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丹龙醒脑方对脑缺血再灌注大鼠侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖及Hes1、Hes5表达的影响
目的：观察丹龙醒脑方对脑缺血再灌注模型大鼠侧脑室室管膜下区（SVZ）神经干细胞（NSCs）增殖与Hes1、Hes5表达的影响，探讨其促进内源性NSCs增殖的作用机制。方法将80只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、依达拉奉组（依达组）、丹龙醒脑方组（丹龙组）。采用线栓法制备局灶性脑缺血再灌注模型，再灌注7 d后取缺血侧SVZ脑组织。Brdu免疫荧光法检测SVZ NSCs增殖，RT-qPCR、Western blot分别检测Hes1、Hes5 mRNA和蛋白的表达。结果与假手术组比较，其余各组Brdu阳性细胞率增加，Hes1、Hes5 mRNA及蛋白表达明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，依达组、丹龙组Brdu阳性细胞率明显增加， Hes1、Hes5 mRNA及蛋白表达水平明显增强（P＜0.01）；丹龙组Hes1 mRNA表达水平优于依达组（P＜0.01），其余指标均无明显差异。结论丹龙醒脑方可促进脑缺血再灌注后大鼠SVZ NSCs增殖，并上调Hes1、Hes5表达水平，其机制可能与激活Notch信号通路有关。
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DAPT对脑缺血再灌注损伤小鼠学习记忆的影响以及Notch信号通路的调节作用
目的 探讨DAPT对脑缺血再灌注损伤小鼠学习记忆能力的影响,以及Notch信号通路的调控作用.方法 140只健康雄性小鼠随机分为假手术组(sham组)、模型组(I/R组)和DAPT组,每组再分为3d、7d、14d 3个亚组.取材前1dY型迷宫检测小鼠学习记忆能力;然后TTC染色测定脑梗死面积;比色法测定脑组织超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量;光学显微镜下观察海马CA3区形态结构变化;免疫荧光检测Hes1阳性细胞;Western blotting检测Hes5蛋白表达变化并进行定量分析.结果 与sham组相比,I/R组和DAPT组小鼠学习记忆能力均下降,脑梗死面积增加,SOD活性降低,MDA含量升高(P＜0.05).与I/R组相比,DAPT组小鼠学习记忆能力提高,脑梗死面积减小,SOD活性升高,MDA含量降低(P＜0.05).光学显微镜下,sham组小鼠海马CA3区神经元结构未见异常;I/R组细胞水肿,染色较深,排列疏松,大量神经元缺失,出现核固缩现象;DAPT组细胞数量增加,染色变浅.与sham组相比,I/R组与DAPT组Hes1阳性细胞明显增多,Hes5蛋白表达增加;而DAPT各亚组较I/R各亚组Hes1阳性细胞减少,Hes5蛋白表达降低(P＜0.05).结论 DAPT对小鼠缺血再灌注损伤有改善作用,其作用机制可能与阻断Notch信号通路有关.
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体外培养胚胎神经干细胞的增殖及中药有效成分对其增殖能力的影响
[目的]探讨中药有效成分对神经干细胞(NSCs)增值能力的影响并探讨其作用机制.[方法] 从16天SD大鼠胚胎脑体外培养原代NSCs,增生并传代.用Neetin免疫细胞-化学染色(ICC)鉴定NSCs,用BrdU染色鉴定NSCs增生.限量稀释法观察了几种中药有效成分对NSCs增生的作用,如人参皂苷Rg1和黄芪皂苷(ASIV).[结果]不同剂量的人参皂苷Rg1和黄芪皂苷AS Ⅳ能促进神经干细胞的体外增殖.与对照组比较,Rg1和AS的3种剂量可使神经球生成数目增加(P<0.05或P<0.01).其中两种药物成分低剂量组比其他组效果更显著.Hes1,Hes5和细胞周期蛋白D1的实时定量逆转录-聚合酶链(RT-PCR)分析显示Rg1高剂量组的Hes1基因表达和AS高剂量组Hes5基因表达增长明显.同时,Rg1中剂量组的Hes5基因表达轻微增加(P>0.05).两药各剂量组的周期蛋白D1(CyclinD1)基因表达可见有增加,但无统计学意义(P>0.05).[结论]Rg1和ASⅣ可明显促进神经干细胞体外增殖,实时定量检测结果显示HeM、Hes5和周期蛋白D1与Rg1和AS促进神经干细胞增殖有一定关系.
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叶酸对体外缺氧新生大鼠神经干细胞Hes5基因表达的影响
目的:探讨叶酸对体外缺氧新生大鼠神经干细胞Hes5 mRNA、蛋白表达的影响.方法:分离培养24 h新生SD大鼠脑神经干细胞;将细胞分为4组:正常对照组、缺氧模型组、缺氧叶酸添加组、缺氧叶酸缺乏组;于增殖第3天将除正常对照组外的其他3组细胞进行缺氧培养,6h后取出,继续培养至第6天收集细胞;用台盼蓝染色计数缺氧损伤后的各组细胞密度;RT-PCR方法检测Hes5 mRNA表达;Western blot方法检测Hes5蛋白表达.结果:缺氧叶酸添加组细胞密度高于其他各组,缺氧叶酸缺乏组低,差异均有统计学意义(P<0.05);RT-PCR结果显示,缺氧叶酸添加组的Hes5 mRNA表达量高于其余3组,缺氧叶酸缺乏组表达少,各组间差异有统计学意义(P<0.05);Western blot检测表明,缺氧叶酸添加组Hes5蛋白表达高于其他各组,缺氧叶酸缺乏组Hes5蛋白表达量低,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:体外神经干细胞缺氧损伤造模成功;叶酸对缺氧损伤的神经于细胞增殖有促进作用,可为预防和治疗脑缺血缺氧损伤提供依据.
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紫草素对HaCaT细胞Notch-1信号通路的调节作用
目的 研究紫草素对HaCaT细胞抑制增殖的作用及其作用机制.方法 倒置显微镜下观察不同浓度紫草素(0、2、5、10、15μmol/L)作用后HaCaT细胞的形态学改变;MTT法检测紫草素对HaCaT细胞抑制增殖的作用;流式细胞术检测细胞凋亡率变化;Western blot法检测Notch-1、Jagged1和Hes5蛋白的表达情况.RT-PCR检测下游信号分子Hes1和Hes5的mRNA表达.结果 10μmol/L紫草素即可显著抑制HaCaT细胞的增殖,且随着浓度的增加,紫草素呈剂量依赖性地抑制HaCaT细胞的增殖(均P＜0.01).流式细胞术检测结果显示101μmol/L紫草素能够显著诱导HaCaT细胞凋亡(P＜0.01).Western bolt法检测结果显示,Notch-1、Jagged1和Hes5蛋白表达逐渐降低.RT-PCR法检测结果显示,Notch信号通路下游信号分子Hes1和Hes5的mRNA表达水平亦呈剂量依赖性降低.结论 紫草素呈剂量依赖性地抑制HaCaT细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,Notch-1信号通路在其中起了重要作用.
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黄芪甲苷对体外神经干细胞增殖作用影响的研究
目的 探讨黄芪甲苷(astragaloside,AS)对神经干细胞增殖的影响.方法 体外培养大鼠胎鼠神经干细胞,Nestin免疫化学染色鉴定 NSCs,BrdU标记鉴定NSCs增殖.BrdU标记免疫细胞化学染色检测神经干细胞增殖能力.实时定量 PCR技术探讨黄芪甲苷促进NSCs增殖的作用机制.结果 Nestin鉴定为阳性,Brdu标记亦呈阳性;BrdU标记结果表明,黄芪甲苷高、中、低剂量组NSCs的增殖率明显提高(P<0.05,P<0.01).实时定量PCR结果表明在诱导NSCs增殖过程中,黄芪甲苷高剂量组Hes5基因表达增加(P<0.05).结论 黄芪甲苷对NSCs增殖具有明显的诱导作用,其可能通过上调与细胞增殖相关基因Hes1、Hes5、cyclin D1表达而起作用,但也可能调节与其它增殖通路有关.
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当归补血汤协同肌源性干细胞移植促造血重建的研究:Notch2、Jagged2和Hes5在鼠脾脏中的表达及作用
目的 了解Notch2、Jagged2和Hes5在当归补血汤(Danggui Buxue Decoction,DBD)协同肌源性干细胞(Muscle-derived stem cells,MDSCs)移植鼠脾脏中的表达及其临床意义.方法 根据随机数字表将150只雌性昆明小鼠分成6组,于照射前1周分别给予6组不同剂量当归补血汤或生理盐水灌胃.在经8Gy 137Cs-γ射线照射后的小鼠尾静脉中移植骨髓细胞或肌源性干细胞.并于3周和8周末时采用实时定量PCR方法检测小鼠脾脏中Notch2、Jagged2和Hes5mRNA表达.结果 移植3周末,与照射组相比,各给药组Notch2、Jagged2mRNA及给药3组Hes5mRNA表达上调,给药1组和给药2组的Hes5mRNA表达下调,且组间具有统计学差异(Notch2,F=4.777,P=0.012;Jagged2,F=11.650,P=0.000;Hes5,F=23.229,P=0.000).移植8周末,与照射组相比,各给药组Notch2、Jagged2mRNA表达上调,Hes5mRNA表达下调,且仅Jagged2mRNA组间存在统计学差异(Notch2,F=2.979,P=0.056;Jagged2,F=18.796,P=0.000;Hes5,F=2.202,P=0.122).结论 在骨髓移植早期和晚期,以及MDSCs移植早期,Notch2和Jagged2均未参与B淋巴细胞的分化发育.Hes5在骨髓移植早期参与了脾脏中B淋巴细胞的发育调控.3倍剂量当归补血汤可在MDSCs移植早期通过调控Notch2及Jagged2来促进B淋巴细胞发育.
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dsRNA阻断大鼠骨髓源性神经干细胞Hes5表达的实验研究
目的观察外源性短双链RNA(dsRNA)在转录后水平即mRNA水平降低基因表达的效率,并对其影响因素进行初步探讨.方法将体外分离培养的大鼠骨髓基质细胞,通过由本实验室配制的特殊培养基诱导成神经干细胞,应用人工合成的dsRNA于不同浓度转染神经干细胞,Westem bloting检测dsRNA是否能阻断转录因子Hes5的表达,0.5%锥虫蓝法测定各浓度组中培养细胞活力.结果 200～300 nmol/L浓度的dsRNA能特异有效地阻断Hes5的表达,而50～200 nmo1/L浓度的dsRNA有利于干细胞存活.结论 dsRNA能在神经干细胞内启动RNA干扰作用,适宜浓度的dsRNA能在特异有效地阻断内源性基因的表达的同时,大限度地保持细胞活力.
关键词： 双链RNA Hes5 神经干细胞 骨髓源性 RNA干涉:免疫印迹
