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从单基因干预长寿和癌症的弊端说起
生物体是依赖于多种调控手段来共同维持其内稳态,细胞凋亡就是其中之一,是通过遗传基因控制而实现一种细胞的生理性、主动性的自杀性死亡方式,犹如秋天树叶的"凋落",故称为凋亡(apoptosis).人体内每小时都有数百万个细胞在凋亡,而每个凋亡的细胞都由新生的细胞来取代,这样,组织与器官才能维持原状或稳态.例如能体外计数的淋巴细胞数量保持着惊人的恒定,就是由于细胞的凋亡和增殖受基因的严密调控,一旦平衡失调则可能导致疾病的发生.
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中药干预肝纤维化的分子机制
肝纤维化(hepatic fibrosis)的防治研究是国内外的热点和重点课题,主要的研究方向有细胞因子、小分子物质、基因干预、信号转导调节剂、中医中药等,而中药抗肝纤维化研究是我国的特色和优势.近年来报道的很多单方、复方中药在细胞、动物及临床实验中都观察到一定的抗肝纤维化疗效,有些中药制剂的研究已深入到分子水平进行了较详尽的抗肝纤维化机制探讨,取得了初步令人满意的结果.本文综述中药抗肝纤维化的分子机制研究进展.
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小鼠神经生长因子基因重组腺病毒的构建及其在基底膜上的表达
目的 构建具有生物学活性的小鼠神经生长因子(nerve growth factor,βNGF)基因重组腺病毒表达载体,并研究其在耳蜗基底膜上的表达特性.方法 利用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)从小鼠颌下腺总mRNA中扩增βNGF全长cDNA片断,定向克隆于携带巨细胞启动子(CMV)和标记蛋白-绿色荧光蛋白(eGFP)的腺病毒穿梭质粒pAdtrack中;在细菌中与缺陷型腺病毒基因组pAdeasy-1进行同源重组,构建pAdeasy-1/pAdtrack-CMV-eGFP-mβNGF;在HEK293细胞中包装成为有感染能力的,能表达βNGF和绿色荧光蛋白的重组腺病毒颗粒.用病毒感染原代培养的耳蜗基底膜,激光共聚焦显微镜下观察病毒感染效率,RT-PCR法检测βNGF基因在基底膜上的转录表达,蛋白质免疫印迹法检测βNGF在基底膜上的蛋白表达.结果 成功获得小鼠βNGF的cDNA片断,经酶切鉴定证实重组腺病毒表达载体pAdeasy-1/pAdtrack-CMV-eGFP-mβNGF构建成功.激光共聚焦显微镜下观测到感染病毒的基底膜发出明亮的绿色荧光,分别在mRNA和蛋白质水平证实有外源性βNGF的表达.结论 重组腺病毒表达载体能高效地将外源性目的基因βNGF导人体外培养的基底膜细胞中,并在基底膜中转录和翻译,为进一步研究腺病毒介导的βNGF对内耳各类细胞的保护作用奠定基础.
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系统性红斑狼疮相关基因IFIT1的功能初探
目的研究系统性红斑狼疮(SLE)相关基因IFIT1的功能.方法首先将IFIT1从穿梭表达克隆转入真核表达克隆,然后转导进入Jurkat细胞系,用有限稀释法筛选单克隆;再用CD3和CD28刺激单克隆,检测膜分子的表达、细胞凋亡、增生、细胞因子分泌等免疫生物学指标;后应用RNAi技术,下调IFIT1的表达,检测细胞因子分泌,比较分析IFIT1的功能.结果IFIT1的过表达在T细胞中能诱导白细胞介素(IL)-4和IL-10的分泌增加,下调IFIT1的转录水平后能部分下调IL-4和IL-10表达,而与细胞膜分子的表达、细胞的增生、凋亡无关.结论SLE相关新基因IFIT1在细胞因子的产生中起了重要作用,可能与Th1/Th2的失衡有关.
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针对Fas基因RNA抑制作用前后帕金森病细胞相关因子变化的凋亡作用
近年来研究表明,细胞凋亡在帕金森病的病理机制中起重要作用.细胞凋亡涉及多种基因的复杂变化,其中凋亡促进基因Fas与之关系密切[1,2].基因干预可通过降低凋亡基因的表达而对细胞凋亡起到干预作用.本实验用6-羟基多巴胺作用于NGF诱导后PC12细胞,建立帕金森病细胞模型,用RNAi方法对Fas基因表达进行抑制,从而观察该方法以帕金森病细胞凋亡的影响.
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肿瘤相关基因转录调控蛋白的识别与研究进展
癌相关基因主要包括两大类,即原癌基因与抑癌基因.在自然或实验条件下原癌基因的活化或者抑癌基因的失活具有诱导细胞恶性转化功能.癌相关基因的表达调控异常是细胞癌变中的重要事件.在癌相关基因转录调控中,转录调控蛋白作为反式作用因子(trans acting factors)与基因自身的顺势作用元件(cis acting elements)相互作用,实现对基因转录水平的调控.故深入研究癌相关基因的反式作用因子,有助于我们解析癌相关基因的表达调控机制,从而为以基因干预为目的的靶向治疗提供有价值的理论依据.
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系统性红斑狼疮相关基因功能的实验研究
目的:研究系统性红斑狼疮(SLE)相关基因IFITl的功能.方法:首先将IFIT1从穿梭表达克隆转入真核表达克隆,然后转导进入Jurkat细胞系,用有限稀释法筛选单克隆;再用CD3和CD28刺激单克隆,检测膜分子的表达、细胞凋亡、增生、细胞因子分泌等免疫生物学指标;后应用RNAi技术,下调IFIT1的表达,检测细胞因子分泌,比较分析IFIT1的功能.结果:IFIT1的过度表达在T细胞中能诱导IL-4和IL-10的分泌增加,下调IFIT1的转录水平后能部分下调IL-4和IL-10表达,而与细胞膜分子的表达、细胞的增生、凋亡无关.结论:SLE相关新基因IFIT1在细胞因子的产生中起了重要作用,可能与Th1/Th2的失衡有关.
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Smad7在肌腱粘连组织中的表达及对肌腱成纤维细胞纤维化的作用
[目的]通过观察人肌腱粘连组织中Smad7的表达情况,并在TGF-β1诱导的肌腱成纤维细胞(TDFs))中沉默或过表达Smad7,观察细胞纤维化相关指标的变化,讨论Smad7在肌腱粘连中的作用及调控机制.[方法]收集肌腱粘连组织及正常肌腱腱周组织,Western blotting检测Smad7蛋白含量.设计并合成针对Smad7基因编码区的siRNA,同时构建Smad7基因表达载体,经脂质体转染至TDFs细胞,RealTime-PCR检测胞内Smad7基因含量,Western-blot检测细胞中Smad7蛋白表达;使用TGF-β1诱导转染后TDFs细胞,CCK-8检测细胞增殖活性变化,Western blotting检测纤维化相关的蛋白指标.[结果]与正常腱周组织比较,肌腱粘连组织中Smad7蛋白减少.siRNA及Smad7基因过表达载体转染TDFs,可以明显抑制或者上调细胞内Smad7基因含量及蛋白表达,与未转染组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);TGF-β1诱导的TDFs细胞,可以明显增强细胞增殖活性(P＜0.01,vs未诱导组),siRNA转染后,TGF-β1诱导TDFs增殖活性和纤维化蛋白指标上升的趋势进一步增强,Smad7基因表达载体转染则使得TGF-β1诱导TDFs增殖活性和纤维化蛋白指标增强的趋势得到明显抑制,基因干预且诱导组与只诱导组细胞活性和蛋白含量相比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).[结论]肌腱粘连组织中Smad7蛋白减少,提示肌腱粘连发生过程中Smad7表达受抑制;Smad7基因过表达可以抑制TGF-β1诱导TDFs细胞纤维化.
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腺病毒介导小鼠神经生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达
目的 构建具有生物学活性的小鼠神经生长因子(nerve growth factor,βNGF)基因重组腺病毒表达载体,并研究其在骨髓间充质干细胞中的表达特性.方法 利用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)从小鼠颌下腺总mRNA中扩增βNGF全长cDNA片断,定向克隆于携带巨细胞启动子(CMV)和标记蛋白-绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒穿梭质粒pAdtrack中;在细菌BJ5 183中与缺陷型腺病毒基因组pAdeasy-1进行同源重组,构建pAdeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-mβNGF;在HEK293(人胚肾293细胞)细胞中包装成为有感染能力的、能表达βNGF和绿色荧光蛋白的重组腺病毒颗粒.用病毒感染原代培养的人骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem-cells,MSCs),荧光显微镜下观察病毒感染效率,免疫细胞化学法检测细胞中βNGF的蛋白表达,蛋白质免疫印迹法检测培养上清中NGF的分泌.结果 成功获得小鼠βNGF的cDNA片断,经酶切鉴定证实重组腺病毒表达载体pAdeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-mβNGF构建成功.荧光显微镜下观测到感染病毒的细胞胞体发出明亮的绿色荧光,细胞中βNGF免疫染色阳性,培养上清中检测有NGF分泌.结论 重组腺病毒表达载体能高效地将外源性目的基因βNGF导入骨髓间充质干细胞中,并能正确转录、翻译和分泌,为骨髓间充质干细胞在内耳基因干预的研究中奠定基础.
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选择性α基因检测诊断地中海贫血高风险夫妇方法研究
目的 探讨准确、经济的检测地中海贫血(地贫)高风险夫妇技术路线,降低地贫出生缺陷干预成本.方法 将1000对(2000例)广西籍已婚待育夫妇随机分为对照组及实验组,每组500对,两组人群全部做血细胞分析,对一方或双方红细胞平均体积(MCV)低于80 fL的夫妇做血红蛋白(Hb)电泳.筛出所有β地贫高风险夫妇及小部分a地贫高风险夫妇.在筛出的高风险夫妇之外的所有已做电泳的夫妇中:实验组选择夫妇中携带α地贫基因可能性小的一方先做α地贫基因检测,再将检出的α地贫基因携带者的配偶做α地贫基因检测；对照组将所有人全部做α地贫基因检测.结果 两组中高风险夫妇的检出率差异无统计学意义(P＞0.05),但对照组地贫基因检测率(100％)将近是实验组(52.74％)的两倍,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 选择性α基因检测诊断地中海贫血高风险夫妇,方法简单易操作、经济、准确、高效,适宜推广.
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SLE相关基因IFIT1免疫调节功能的初步研究
目的:研究系统性红斑狼疮(SLE)相关基因IFIT1的功能.方法:首先将IFIT1从穿梭表达克隆转入真核表达克隆,然后转导进入Jurkat细胞系,用有限稀释法筛选单克隆;再用CD3和CD28刺激单克隆,检测膜分子的表达、细胞凋亡、增生、细胞因子分泌等免疫生物学指标;后应用RNAi技术,下调IFIT1的表达,检测细胞因子分泌,比较分析IFIT1的功能.结果:IFIT1的过度表达在T细胞中能诱导白细胞介素IL-4和IL-10的分泌增加,下调IFIT1的转录水平后能部分下调IL-4和IL-10表达,而与细胞膜分子的表达、细胞的增生、凋亡无关.结论:SLE相关新基因IFIT1在细胞因子的产生中起了重要作用,可能与Th1/Th2的失衡有关.
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肝脏靶向表达大鼠白介素-10基因对猪血清诱导的大鼠肝纤维化的抑制
目的 探讨肝脏靶向表达rIL-10基因对猪血清诱导的大鼠肝纤维化的抑制作用.方法 rIL-10基因通过尾静脉快速大容量注射法转移至大鼠体内,RT-PCR法检测大鼠肝、肾、脾和肺组织rIL-10 mRNA的表达及S-P免疫组化法检测rIL-10蛋白在肝脏中表达.30只体质量100～120 g清洁级雄性SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组(n=6)、纤维化模型对照组(n=8)、rIL-10基因干预组(n=8)和空质粒对照组(n=8).正常对照组与其余3组大鼠腹腔分别注射生理盐水和猪血清,0.5 ml/只,每周2次.第5周开始造模同时,rIL-10基因干预组和空质粒对照组大鼠分别从尾静脉注射pcDNA3-rIL-10和pcDNA3空质粒,每周1次.第8周末处死全部大鼠收集组织和血清备用.HE、天狼星红染色分别检测各组肝组织病理形态学和Ⅰ、Ⅲ胶原的改变,生化检测血清ALT和AST含量.结果 RT-PCR和免疫组化证实rIL-10基因经尾静脉快速大容量注射转染到大鼠体内后主要在肝组织中转录及表达;纤维化模型和空质粒对照组:HE染色显示大鼠肝细胞脂肪变性,炎性细胞浸润,大量胶原沉积形成粗细不等的纤维隔,部分假小叶形成;天狼星红染色显示肝组织中大量Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维沉积;血清中ALT和AST表达水平较正常对照组明显升高(P<0.01).与对照组比较,rIL-10基因干预组大鼠HE染色显示肝细胞变性坏死程度减轻、炎细胞的浸润减少,胶原沉积明显减少,天狼星红染色显示Ⅰ、Ⅲ型胶沉积面积显著下降(P<0.01),血清中ALT和AST表达水平显著降低(P<0.01).结论尾静脉快速大容量注射法可使rIL-10基因在肝组织靶向表达,靶向表达的rIL-10有效抑制猪血清诱导的大鼠肝纤维化形成.
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尾静脉注射大鼠IL-10真核表达质粒对肝纤维化的拮抗作用及对星状细胞活化的影响
目的 探讨大鼠IL-10基因干预对实验性大鼠肝纤维化的拮抗作用及对肝星状细胞活化的影响.方法 清洁级SD大鼠腹腔注射猪血清制备大鼠肝纤维化免疫模型.造模第5周开始,rIL-10真核表达质粒与空质粒通过尾静脉高压注射法转移至大鼠体内,每周1次.第8周末处死大鼠,收集肝组织.HE及VG染色检测肝组织病理形态学改变,免疫组织化学检测大鼠肝组织中α-SMA的表达.将转染rIL-10基因的BRL细胞与HSC-T6肝星状细胞共培养,Western blot法检测共培养48 h后HSC表达α-SMA的变化.结果 HE及VG染色结果显示rIL-10基因通过尾静脉高压注射法转移至大鼠体内能有效拮抗肝纤维化的形成,减少肝组织炎性细胞浸润及细胞外基质的沉积.肝纤维化大鼠肝组织中α-SMA表达较正常对照组大鼠明显增强(P＜0.05),α-SMA表达部位与胶原沉积的部位相似.rIL-10基因干预后的大鼠肝组织α-SMA表达明显降低(P＜0.05).rIL-10基因修饰BRL细胞与HSC-T6细胞共培养48 h后,能显著减少HSC-T6细胞α-SMA的表达.结论 rIL-10基因可通过抑制HSC活化拮抗肝纤维化的进程.
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支链脂肪酸酯
一些数据显示肥胖即将成为世界性健康问题，因为肥胖与胰岛素抵抗，2型糖尿病（type 2 dia-betes，T2D），高血压、高血脂、冠心病，以及癌症等密切相关。如何防治肥胖及其相关疾病已成为亟待解决的重大课题。研究表明脂肪细胞代谢紊乱与肥胖以及肥胖相关性疾病的发生和发展密切相关。因此，开展不同条件下脂肪细胞代谢变化规律及机制的研究将有助于阐明肥胖和肥胖相关疾病的机制。2014年Yore MM等[1]通过选择性脂肪组织转基因干预动物模型并采用脂类代谢组学技术首次在哺乳动物脂肪组织细胞中发现和鉴定了一类新型脂类分子-羟脂肪酸支链脂肪酸酯（branched fatty acid esters of hydroxy fatty acids， FAHFAs，简称支链脂肪酸酯），这类分子具有增强胰岛素敏感性和抗炎作用。
