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鱼腥草素钠及其与红霉素联用对产膜表皮葡萄球菌luxS,agr/RNAⅢ影响的研究
细菌的群体感应及特异基因表达调控在细菌生物被膜形成中有十分重要的作用.luxS,agr均是表皮葡萄球菌群体感应调控中的关键基因,RNAⅢ是agr系统的效应器分子.为了评估鱼腥草素钠及其与红霉素联用对产膜表皮葡萄球菌转录水平的影响,采用连续稀释法测定鱼腥草素钠、红霉素、万古霉素对表皮葡萄球菌的MIC;荧光定量PCR测定鱼腥草素钠及其与红霉素联用、万古霉素、红霉素等对表皮葡萄球菌作用后不同时间段luxS,agr/RNAⅢ的转录水平.结果表明1/2MIC,1/4MIC鱼腥草素钠,1/2MIC鱼腥草素钠+1/2MIC红霉素,1/4MIC鱼腥草素钠+1/4MIC红霉素,1/8MIC鱼腥草素钠+1/8MIC红霉素等在作用于ATCC 35984伊始,就可迅速上调luxS 的表达,与阴性对照相比,存在显著差异(P<0.05);在作用6,12,48 h后,鱼腥草素钠依然存在对luxS的上调作用.鱼腥草素钠在MIC,1/2MIC浓度时对agr表达均有显著下调作用(P<0.05),1/2MIC鱼腥草素钠与1/2MIC红霉素联用、1/4 MIC鱼腥草素钠与1/4MIC红霉素联用,在作用6,12,24 h等时间段对agr表达的下调作用也很显著(P<0.05).鱼腥草素钠在MIC浓度时,对RNAⅢ表达亦有显著下调作用(P<0.05),1/2MIC鱼腥草素钠与1/2MIC红霉素联用对RNAⅢ表达的下调效果也很显著(P<0.05).提示鱼腥草素钠及其与红霉素联用,可以迅速上调表皮葡萄球菌luxS转录水平的表达,在特定浓度下可下调agr/RNAⅢ的表达,具有抑制表皮葡萄球菌生物被膜菌之间的相互黏附聚集、抑制膜内营养和输水通道的形成、阻止膜内细菌脱离、并抑制细菌外毒素形成等作用的可能.
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细菌群体感应信号分子与宿主免疫相互调节
近年,有关细菌与宿主相互作用的研究表明,细菌分泌的群体感应信号(quorum sensing signal,QSS)分子是调节宿主细胞信号传递的重要信使.细菌分泌的群体感应信号分子种类繁多,经常干扰宿主哺乳动物细胞对细菌的免疫应答.通过抑制哺乳动物细胞免疫应答或炎症反应,QSS分子阻碍细胞免疫信号通路,终致使细胞凋亡或坏死.不同种类的QSS分子具有不同的性质,某些信号分子能够穿过细胞膜,自由出入细胞;而有些则需要与膜上的特异受体结合后才能进出细胞.但QSS分子究竟如何干扰宿主免疫防御,宿主细胞能否识别细菌QSS的保守结构抵御细菌感染,还有待于进一步深入研究.本文针对QSS分子与宿主哺乳细胞之间相互作用的相关研究进行综述.
关键词： 群体感应 N-酰化高丝氨酸内酯 免疫调节 -
群体感应分子Farnesol联合CSA对白色念珠菌生物膜作用的实验研究
目的 探讨群体感应分子法尼醇(Farnesol)联合钙调神经磷酸酶抑制剂环孢菌素A(CSA)对白色念珠菌的生物膜形成、形态转换、生长及活性、耐药性、凋亡反应和氧化应激反应的作用及其相关机制. 方法 体外构建生物膜状态白色念珠菌,分别经CSA、Farnesol、Farnesol联合CSA处理后,用qRT-PCR法检测生物膜状态白色念珠菌中生物膜形成过程中的相关基因CDR1、CEK1、CPH1、EFG1、ERG11、GPR1、HAT1、MDR1、HWP1、ALS3、TUP1 mRNA表达水平的变化. 结果 白色念珠菌均具有不同程度的产膜能力,且单用CSA、Farnesol抗真菌药物对白色念珠菌生物膜的抑制率很低,而联合使用时,受试菌生物膜生长状态受到明显抑制.从临床血流感染中分离获得1株强产生物被膜白色念珠菌,命名为CA NX05;经不同药物组处理后生物膜状态白色念珠菌中的生物膜菌丝形成相关基因CEK1、CPH1、EFG1、ERG11、GPR1、HAT1、HWP1、ALS3、TUP1与其耐药性相关基因CDR1、MDR1的mRNA表达量与空白处理组相比均显著降低(FCEK1=15.725,FCPH1=6.230,FEFG.1=87.817,FERG11=17.527,FGPR1=21.793,FHAT1=65.318,FHWP1 =550.531,FALS3=10.514,FTUP1=16.580,FCDR1=8.089,FMDR1 =7.228;F＞P,P＜0.05). 结论 群体感应分子Farnesol联合CSA处理较CSA及Farnesol处理能更有效地抑制白色念珠菌生物膜的形成,从而使其对抗真菌药物的敏感性增加,为临床合理使用抗真菌药物提供了科学导向.
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铜绿假单胞菌lasR rhlR基因缺陷对大鼠慢性肺部感染的影响
目的 观察铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)PA01野生型及群体感应(quo rum sensing,QS)系统的lasR rhlR基因缺陷型Pa菌株人工生物被膜致病性的差异,及Qs系统的lasR rhlR基因在Pa生物被膜感染致病过程中的地位.方法 从大鼠支气管内直接予以Pa(菌种为PAO1野生型和PAO1 lasR rhlR基因缺陷型)海藻酸盐微菌粒悬液(109 CFU/ml)攻击,建立PAO1野生型及Qs系统的lasR rhlR基因缺陷型菌株人工生物被膜肺部感染动物模型.分别于感染1周和2周后评估各组大鼠的肺部病理学、细菌学及细胞因子(IL-4、IL-10)反应的变化.结果 感染1周和2周后,PA01野生型组的肺部病理学改变和细菌学改变均明显重于PAO1 lasR rhlR基因缺陷组(P＜0.001);感染1周后PAO1野生型组肺部的IL-4、IL-10水平都高于PAO1 lasR rhlR基因缺陷组(P＜0.01,P＜0.05);2周后PAO1野生型组肺部IL-10水平进一步升高(P＜0.01),明显高于PAO1 lasR rhlR基因缺陷组(P＜0.001).结论 PAO1野生型组在病程中引起持久和严重的肺部感染,激发了TH2样免疫反应,而PAO1 lasR rhlR基因缺陷组的肺部病变明显轻于PAO1组,说明Qs系统的lasR rhlR基因在Pa肺部感染的建立及慢性化发展过程中发挥着重要作用.
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LuxS基因缺失的变形链球菌突变株的构建及鉴定
目的 通过同源重组法构建LuxS基因缺失的变形链球菌(Streptococcus mutans)突变株.方法 运用基因同源重组方法将红霉素抗性基因(Eymr)连接到PCR扩增LuxS基因两端区域产生的2个基因片段之间,并共同插入到pUCl9载体的多克隆位点中,构建出带红霉素抗性标志的缺失突变载体pUCluxKO.将突变载体转化到含完整LuxS基因的突变受体变形链球菌标准株中,红霉素筛选出LuxS基因缺失的变形链球菌突变株,并经PCR、生物荧光检测及DNA测序鉴定.结果 构建的突变载体经限制性内切核酸酶酶切分析显示,产生的条带与设计结果完全一致.PCR方法扩增突变株LuxS和Eymr基因显示,LuxS基因已被完整敲除掉,经生物荧光检测,突变株不能诱导哈氏弧菌(Vibrio harveyi)BBl70的生物发光,说明不能产生信号分子AI-2(autoinducer-2).DNA测序证实筛选得到了LuxS基因缺失的变形链球菌突变株.连续传代培养后证实,变形链球菌LuxS基因突变株具有良好的稳定性.结论 成功构建出LuxS基因缺失的变形链球菌突变株,为研究LuxS基因对变形链球菌致龋毒力的影响奠定了基础.
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慢性伤口细菌生物膜相关微环境的研究进展
慢性伤口是指伤口经历4周临床治疗后,无法及时有效地按照正常程序愈合的伤口[1],主要包括糖尿病足溃疡、下肢动静脉溃疡和压疮等,常表现为持续过度的炎症反应、反复感染、耐药性细菌生物膜、表皮细胞对修复刺激无应答等特点.伤口愈合是一个极其复杂的过程,伤口微环境在其中扮演着重要角色.研究[2]发现,细菌生物膜是慢性伤口无法愈合的重要原因,细菌生物膜自身形成的微环境以及作用于伤口所引发的微环境改变,均会对伤口的愈合产生极为不利的影响.理解慢性伤口细菌生物膜相关微环境的变化,将使慢性伤口患者获益.
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肠道致病菌群体感应研究进展
群体感应(quorum sensing,QS)是细菌细胞之间交流的重要机制,可调控基因表达.QS使细菌以多细胞实体行使单个细胞无法完成的功能,调控细菌的多种活动.根据细菌合成的信号分子和感应机制不同,QS系统主要分为三种.肠道致病菌多拥有几种QS系统,但一些QS系统的确切作用尚不十分明了.替代抗菌素杀死致病菌,抑制QS信号及毒力基因表达代表了抗微生物治疗的新靶位.某种程度上,肠道致病菌感染后,个体病程、病情的差异就是由于个体肠道信号传递分子水平的差异,导致了QS活性及其调控的基因转录不同所致.
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铜绿假单胞菌群体感应抑制剂研究进展
铜绿假单胞菌是一种条件致病菌,其严重的耐药问题使得传统的抗生素治疗面临挑战.群体感应是一种细胞密度依赖的基因表达现象,控制着铜绿假单胞菌的毒力因子表达和生物膜形成.抑制群体感应能够降低铜绿假单胞菌的毒力作用,且对细菌无选择性压力,不易产生耐药性,是一种潜在的抗感染治疗策略.本文将对近年来铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的研究进展作一综述.
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群体感应系统缺陷对大鼠铜绿假单胞菌慢性肺部感染的影响
目的 观察铜绿假单胞菌(PAE)PAEO1野生型及群体感应(Qs)系统的lasⅠ rhⅡ、lasR rhlR基因缺陷型PAE菌株人工生物膜致病性的差异,了解QS系统的lasI rhⅡ和lasR rhlR基因组在PAE生物膜感染致病过程中的地位.方法 从大鼠支气管内直接予以PAE海藻酸盐微菌粒悬液(1×109 CFU/ml)攻击,建立PAEO1野生型及Qs系统的las I rh Ⅱ和lasR rhlR基因缺陷型菌株人工生物膜肺部感染动物模型;于感染2周后评估各组大鼠的肺部病理学、细菌学及细胞因子白介素10(IL-10)水平的变化.结果 感染2周后,PAEO1野生型组的肺部病理学改变和细菌学改变均明显重于PAEO1 las Ⅰ rhⅡ和lasR rhlR基因缺陷组(P＜0.01);PAEO1野生型组肺部IL-10水平明显高于PAEO1 lasR rhI R基因缺陷型组(P＜0.01)和PAEO1 las I rhⅡ基因缺陷型组(P＜0.01).结论 PAEO1野生型菌株组在病程中引起较持久和严重的肺部感染,激发了较高的IL-10反应,而PAEO1 lasI rhⅡ基因缺陷组、PAEO1 lasR rhlR基因缺陷组的肺部病变明显轻于PAEO1野生型组,表明QS系统在PAE肺部感染的建立及慢性化发展过程中发挥着重要作用.
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铜绿假单胞菌群体感应系统调控生物膜形成与AmpC基因表达的研究
目的 研究铜绿假单胞菌(PAE)标准菌株PAO-1与不同的群体感应(QS)系统缺陷菌株的生物膜形态和生物膜状态下产酶基因AmpC的表达差异.方法改良的平板法建立PAE生物膜模型,银染法鉴定生物膜生成,观察PAO-1和不同突变菌株形成生物膜的形态;抗菌药物诱导生物膜菌AmpC基因表达,采用实时荧光定量PCR方法测定PAO1、QS系统缺陷菌株的AmpC基因表达水平.结果 PAO-1和突变菌株PDO100形成的生物膜较厚、层次多、致密,而突变菌株PAO-JP1和PAO-MW1形成的生物膜较少,分布不均匀;在生物膜状态运用抗菌药物诱导,QS系统缺陷菌株PAO-MW1、PAO-JP1的AmpC基因表达水平均较PAO1和缺陷菌株PDO100低,差异有统计学意义(P<0.05).结论 PAE生物膜形成和AmpC基因诱导表达可能与las QS系统发挥的直接或间接调控作用有关,而rhl QS系统较少或是未参与生物膜形成和AmpC基因表达调控.
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铜绿假单胞菌群体感应系统中lasR/rhlR基因缺陷对生物膜形成的影响
目的 研究lasR/rhlR基因缺陷对铜绿假单胞菌(PAE)体外生物膜形成的影响.方法采用生理盐水-吸痰管系统进行铜绿假单胞菌体外生物膜的培养,于3 d后用扫描电子显微镜观察PAEO1野生型、PAEO1 lasR、PAEO1 rhlR、PAEO1 lasR rhlR基因缺陷型菌株形成生物膜的情况.结果 3 d后PAEO1野生型可形成较厚、有孔状通道的成熟生物膜结构,PAEO1 lasR、PAEO1 rhlR、PAEO1 lasR rhlR基因缺陷型黏附、聚集形成明显稀薄的早期生物膜结构.结论 lasR rhlR基因缺陷可影响铜绿假单胞菌体外形成生物膜的能力.
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美罗培南对lasR/rhlR基因缺陷型铜绿假单胞菌早期生物膜的作用
目的 研究美罗培南对铜绿假单胞菌PAEO1野生型及其PAEO1 lasR、PAEO1 rhlR、PAEO1 lasR rhlR基因缺陷型菌株早期生物膜作用的差异.方法 采用生理盐水-吸痰管系统进行铜绿假单胞菌PAEO1野生型、PAEO1 lasR、PAEO1 rhlR、PAEO1 lasR rhlR基因缺陷型菌株体外生物膜的培养,3 d后以26μg/ml的美罗培南溶液作用24 h,用扫描电子显微镜观察生物膜的情况.结果 3 d后PAEOI野生型可形成较厚、有孔状通道的成熟生物膜结构,PAEO1 lasR、PAEO1 rhlR、PAEO1 lasR rhlR基因缺陷型黏附、聚集形成明显稀薄的早期生物膜结构;经过26μg/ml的美罗培南溶液作用24 h后,PAEO1野生型的生物膜结构明显稀薄,PAEO1 lasR、PAEO1 rhlR和PAEO1 lasR rhlR基因缺陷型的生物膜结构基本被破坏,其余下散在碎片状结构.结论 lasR/rhlR基因可影响铜绿假单胞菌早期生物膜的形成及其对美罗培南的敏感性.
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金黄色葡萄球菌生物膜形成与调控的研究进展
金黄色葡萄球菌是社区获得性及医院感染常见病原体.随着医用内植物广泛使用和创面感染患者增多,金黄色葡萄球菌导致的生物膜相关感染发病率逐年攀升;本研究回顾近年来金黄色葡萄球菌生物膜形成与调控的研究进展,简述细菌从定植、分泌胞外多聚物到生物膜结构成熟,直至解离使感染播散的研究前沿,特别介绍了生物膜受自身信号系统和外界环境调节的分子机制;分析表明,探讨生物膜形成与调控的分子机制对寻找特异性干预靶点、预防和治疗临床相关感染具有重要意义.
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细菌群体感应系统研究进展
细菌分泌一种或者几种小分子量的化学信号分子促进细菌个体间相互交流,协调群体行为,该现象称为群体感应(quorum sensing,Qs).细菌利用信号分子感知周围环境中自身或其他细菌的细胞群体密度的变化,并且信号分子随着群体密度的增加而增加,当群体密度达到一定阈值时,信号分子将启动菌体中特定基因的表达,改变和协调细胞之间的行为,呈现某种生理特性,从而实现单个细菌无法完成的某些生理功能和调节机制.
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群体感应与细菌毒力
细菌产生自诱导物质(autoinducers,AIs)作为细菌间相互联系的信号分子,其浓度随着细菌的增殖而升高.由于该信号分子能自由通过细胞膜,因此细胞内外的浓度相近.当该信号分子浓度达到一定浓度,就激活细菌胞内的受体,从而改变基因表达,这种现象就是群体感应(quorum sensing,QS).
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粪肠球菌生物膜形成过程中群体感应相关基因的表达研究
目的 研究粪肠球菌生物膜形成过程中群体感应相关基因的表达情况,探讨其与生物膜形成的相关性.方法 体外建立粪肠球菌生物膜模型,激光共聚焦显微镜观察6、12、24、48 h生物膜的形成情况,结晶紫染色观察粪肠球菌生物膜形成的量,提取各时期生物膜细菌样本,通过实时荧光定量PCR对粪肠球菌生物膜形成过程中群体感应相关基因fsrB、明胶酶和丝氨酸蛋白酶(serine protease,sprE)的表达进行检测.结果 粪肠球菌生物膜细菌分布不均匀,由死细菌和活细菌组成,6h时粪肠球菌生物膜细菌初始黏附,24 h时生物膜基本成熟；24 h内粪肠球菌生物膜的量随时间增加而增大,在培养0、6、12、24 h时生物膜的量(A值)分别为0.00±0.00、1.09±0.13、2.10 ±0.79及3.30 ±0.13,两两比较差异均有统计学意义(P ＜0.05)；48 h生物膜的量(3.51±0.01)与24 h生物膜的量相比略有增加,但差异无统计学意义.粪肠球菌生物膜形成过程中群体感应相关基因fsrB在0、6、12、24 h时的表达量(2-△CT值)逐渐增大,分别为9.98 ±0.46、23.45±1.13、47.30±2.49及331.30±2.18,两两比较差异均有统计学意义(P ＜0.05)；48 h粪肠球菌生物膜内fsrB的表达量(11.0±0.39)与0h相比差异无统计学意义.明胶酶在0、6、12、24 h时的表达量(2-△CT值)逐渐增大,分别为6.54±0.73、14.26±1.24、37.47±2.35及264.80±5.10,两两比较差异均有统计学意义(P ＜0.05)；48 h粪肠球菌生物膜内明胶酶的表达量(9.09±0.81)与0h相比差异无统计学意义.sprE在0、6、12、24 h时的表达量(2-△CT值)逐渐增大,分别为7.72±0.74、21.15±0.96、49.87±3.18及441.89±7.74,两两比较差异有统计学意义(P＜0.05)；48 h粪肠球菌生物膜内sprE的表达量(11.04± 1.74)与0h相比差异无统计学意义.结论 粪肠球菌6h初始黏附,24h生物膜基本成熟,群体感应相关基因fsrB、明胶酶和sprE在粪肠球菌生物膜6～24h即初始黏附、形成及发展期起重要作用.
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氨溴索对铜绿假单胞菌密度感应缺陷株生物膜细菌活力和黏附作用的影响
目的 研究氨溴索对铜绿假单胞菌野生株PAO1及密度感应缺陷株(ΔlasI ΔrhlI基因缺陷)生物膜(BF)细菌活力及早期黏附的影响.方法 利用平板计数法测定不同浓度(0、1.875、3.75mg/ml)氨溴索对PAO1菌株、ΔlasI ΔrhlI菌株生物膜菌落的清除效应；荧光多功能酶标仪检测不同浓度氨溴索作用后PAO1菌株、ΔlasI ΔrhlI菌株的荧光强度,计算黏附率以反映干预对细菌黏附的影响.结果 氨溴索作用后,两种菌株的活菌生存率和黏附率均出现下降,ΔlasIΔrhlI株活菌生存率较PAO1株下降更明显(P＜0.05),而PAO1株黏附率较ΔlasI ΔrhlI株下降更明显(P＜0.05).结论 氨溴索具有拮抗密度感应系统的作用,可用于抗细菌生物膜活力,为难治性铜绿假单胞菌感染的治疗提供了新思路.
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粪肠球菌群体感应系统luxS基因的研究
目的 研究粪肠球菌群体感应系统luxS基因的功能并体外合成AI-2信号分子,为研究粪肠球菌LuxS/AI-2依赖的群体感应系统提供依据.方法 以哈氏弧菌BB170作为报告菌株,检测3株粪肠球菌培养上清的AI-2活性,然后从粪肠球菌中扩增出luxS和pfs基因,测序和比对氨基酸序列,并将两基因插入到pGEX-4T-1表达载体中,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中实现表达与纯化,进而以S-腺苷高半胱氨酸为底物、纯化的蛋白或构建的大肠杆菌菌体蛋白为反应酶,体外合成AI-2.结果 3株粪肠球菌均能够分泌有活性的AI-2信号分子;LuxS蛋白序列分析发现其与哈氏弧菌、沙门菌、大肠杆菌具有高度同源性;SAH均可以与纯化的蛋白或构建的大肠杆菌菌体蛋白合成出有活性的AI-2分子.结论 粪肠球菌存在LuxS/AI-2依赖的群体感应系统,AI-2的产生依赖于luxS基因.
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以病原菌群体感应系统为靶标的新型抗菌药物的研究进展
近年来,日益严重的细菌耐药性成为全球关注的焦点,尤其是南亚发现的新型"超级细菌"几乎对绝大多数抗生素都具有抗性,在世界范围内引起了恐慌.对病原菌致病机制的研究发现,许多病原菌的致病机制都依赖细菌群体感应系统的调节和控制.筛选高效的群体感应抑制剂有望成为解决细菌感染以及耐药性问题的一个有效途径.本文主要阐述了细菌群体感应信号调控系统、群体感应抑制因子体外筛选模型及体内动物模型评价,群体感应抑制因子的研究近况等内容.
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致病菌生物被膜形成的调节机制及潜在的药物靶标
自然界的细菌群落往往形成生物被膜.生物被膜的形成是一个连续而复杂的过程,受到多种因素的调控.现在研究得比较清楚的是细菌双组分系统和群体感应系统.生物被膜对多种病原菌的毒力有重要影响.因此,针对细菌生物被膜形成过程中的关键因子设计药物具有重要意义,可能发现全新的治疗方法.
