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猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗不同保存条件下的稳定性研究
目的 研究猪带绦虫TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因的重组双歧杆菌(Bb)疫苗在不同保存条件下的稳定性.方法 分别将猪带绦虫重组质粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18电转入长双歧杆菌(B.longum),获得阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.lon gum和pGEXTSO45W-4B-TSOL18/B.longum,分别置于不同条件下保存,取出菌液,抽提质粒,电泳检测,进行稳定性分析.结果 阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.long um和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum分别在常温下、4℃、-20℃、-80℃、-196℃(液氮中)分别保存48 h、1周、1月、2月,抽提质粒,电泳发现阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEX-TSO45 W-4B-TSOL18/B.longum在液氮中、-80℃、-20℃中比较稳定,而在普通的室温环境下,很快发生质粒丢失现象.结论 猪带绦虫TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因的重组Bb疫苗低温保存稳定,常温差,这为猪带绦虫重组Bb疫苗的进一步研究奠定了基础.
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猪带绦虫重组 BCG-TSOL18疫苗构建及其表达
目的：构建猪带绦虫重组BCG‐TSOL18疫苗，研究TSOL18基因在BCG中的表达情况。方法通过酶切的方法从重组质粒pGEX‐TSOL18获取猪带绦虫TSOL18基因，将其定向克隆到大肠杆菌‐分枝杆菌穿梭表达质粒pMV261中，构建猪带绦虫重组质粒pMV261‐TSOL18，进行酶切、PCR和测序鉴定；再将其电穿孔转化入BCG ，构建猪带绦虫重组BCG‐TSOL18疫苗，进行PCR鉴定；SDS‐PAGE和Western blot分析 TSOL18基因在BCG中的表达情况。结果通过酶切成功获得了393 bp的TSOL18基因片段；酶切、PCR和测序鉴定证明成功构建了猪带绦虫重组质粒pMV261‐TSOL18；PCR鉴定证实猪带绦虫重组质粒pMV261‐TSOL18成功转入BCG中，提示猪带绦虫重组BCG‐TSOL18疫苗构建成功；SDS‐PAGE分析发现在相对分子质量（M r）约为14．7 kD处有明显的TSOL18目的蛋白条带，Western blot证实表达的TSOL18目的蛋白能被兔抗血清和囊虫病猪血清所识别。结论成功构建了猪带绦虫重组BCG‐TSOL18疫苗，TSOL18基因能够在BCG中成功表达，表达的TSOL18重组蛋白具有特异的抗原性，为该疫苗的进一步研究奠定了基础。
关键词： 猪带绦虫 重组BCG-TSOL18疫苗 构建 表达 -
猪带绦虫TSOL18基因的表达、纯化和兔抗血清的制备
目的 构建猪带绦虫重组质粒pGEX-TSOL18,表达纯化TSOL18重组蛋白,制备兔抗重组蛋白血清.方法 全基因合成猪带绦虫TSOL18抗原编码基因,定向克隆到pGEX-1λT表达载体,构建重组质粒pGEX-TSOL18;转化大肠埃希菌ArcticExpress(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达情况；亲和层析纯化获得重组蛋白,免疫兔制备抗血清；ELISA测定抗血清的效价,Western blot鉴定抗血清的特异性.结果 全基因扩增出393 bp的TSOL 18抗原编码基因,酶切和测序鉴定证实TSOL18基因成功插入pGEX-1λT中；SDS PAGE分析显示表达重组蛋白相对分子质量(Mr)约为41 kDa,经亲和层析后可获得纯度为75％的重组蛋白；ELISA测定抗血清的效价为1∶256 000,Western blot证实该抗血清能与重组蛋白发生特异性反应.结论 猪带绦虫TSOL18基因能在大肠埃希菌中高效表达,成功制备了高纯度的TSOL18重组蛋白和高滴度的兔抗重组蛋白血清,为猪带绦虫的疫苗研制奠定了基础.
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猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因的克隆表达及免疫学分析
目的 对猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因(malate dehydrogenase,MDH)进行克隆,表达及免疫学特性的初步研究.方法 将猪带绦虫MDH基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中用异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹(Western Blot)进行免疫学分析.结果 成功构建pET-28a(+)-MDH重组质粒,并获得高纯度蛋白,该重组蛋白可被其免疫SD大鼠血清识别,同时也能被感染猪带绦虫的病人及猪、感染牛带绦虫病人及感染亚带绦虫病人血清所识别.结论 猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.
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猪囊尾蚴谷胱甘肽S-转移酶的表达研究
目的 应用免疫组化、双向电泳(2-DE)结合蛋白质印迹(Western-blotting)技术分析猪囊尾蚴谷胱甘肽S-转移酶(GST)的表达.方法 用猪带绦虫卵1 mL(8万个/mL)灌胃20d龄健康乳猪6头,于感染后40d、80d和120 d分别宰杀2头猪并取含囊尾蚴的肌肉及肝脏(120 d除外)制作4μm厚石蜡切片,采用Envision二步法,观察不同时期寄生在肌肉及肝脏的猪囊尾蚴GST的表达;同时制备感染后40d取自肌肉的猪囊尾蚴蛋白进行2-DE分析,将凝胶蛋白斑点转移至聚偏氟乙烯膜(PVDF膜),用本课题组自制的大鼠抗猪带绦虫GST血清作为一抗、健康大鼠血清作为阴性对照进行western-blotting分析.结果 不同时期寄生在肌肉及肝脏的猪囊尾蚴均表达GST,随感染时间增加,寄生在肌肉的猪囊尾蚴GST的表达变化不大(P＞0.05),寄生在肝脏的猪囊尾蚴GST的表达升高(P＜0.05);双向电泳凝胶共检测到207±9个蛋白质斑点,相对分子质量(Mr)为14 400～94 000,等电点(pI)为3.0～10.0.Western-blotting分析显示,实验组特异性抗原抗体阳性杂交斑点为1个,阴性对照未见阳性杂交斑点.将Western-blotting检测的抗原抗体阳性杂交斑点与原双向电泳凝胶斑点进行比对,找到对应蛋白斑点,经ImageMaster 2D Platinum 5.0软件分析后初步确定该蛋白斑点的pI/Mr为6.6/25 548,与猪带绦虫GST的理论推导值接近.结论 感染时间及感染部位组织学特征不同,猪囊尾蚴GST的表达略有差异.
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云南大理白族带绦虫mtDNA-Cytb序列测定及分析
目的 利用分子遗传标记对采自云南大理白族地区人体带绦虫标本进行生物多态性的研究.方法 从云南大理采集人体带绦虫标本株成虫节片, 抽提虫体基因组DNA,PCR扩增线粒体DNA细胞色素B(mtDNA-Cytb)序列部分片段,测序;结合GenBank中已知猪带绦虫、牛带绦虫和亚洲带绦虫mtDNA-Cytb序列, 经 DNAMAN 软件处理后计算遗传距离并构建系统发育树状图.结果 大理白族带绦虫标本系统发育树显示大理(B1,B2,B5,B6)株带绦虫标本与亚洲带绦虫的遗传距离接近,距牛带绦虫标本较远,与猪带绦虫则更远.大理(B3,B4)株带绦虫标本与猪带绦虫的遗传距离接近,距牛带绦虫和亚洲带绦虫标本远.结论 云南大理(B1,B2,B5,B6)株带绦虫标本属于亚洲带绦虫,而(B3,B4)株带绦虫标本属于猪带绦虫; mtDNA-Cytb序列分析可以用于带绦虫生物多态性研究.
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猪带绦虫乳酸脱氢酶基因的序列分析、克隆表达和免疫学分析
目的 利用生物信息学方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中识别乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDH-A),分析和预测其编码蛋白的结构和功能,并对其进行克隆表达和免疫学特性研究.方法 利用NCBI和ExPASy中有关基因、蛋白的序列和结构信息分析工具,结合其它生物信息学分析软件包,从猪带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别乳酸脱氢酶A(Ts LDH-A)的基因及其编码区,分析、预测该基因编码的蛋白的结构与功能;并将Ts LDH-A克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL-21/DE3中诱导表达,表达产物经纯化后用蛋白印迹(Western Blotting)进行免疫学分析.结果 该基因全长1 332bp,编码331个氨基酸.其氨基酸序列与其它物种LDH-A氨基酸序列一致性可达54%,具有乳酸脱氢酶保守结构域.其编码的蛋白理论分子量为3 5461.1Da ,有3个跨膜区和多个磷酸化位点,蛋白的理化性质较稳定.预测有4个主要的B细胞抗原表位,L-乳酸脱氢酶活化位点之一的His192 包含于表位190-199aa中.酶催化位点的3个关键氨基酸在空间结构上相互靠近.PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-Ts LDH-A构建成功.SDS-PAGE结果表明目的 基因在大肠杆菌BL-21/DE3中获得表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白.重组蛋白能被Ts LDH-A重组蛋白免疫的SD大鼠血清、感染了猪带绦虫的病人血清及猪血清识别,表明其具有较好的免疫原性和免疫反应性.结论 应用生物信息方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了Ts LDH-A的全长序列并预测得到其编码蛋白的结构与功能方面的信息,该基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达.
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感染猪囊尾蚴的家猪组织中不同时间IL-6、IL-8、TNF-α和sIL-2R含量变化
目的 研究实验家猪感染猪囊尾蚴不同时间组织中细胞因子IL-6、IL- 8、TNF-α和sIL-2R含量变化,从细胞因子角度探讨家猪抗猪带绦虫免疫应答的机制.方法 用猪带绦虫虫卵直接灌胃20d龄健康乳猪4头,并以健康乳猪4头作对照.于感染后第40、60、80和120 d取实验组猪肝脏、骨骼肌、心肌、舌肌及脑组织中囊尾蚴寄生处组织200mg匀浆,用ELISA法测定匀浆上清液中细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α和sIL-2R的含量.结果 1.肝脏病变组织中4种细胞因子的含量在40d时均明显高于同期对照组(P<0.01);随感染时间延长,4种细胞因子的含量逐渐降低,至80d时与同期对照组差别缩小(P<0.05),120d时肝脏已无囊尾蚴寄生;对照组肝脏组织中4种细胞因子的含量在不同时间始终保持基本稳定. 2.肌肉和脑部份病变组织中4种细胞因子的含量在40d时也明显高于同期对照组(P<0.01);随感染时间延长至80d时与同期对照组差别变小(P<0.05),120d时与同期对照组差别无显著性(P>0.05).3.对照组家猪肝脏中4种细胞因子的含量绝对值高于肌肉和脑组织(P<0.01);实验组肝组织在40d时各种细胞因子的增量更明显高于肌肉和脑组织中的增量(P<0.01).结论 家猪感染猪带绦虫早期,IL-6、IL-8和TNF-α作为前炎性反应因子在家猪肝脏的高水平表达诱导肝脏发生严重的炎症反应,限制和杀灭肝内的早期囊尾蚴,而肌肉和脑组织中这些细胞因子表达稍低,炎症反应相对较轻,因而囊尾蚴易于在这些部位存活.这一点可以从感染后期肌肉、脑组织中的囊尾蚴数量远多于肝脏而得到证实.
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以HBc颗粒为呈现载体的猪囊虫疫苗的构建及其免疫学研究
目的构建以HBc为载体的带有三个猪囊虫抗原表位(n1,n2,n3)的重组融合表达质粒pET-Δc-3n,表达出融合蛋白并纯化,通过免疫小鼠研究其体液免疫效果.方法用PCR法将三个猪囊虫表位分别插入HBc序列的第78-79位之间以及149位之后,再将该序列克隆入pET28a载体中,构建重组表达质粒,用大肠杆菌BL21作宿主菌表达出融合蛋白,并命名为PCCE,纯化后免疫小鼠,检测小鼠的体液免疫应答.用绦虫卵攻击免疫小鼠,并观察疫苗的保护作用.结果测序结果表明重组质粒构建成功,SDS-PAGE显示融合蛋白表达正确,并有多聚体形成现象,ELISA检测到高滴度抗体.小鼠体内绦虫卵攻击试验表明疫苗PCCE的相对保护率为89%.结论以HBc为呈现载体的猪囊虫疫苗被成功表达和纯化,该疫苗能诱导较强的体液免疫反应,免疫小鼠对绦虫卵攻击具有较好的免疫保护作用.提示该疫苗PCCE可能具有预防囊虫病的潜在价值.
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一氧化氮对猪带绦虫六钩蚴细胞毒作用的研究
目的研究一氧化氮(NO)对猪带绦虫六钩蚴杀伤作用.方法以LPS诱导离体的小鼠腹腔巨噬细胞,使其产生NO;加入猪带绦虫六钩蚴,测定48h内六钩蚴的死亡率;分别用诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的抑制剂地塞米松(Dexamethasone ,DXS)和左旋硝基精氨酸(Nω -nitro-L-arginine ,L-NNA)抑制NO产生,与未加抑制剂组比较六钩蚴死亡率的变化.结果 LPS可有效诱导巨噬细胞产生NO,2.0×105巨噬细胞产生的NO浓度为119.6400+5.1154μmol/L,相应的杀虫率为79.83%.加入抑制剂DXS和L-NNA后,巨噬细胞的NO产量均明显降低,其杀虫率也明显降低.结论活化巨噬细胞产生的NO对猪带绦虫六钩蚴有杀伤作用.
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猪带绦虫胰岛素受体TsIR-4810的鉴定及LBD区表达
目的 克隆鉴定猪带绦虫胰岛素受体TsIR-4810基因,并表达其LBD区.方法 设计猪带绦虫胰岛素受体TsIR-4810特异性引物,并分段进行RT-PCR扩增.TsIR-4810的完整ORF序列经BLAST同源比对,SMART预测其结构域,SWISS-MODEL同源建模,并用PhyML构建系统发育树.将TsIR-4810的LBD区克隆至pET-30a中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot鉴定.结果 获得的目的基因完整的ORF为4 920 bp,其编码蛋白的氨基酸序列与其他生物的胰岛素受体一样,具有相对保守的分泌信号肽、受体L1和L2结构域、FnⅢ结构域、跨膜区和受体酪氨酸激酶域.构建的LBD重组菌株诱导表达了63 ku的目的蛋白,与预期大小相符,且主要以包涵体形式存在.结论 TsIR-4810为猪带绦虫胰岛素受体基因,其LBD区的成功表达,将为开展基于胰岛素受体LBD区的新型疫苗和药物奠定基础.
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猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因在长双歧杆菌中的表达
目的 在成功构建猪带绦虫大肠杆菌双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的基础上,研究猪带绦虫TSO45W 4B-TSOL18融合基因在长双歧杆菌中的表达情况.方法 将猪带绦虫大肠杆菌双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSO45W 4B TSOL18电转化入长双歧杆菌,IPTG诱导表达,SDS PAGE和Western blot分析表达情况.结果 酶切、PCR和测序证实,重组质粒pGEX TSO45W 4B TSOL18成功转入长双歧杆菌.SDS PAGE显示,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为55 kD,与预期结果相一致.Western blot显示,重组蛋白能被兔抗血清、囊虫病猪血清和囊虫病患者血清所识别.结论 猪带绦虫TSO45W 4B-TSOL18融合基因能够在长双歧杆菌中获得表达,表达的重组蛋白具有特异的抗原性.
关键词： 猪带绦虫 TSO45W-4B-TSOL18融合基因 长双歧杆菌 表达 -
猪带绦虫谷胱甘肽转移酶GST的原核表达及免疫学研究
目的 通过对猪带绦虫谷胱甘肽转移酶GST的表达,对其免疫性进行初步研究.方法 利用生物信息学从猪带绦虫成虫cDNA质粒文库中筛选出谷胱甘肽转移酶(GST)基因,将其克隆到原核表达载体pET28a(+),经过双酶切、PCR鉴定后,异丙基-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析,Western blotting鉴定该蛋白免疫反应性.结果 成功构建了重组体,并得到高纯度蛋白,该蛋白可被感染猪带绦虫的病人及猪、感染牛带绦虫病人及感染亚带绦虫病人血清所识别.结论 猪带绦虫谷胱甘肽转移酶可在原核系统中获得具有免疫反应性的高效表达.
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信号肽和辅助性T细胞表位以及GST表位增强猪带绦虫保护性抗原诱导免疫应答的初步研究
目的研究信号肽和辅助性T细胞表位以及GST表位增强猪带绦虫保护性抗原诱导的免疫应答.方法在猪绦虫融合抗原pCC27(本室从六钩蚴cDNA表达文库筛选的三个保护性抗原经拼接所得)基因片段5′末端引入人IL-2信号肽、一个通用型辅助性T淋巴细胞表位,谷胱甘肽还原酶的T和B淋巴细胞表位(TGG),经pGEX4T-2表达鉴定,序列分析后构建成DNA疫苗,通过肌肉注射途径将这种DNA疫苗免疫小鼠.结果这种含辅助表位的DNA疫苗诱导的免疫应答效果明显超过对照组,对绦虫卵攻击的保护率为90%.结论构建了含绦虫融合抗原pCC27及TGG的核酸疫苗,动物试验结果表明,TGG表位既可提高IgG、IgG1、IgG2a的水平,又进一步增强Th1和Th2细胞间的平衡关系.免疫小鼠对绦虫卵的攻击具有很好的保护作用.
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猪带绦虫抗原基因TS76的克隆及原核表达
目的测定和分析自猪囊尾蚴表达型cDNA文库中筛选出的cDNA克隆(TS76)的序列,并进行该片段的原核表达研究.方法采用PCR扩增重组(噬菌体(TS76中的TS76 cDNA片段,亚克隆至pUC18,得到的重组子用于测序,并对测定结果进行分析及同源性比较;将TS76片段亚克隆到原核表达载体pGEX-1(T中,免疫印迹方法筛选得到能正确表达TS76片段的重组子pGTS76;制备pGTS76原核表达产物,进行浓度梯度SDS-PAGE和Western blotting分析.结果 TS76克隆含516对核苷酸,编码含83个氨基酸残基的多肽,与EMBL数据库中的猪囊虫免疫原性蛋白质mRNA有383bp的同源区域.重组质粒在大肠杆菌中表达的融合蛋白分子量为34 KD,能与抗猪囊尾蚴兔血清产生很强的免疫反应.结论分离到一个编码具较强免疫原性猪囊尾蚴抗原的基因.
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猪带绦虫重组抗原研究进展
猪囊尾蚴病(Cysticercosis cellulosae)俗称囊虫病(Cysticercosis)是由猪带绦虫(Taenia solium,Ts)中绦期幼虫猪囊尾蚴(cysticercus cellulosae)引起的一种严重的人兽共患寄生虫病.该病呈全球性分布,主要流行于中非、南非、拉丁美洲、东亚和南亚等地区.我国主要流行于黑龙江、吉林、河南、河北、山东、广西、云南、四川和贵州等31个省市自治区.采用分子生物学技术对Ts生活史不同阶段的抗原基因进行克隆、表达及生物学功能研究是当前研究的热点.本文就Ts六钩蚴、囊尾蚴、成虫阶段重要重组抗原的研究进展作一介绍.
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囊尾蚴病诊断抗原研究进展
囊尾蚴病(Cysticercosis)是由猪带绦虫幼虫(Taenia solium metacestode)寄生于人、猪、野猪等动物体内所引起的一种人畜共患寄生虫病,广泛分布于亚洲、非洲和拉丁美洲,全球囊尾蚴病患者约5 000万人,我国是囊尾蚴病高发区之一.囊尾蚴病的有效诊断是控制该病的关键,免疫学诊断方法,尤其是酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)和免疫印迹试验(Western-blot或EITB),以其特异、经济、快速等优点而成为囊尾蚴病免疫学诊断技术研究的热点.
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囊尾蚴病疫苗的研究进展
带属绦虫(Taenia Genus)囊尾蚴引起的囊尾蚴病(cys-ticercosis)是人兽共患的寄生虫病.由猪带绦虫(T.solium)囊尾蚴引起的猪囊尾蚴病在拉丁美洲国家流行严重,在亚洲以及非洲的非伊斯兰国家和地区也是严重的公共卫生问题,在我国则发生或流行于28个省、市、自治区,是我国重要的人兽共患寄生虫病之一[1].
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囊虫病免疫研究进展
囊虫病是由猪带绦虫的幼虫--囊尾幼寄生在人和家畜体内引起的人畜共患病。其成虫寄生在人体内，幼虫寄生在猪、野猪、人、骆驼、猫等体内。此病在亚、非、拉一些国家流行，尤以中非、南非、中南美一些地区为严重。在我国，该病流行区分布广泛，但以华北、东北、西北、西南一些地区感染率为高，其它地区散在分布。关于囊虫病的免疫，国内外学者已做过大量的研究，本文从囊尾蚴抗原、免疫机理、囊尾蚴疫苗三个方面对做过的工作作一综述。
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南瓜子槟榔驱除亚洲绦虫、猪带绦虫和牛带绦虫的效果比较
南瓜子槟榔驱除猪、牛带绦虫是一种传统的治疗方法,其疗效确切、安全可靠,文献报道很多[1-2],但用于驱除亚洲绦虫则报道尚少.2003年3月-2006年10月,我们用该疗法分别在亚洲绦虫流行区广西鹿寨县和宾阳县猪、牛带绦虫流行区融水县和我中心门诊,对3种带绦虫患者进行驱虫比较观察,结果报告如下.
