HERG的正确性;以Lipofectamine为介导将重组质粒与荧光真核表达载体pRK5-GFP共转染培养的乳兔心肌细胞,转染48 h后荧光显微镜下观察计算转染效率并采用Western Blot和全细胞膜片钳技术检测HERG基因的表达情况.结果 酶切和PCR结果均证实pcDNA3-HERG的正确性,以脂质体为介导,其转染心肌细胞的效率为(15.2±2.6)%;Westem Blot和膜片钳技术检测到HERG蛋白和HERG通道电流的表达.结论 成功构建HERG基因真核表达重组质粒pcDNA3-HERG,转染心肌细胞后可表达有功能的离子通道,为今后研究突变型HERG的功能提供了可行的技术平台.
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藤黄酸对K562细胞hERG钾通道蛋白的调控作用
目的 探讨藤黄酸对白血病细胞系K562增殖、凋亡、细胞周期的影响.并观察藤黄酸对hERG钾通道蛋白的调控作用.方法 K562细胞以不同浓度藤黄酸(0.125～8.0 μmol/L)处理0～72 h后,MTT法观察藤黄酸对K562细胞生长抑制的情况,Annexin-Ⅴ/PI双标法及透射电镜检测细胞凋亡,PI 单染法检测细胞周期分布,Western blotting、RT-PCR法分别检测藤黄酸对K562细胞内hERG通道的调控作用.结果 藤黄酸能明显抑制K562细胞增殖,具有时间-剂量依赖性,其24 h的IC50 为(2.637±0.208)μmol/L.此外,藤黄酸以浓度依赖性方式诱导K562细胞凋亡,并伴随明显的凋亡细胞形态学改变.而藤黄酸的凋亡诱导效应可能与其诱导K562细胞周期阻滞于G0/G1期有关.hERG钾通道蛋白在人白血病K562细胞中表达量较高,藤黄酸对hERG钾通道蛋白及其表达水平均有不同程度的抑制作用,该抑制作用呈明显的量效关系(P＜0.01).结论 藤黄酸可通过下调hERG钾通道蛋白的表达发挥较强的抗白血病效应,hERG钾通道有望成为白血病诊治的新靶标.
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奎尼丁对HEK293细胞hERG电流和hERG蛋白的影响
目的 观察奎尼丁对hERG电流和hERG通道蛋白表达的影响,进一步明确其导致长QT间期综合征的机制. 方法 用脂质体转染法将含有hERG基因的质粒转入HEK293细胞,全细胞膜片钳技术记录电流和Western blot技术观察hERG通道蛋白表达的影响.实验分组:①HEK293细胞转染进质粒48 h时加入不同浓度(0,1,3,10 μmol/L)的奎尼丁,并进行膜片钳实验观察奎尼丁的瞬时作用.②HEK293细胞转染进质粒24 h时往培养基加入不同浓度(1,3,10 μmol/L)的奎尼丁,继续培养24 h洗脱奎尼丁后立即进行膜片钳及Western blot实验观察奎尼丁的慢性作用. 结果 ①1 μmol/L、3 μmol/L及10 μmol/L组的大尾电流分别为(55.9±3.8)pA/pF、(35.7±3.2)pA/pF及(15.5±1.4)pA/pF,均明显小于对照(0 μmol/L)组(均 P<0.05).②不同浓度的奎尼丁孵育HEK293细胞后hERG电流无明显变化.Western blot观察到不同浓度奎尼丁作用下hERG蛋白表达无明显变化. 结论 奎尼丁对hERG电流有瞬时直接抑制作用,但并非影响hERG通道蛋白的表达来改变hERG电流.奎尼丁对hERG通道的直接抑制作用可能为其引起长QT间期综合征的根本机制.
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绿色荧光蛋白基因与hERG基因G604S突变共表达功能研究
目的 观察增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因与hERG(human ether-a-go-go-related gene)基因融合后是否影响hERG通道的电生理特性. 方法 HEK293细胞分别被转入pcDNA3-WT-hERG和/或pcDNA3-G604S-hERG,pEGFP-WT-hERG和/或pEGFP-G604S-hERG.激光共聚焦观察hERG通道蛋白在细胞内的表达定位;膜片钳实验记录hERG电流. 结果 在转染pcDNA3-WT-hERG或pEGFP-WT-hERG的细胞中,hERG蛋白表达于胞质与胞膜;在转染pcDNA3-G604S-hERG或pEGFP-G604S-hERG的细胞中,hERG蛋白仅在胞质表达.HEK293细胞转染pcDNA3-WT-hERG后,hERG电流的大尾电流密度为(75.4±2.2) pA/pF,明显高于转染pEGFP-WT-hERG的大尾电流密度[(15.1±0.7)pA/pF,P＜0.05].共转染pcDNA3-WT-hERG与pcDNA3-G604S-hERG的大hERG尾电流密度明显高于pEGFP-WT-hERG/pEGFP-G604S-hERG的大hERG尾电流密度[(23.1±0.8)pA/pF vs(12.6±0.9) pA/pF,P＜0.05].此外,EGFP基因与野生型或突变hERG基因融合后,明显改变了hERG通道的电压依赖性激活及去失活特性. 结论 EGFP基因与野生型或突变hERG基因融合不影响hERG通道蛋白在细胞内的表达定位,但明显改变了hERG电流的大小、激活及去失活特性,因此检测突变hERG通道的电生理功能时应避免使用绿色荧光蛋白基因质粒作为表达载体.
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hERG shRNA表达载体构建及其稳定转染骨肉瘤细胞系MG-63、SOSP-9607的建立
目的:构建hERG钾离子通道蛋白(human ether-a-go-go-related gene potassium channel )shRNA表达载体质粒,获得稳定转染干扰质粒的人骨肉瘤细胞系MG-63、SOSP-9607.方法:将4对合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入pGPU6/GFP/Neo表达栽体,并测序鉴定.使用脂质体法将重组的质粒转染至MG-63、SOSP-9607,通过G418筛选建立稳定转染的两种细胞系,采用免疫印迹( Western blot)技术检测hERG蛋白的表达.结果:测序结果证实shRNA与栽体连接正确,免疫印迹实验证实hERG蛋白表达显著降低.结论:成功构建了hERG shRNA真核表达载体,获得了稳定表达hERG shRNA的人骨肉瘤细胞系MG-63和SOSP-9607.
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磷酸化对HERG钾通道的调控作用
HERG(human ether-a-go-go-related gene)编码的钾通道介导快速激活延迟整流钾电流(IKr).IKr在心肌动作电位复极中发挥极其关键的作用,IKr的减弱可延长心肌动作电位时程,导致长QT综合征(LQTS).HERG突变和HERG钾通道的药物性阻滞是LQTS的常见原因之一.心脏HERG钾通道功能受众多因素的调控,该通道的磷酸化是重要的调控因素之一.现有报道证实HERG钾通道的调节由蛋白激酶(protein kinases A、C和protein tyrosine kinases Src等)介导完成.
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化学修饰降低药物hERG心脏毒性的研究进展
快速延迟整流钾电流(IKr)在心肌动作电位复极化过程中发挥着重要作用,而IKr通道蛋白的α亚基由hERG基因编码.近年来发现一些药物因阻断该通道引起QT间期延长甚至诱发尖端扭转型室性心动过速(TdP)而撤出市场.本文总结了降低药物hERG心脏毒性的化学修饰方法:形成两性离子,降低化合物亲脂性和降低pKa,并分析一些成功案例,为深入研究提供参考.
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盐酸小檗碱诱导人脑胶质瘤细胞 U251凋亡及其与 HERG 钾离子通道的表达相关研究
目的：探讨盐酸小檗碱（ ber）诱导人脑胶质瘤细胞U251凋亡及其与HERG钾离子通道表达相关性。方法使用不同浓度的ber处理人胶质瘤细胞U251，采用四甲基偶氮唑盐（ MTT ）染色法测定细胞增值率，Hoechst33258荧光染色法观察细胞形态学改变，流式细胞术测定细胞凋亡率，分别采用实时荧光定量PCR与Western Blotting检测HERG钾通道的RNA及蛋白的表达情况。结果 MTT法检测显示细胞抑制率呈浓度与时间依赖性，且随药物浓度增加而增大（P＜0．05），其24 h的半数抑制浓度（IC50））是（8．78±0．20）μmol/l；Hoechst33258荧光染色法检测表明处理组出现典型的凋亡特征；且流式细胞术检测结果表明随着ber的剂量增加U251细胞的早期凋亡率及晚期凋亡率逐渐增大（P＜0．05）；RT-PCR与Western Bloting检测结果显示ber处理后U251细胞的HERG钾通道的RNA含量及蛋白的表达均上调，且随着药物浓度的增高而增高。结论在体外ber可诱导人胶质瘤细胞系U251的凋亡，并可能通过上调HERG蛋白的表达抑制U251增殖。
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检测钾离子通道的小分子荧光探针的研究进展
钾离子通道是分布为广泛、种类繁多的一类离子通道,因其生理功能的多样性,已成为许多疾病的药物作用靶点.近年来,许多化学结构不同的药物均因钾离子通道阻滞引起的严重心肌毒性而被撤出市场,使得小分子药物的钾通道抑制活性筛选面临重大挑战.介绍检测钾离子通道的小分子荧光探针的研究进展,并总结小分子荧光探针的作用机制,为今后小分子荧光探针的设计提供思路,使得小分子荧光探针可以广泛应用于候选药物的高通量筛选、钾离子通道的活体成像与检测.
关键词： 钾离子通道 hERG shaker钾离子通道 小分子荧光探针
