首页 > 文献资料
-
黄芪多糖口服吸收促进剂的研究
该实验利用黄芪多糖中引入的仲氨基与FITC中氰基发生亲核反应,得到FITC荧光标记的黄芪多糖,并采用Caco-2细胞模型评价了低相对分子质量壳聚糖和鱼精蛋白对黄芪多糖的吸收促进作用.结果表明该荧光标记方法稳定性好,灵敏度高;低相对分子质量壳聚糖和鱼精蛋白对细胞毒性作用均较小;2种吸收促进剂对黄芪多糖的吸收均具有一定的促进作用,同时吸收促进剂的比例越大时,作用越明显,低相对分子质量壳聚糖的作用略强于鱼精蛋白.实验前后细胞跨膜电阻(TEER)的变化表明其作用机制可能是吸收促进剂能暂时打开细胞间的紧密连接,增加了膜的流动性,从而提高药物的透过性.
关键词： 黄芪多糖 FITC Caco-2细胞模型 吸收促进剂 -
应用链霉亲和素-生物素偶联FITC法检测肠道病毒71型方法学实验探讨
手足口病是由多种肠道毒引起的传染病,多发生于婴幼儿.由于其主要临床表现是发热和手、足、口腔等部位出现疱疹,因此被称为手足口病.
-
用酶解法制备壳寡糖及其对机体免疫功能的调节作用
目的:研究本课题组酶解制备的主要含3-7聚合度壳寡糖(COS)对机体免疫功能的调节作用.方法:利用本课题组分离的高活性壳聚糖酶通过酶水解法制备壳寡糖,HPLC法对壳寡糖的成分进行鉴定,并用异硫氰酸荧光素(FITC)将壳寡糖进行荧光标记得到FITC-COS,研究小鼠腹腔巨噬细胞对壳寡糖的吞噬作用及其与Toll样受体4(TLR4)的关系,进一步研究了不同浓度壳寡糖对小鼠腹腔巨噬细胞的增殖,吞噬中性红能力及分泌TNF-α能力的影响,并对小鼠灌胃不同剂量的壳寡糖,研究了壳寡糖对小鼠血清IgG和IgM含量及小鼠胸腺、脾脏指数的影响.结果:HPLC分析结果显示壳聚糖酶水解法制备的COS主要为3-7单糖聚合度的寡糖.将FITC-COS作用于小鼠腹腔巨噬细胞不同时间后,荧光显微镜观察结果表明巨噬细胞能够吞噬COS,随着时间的延长吞噬COS的量增加,TLR4单克隆抗体预处理巨噬细胞l小时后再加入FITC-COS,巨噬细胞对COS的吞噬作用几乎完全被抑制.COS被巨噬细胞吞噬后可显著增强巨噬细胞的吞噬功能,刺激巨噬细胞分泌TNF-α.体内研究结果表明小鼠灌胃COS能够显著增加小鼠的脾脏指数,增加血清中IgG的含量,对胸腺指数和血清中IgM的含量没有显著影响.结论:壳寡糖(3-7聚合度)能够被巨噬细胞吞噬,进而激活巨噬细胞,具有较好的体外、体内免疫调节功能,壳寡糖对巨噬细胞的激活是通过细胞表面TLR4受体介导的.
-
自组装海藻酸钠纳米粒在正常小鼠体内分布的研究
目的:研究自组装海藻酸纳米粒(sSAN)在小鼠的体内分布情况,探讨sSAN作为维生素D3药物栽体的可行性.方法:用异硫氰基荧光素(FITC)标记sSAN和负载维生素D3的海藻酸纳米粒(sSAN-VD3),将两种标记好的纳米粒分别给予小鼠灌胃,在不同的时间将小鼠处死,分别取血清和肝、肺、肾、脾,各脏器经匀浆后,用荧光分光光度计测定其荧光强度,计算血清和各组织中sSAN和sSAN-VD3的含量.结果:经灌胃给药后在小鼠血清、肝、肾、肺中均检测到上述药物,而脾中没有检测到.给药后0.5h和1h.sSAN-VD3-FITC及sSAN-FITC在肝、肺和血清中的含量持续增加,以1h时达峰值浓度,给药2h、4h后,两种制荆的浓度逐渐降低.在肾脏中的舍量随着时间的延长逐渐增加,于2h时达峰值浓度,随后逐渐降低.结论:sSAN及sSAN-VD3经小鼠灌胃给药后均可吸收入血,而且口服吸收后在肝、肺、肾和血清中均有一定的分布.
-
马钱子碱固体脂质纳米粒在小鼠体内的组织分布
目的 研究马钱子碱固体脂质纳米粒在小鼠体内的组织分布.方法 制备马钱子碱固体脂质纳米粒,以异硫氰酸荧光素(FITC)标记.小鼠静脉注射纳米粒混悬液,HPLC法测定各组织(心、肝、脾、肺、肾、骨)中马钱子碱含有量,分析纳米粒体内组织分布,再采用荧光内窥式激光共聚焦显微镜作进一步检测.结果 马钱子碱在小鼠肝脏中的相对摄取率(Re)高(1.64).纳米粒在各组织中的靶向效率(Te)均大于1,对肝脏的选择性明显强于马钱子碱溶液.随着时间延长,FITC标记的纳米粒由细胞外逐渐分布到细胞内,数量亦逐渐增加,并呈正相关性.结论 马钱子碱制成固体脂质纳米粒后,可提高其在小鼠肝组织中的分布,具有较明显的肝靶向性.
-
c-myc反义寡核苷酸在粘液表皮样癌MEC-1细胞中的分布
目的观察硫代修饰型c-myc反义寡核苷酸直接转染粘液表皮样癌MEC-1细胞后在细胞内的分布,为反义寡核苷酸抑制粘液表皮样癌细胞增殖和抑制基因表达提供形态学依据.方法FITC标记硫代磷酸化修饰的c-myc反义寡核苷酸,转染培养的粘液表皮样癌MEC-1细胞,在激光共聚焦显微镜下观察转染细胞及细胞内的时相分布.结果硫代修饰型c-myc反义寡核苷酸直接转染粘液表皮样癌MEC-1细胞后12h,细胞胞浆内即有较强的荧光分布;转染MEC-1细胞24h细胞胞浆荧光达高峰;转染48h细胞胞浆荧光减弱;转染72h细胞胞浆荧光进一步减弱,但未消失.结论硫代修饰型c-myc反义寡核苷酸主要分布于细胞胞浆,其作用可能是通过阻断mRNA的翻译而实现.
-
Caco-2细胞对负载维生素D3的纳米粒的摄入研究
目的 研究Caco-2 细胞对负载维生素D3的、FITC标记的自组装海藻酸钠纳米粒(sSAN-VD3-FITC)的摄取及其影响因素,分析其通过Caco-2细胞吸收模型的跨膜转运特点.方法 ①采用激光共聚焦显微镜检测sSAN-VD3-FITC的摄取,分析作用时间的影响;② 采用Caco-2细胞模型研究其跨膜转运,检测接受液的荧光强度,观察其转运特点.计算表观渗透系数(Papp),分析作用时间对转运的影响.结果 ① sSAN-VD3-FITC作用1 h后细胞质内出现荧光颗粒,4 h后荧光强度增强.②转运接受液的荧光强度、累积转运量较空白对照组均明显升高( P <0.05),均存在时间依赖性( P <0.05).Papp较稳定,但随作用时间的延长逐渐减小.结论 sSAN-VD3可被Caco-2细胞摄取,并受作用时间的影响;可通过Caco-2细胞模型进行跨膜转运,并存在时间依赖性,表明其可经胃肠道给药吸收入血.
-
力达霉素辅基蛋白荧光衍生物的制备
目的:建立力达霉素辅基蛋白荧光衍生化的方法.方法:采用FITC和9-氨基芴分别对力达霉素辅基蛋白的氨基端和羧基端进行衍生化.偶联产物用Sephadex G15葡聚糖凝胶柱和半透膜分离纯化,并用MALDI-TOF质谱检测连接效果.结果:在本试验条件下,力达霉素辅基蛋白分别与FITC和9-氨基芴成功偶联,偶联连接分子比均为1:1.结论:此法简单和准确,可用于制备力达霉素辅基蛋白荧光衍生物.
-
DNA桥接的Hela细胞靶向组装型树状大分子的制备
目的:设计一种叶酸受体介导的经DNA桥接的靶向组装型聚酰胺-胺树状大分子,探讨靶向树状大分子库及功能树状大分子库经DNA组合可行性.方法:将第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5 PAMAM)部分酰化后,分2组分别连接叶酸(FA)以及异硫氰酸荧光素(FITC),再分别与经EDC活化的互补单链DNA相连,后完成DNA杂交合成终产物,荧光显微镜观察其对HELA细胞的靶向性.结果:(1)G5 PAMAM的酰化按投料比获得末端酰化率约为70％的PAMAM.(2)氢谱显示FA和FITC与部分酰化G5 PAMAM连接后,产物出现相应的苯环氢,通过积分计算出每个部分酰化的G5 PAMAM连接约5个FA或2.5个FITC,且经TLC检测,产物经葡聚糖凝胶层析和透析后可达色谱纯.(3)经DNA桥接的PAMAM-FA及PAMAM-FITC加入HELA细胞后相对于没有连接叶酸的桥接产物荧光显微镜在细胞内可观察到明显的荧光,并且FA可竞争性阻断.结论:由DNA桥接的肿瘤靶向组装型树状大分子具一定的可行性.
-
一种新型鱼病口服疫苗的研制和示踪研究
目的研制一种新型的鱼病口服疫苗,并进行鱼体内的示踪研究.方法通过物理方法(油/水/油)制备包裹模式蛋白的PLGA微粒;将FITC标记蛋白与PLGA结合,观察该新型疫苗在鱼体内的消化过程;将特异性尘螨Der f1蛋白结合PLGA口服给予鱼,不包裹PLGA的Der f1蛋白作为对照,运用ELISA方法测定该疫苗给予后不同时间在血液中的含量.结果PLGA包裹的荧光标记蛋白在消化道1 h内即可被鱼小肠上皮细胞吸收,24 h小肠消化道内残余很少.包裹特异性尘螨Der f1蛋白的PLGA微粒给予鱼1 h后血液中特异性蛋白浓度高,2、4和24 h后仍在血液中保持一定浓度.而不给药对照或Der f1直接给予则在鱼血液中不能测到该特异性蛋白.结论以PLGA为佐剂的蛋白鱼病疫苗可通过消化道吸收入血,是一种新型的鱼病口服疫苗给药系统.
-
量子点对人外周血T淋巴细胞CD4的标记
目的:运用三种量子点标记方法对人外周血T淋巴细胞膜上的CD4分子进行标记,分析三种标记方法之间的差异,并比较量子点与FITC的荧光标记效果.方法:分别采用Abl/QDs-IgG法、Biotin Abl/QDs-SA法、Abl/Biotin Ab2/QDs-SA法标记经多聚甲醛固定后的人外周血T淋巴细胞膜上的CD4分子;采用Abl/QDs-IgG法标记人外周血中活态T淋巴细胞膜上的CD4分子;用FITC直接荧光标记法标记CD4分子.结果:发现采用Biotin Abl/QDs-SA法,量子点会在细胞膜上出现较明显的团聚,采用Abl/QDs-IgG法、Abl/Biotin Ab2/QDs-SA法,量子点在细胞膜上分布较均匀;采用Abl/QDs-IgG法、Abl/Biotin Ab2/QDs-SA法的标记效果较接近活态细胞量子点的分布状态,且Abl/Biotin Ab2/QDs-SA法荧光强度强;Abl/QDs-IgG法、Biotin Abl/QDs-SA法荧光强度相差不大(P>0.05),但较Abl/Biotin Ab2/QDs-SA法稍弱.结论:Abl/QDs-IgG法较适合用于标记人外周血淋巴细胞上的CD4,且标记出来的效果很接近活细胞状态.
-
一种高效FITC标记LPS方法的建立及应用
目的 探索一种高效的荧光素示踪内毒素(lipopolysaccharide,LPS)的方法.方法 将LPS解聚为单体后,加入表面活性剂,在37℃中性溶液中用FITC标记LPS 18 h,通过分子截留技术将小分子游离的FITC及其他杂质从FITC-LPS中除去,并用荧光分光光度计分别测定标记反应液和纯化后的FITC-LPS溶液的荧光值,将两者进行比较,测定荧光标记率.结果 本方法标记的FITC-LPS在激光共聚焦显微镜下能进行良好示踪.经荧光分光光度计检测其标记率为LPS:FITC=1:33.13(物质的量比值).结论 利用表面活性剂与超滤纯化相结合对LPS进行FITC标记的方法较传统方法效率高,操作简单可靠,为医药学实验中示踪LPS提供了一条有效的途径.
-
建立非均衡竞争叶酸定量测定的化学发光免疫分析法
目的 制备抗人叶酸(FA)抗血清并应用异硫氰酸荧光素(FITC)系统开发新型非均衡竞争技术,建立可常规应用的定量检测血清FA的化学发光免疫分析(CLIA)法.方法 FITC-FA类似物、FA抗体-HRP依次加入包被有抗FITC抗体的化学发光板,形成FITC抗体-FITC-FA类似物-FA抗体-HRP的免疫反应复合物;并进行方法学评价,同时与非FITC检测系统及罗氏化学发光免疫分析系统检测结果进行比较.结果 成功制备FA抗血清并建立基于FITC系统的非均衡竞争CLIA;经方法学评价,自研法的线性相关系数绝对值大于0.990 0,灵敏度1.21 nmol/L,线性范围1.21～38.80 nmol/L,批内变异系数小于5％,自研法定量检测性能优于非FITC系统;与罗氏检测系统结果有较好相关性(R=0.908 1).结论 建立的非均衡竞争定量检测血清FA的CLIA法,具有良好的检测灵敏度与特异性,可应用于常规检测.
-
两种用FITC标记红桂木凝集素方法的比较
目的:红桂木凝集素(Artocarpus lingnanensis lectin,ALL)与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联方法的探究.方法:分别采用透析法和固化法使FITC与红桂木凝集素偶联,检测偶联物的F/P值.结果:固相化法的F/P值达1.02,其它方法F/P值约为0.758.结论:采用固化法使FITC标记红桂木凝集素,实验重复性较好,方法稳定可靠,且可获得较高偶联率的红桂木凝集素偶联异硫氰酸荧光素(ALL-FITC)利于后续实验研究.
-
HIV-1整合酶真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达和定位
目的：构建重组基因表达载体pcDNA6/V5-HisA-IN并观察其在Hela细胞中的表达．对HIV-1整合酶表达以后在细胞里的定位情况进行研究．方法通过 PCR扩增和定向克隆技术构建重组真核表达载体pcDNA6/V5-HisA-IN．以Lipofectamine2000介导转染Hela细胞．细胞用4%的多聚甲醛固定以后，经过PI对细胞核染色，整合酶抗体跟整合酶反应以后，用FITC标记的二抗进行孵育，用共聚焦显微镜观测整合酶在细胞中的表达情况．结果经过定向克隆和测序鉴定证实，重组真核表达载体pcDNA6/V5-HisA-IN构建成功．免疫荧光实验显示，Lipofectamine2000介导质粒转染Hela表达成功，整合酶主要定位在细胞核．结论 HIV-1整合酶真核表达载体构建成功，转染以后，整合酶表达并且主要定位在细胞核．
-
抗FITC单克隆抗体的制备及初步应用
以抗原抗体反应为基础的免疫学诊断技术需要有高特异性和高敏感性.为了提高免疫检测系统的敏感性,生物素-亲和素系统已被广泛地应用于免疫诊断技术.但生物素-亲和素系统也存在着标记较为复杂,易受内源性生物素影响等不足.异硫氰酸荧光黄(FITC)是一种很稳定的荧光素,极易结合在蛋白分子上,不仅标记简单,标记物也十分稳定.FITC作为半抗原结合到蛋白质载体上具有很强的免疫原性,抗FITC单克隆抗体(mAb)与标记在的蛋白质上F ITC反应,不仅特异性高,而且亲和力也高于抗体与多肽抗原的结合.因此,FITC-抗FITC系统能有效地放大抗原抗体反应敏感性,在免疫分析中有很大应用价值[1].我们制备了抗FITC mAb并将FIFC-抗FITC mAb系统用于常规夹心ELISA检测细胞因子试剂盒中,其敏感性在原基础上可提高4倍,使之更适合临床标本的检测.
-
荧光法研究免疫试验抗体包被过程
目的:以荧光法作为定量和示踪手段,研究免疫试验中抗体在固相载体上包被的行为及意义.方法:以异硫氰酸荧光素( FITC)标记后的抗体包被固相载体,构建化学发光免疫分析(CLIA)体系.通过荧光光度计精确测定包被前后包被液中游离抗体的浓度,定量抗体的包被量,并研究其包被量对免疫反应的影响.结果:抗体包被量与CLIA发光值非线性相关；间接法较直接吸附法包被更有利于保持抗体活性；热处理后化学发光系统发光值降低与包被抗体脱落有关.结论:荧光法为构建有效CLIA体系提供了一种研究方法.
