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重组胸腺素α1 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌的构建与表达
目的 构建表达重组胸腺素α1(Tα1)的pMAL- C2x - Tα1/TBI工程菌.方法 将人工合成的Tα1序列进行PCR扩增,将扩增的片段和pMAL- C2x质粒载体分别经BamHI和EcoR I双酶切后,用T4 DNA快速连接酶连接构建pMAL- C2x - Tα1融合表达质粒,再经测序正确后,将重组体转化至大肠埃希菌TB1菌中,pMAL- C2x -Tα1/TB1菌在LB液体培养基中培养,经IPTG诱导表达麦芽糖结合蛋白与Tα1的融合蛋白(MBP- Tα1),采用Westernblot对MBP- Tα1进行鉴定.结果 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌能有效表达MBP- Tα1,融合蛋白占菌体蛋白的33.6％,分子量约为45×103.结论 工程菌的成功构建和表达为重组Tα1的纯化、生物学活性等研究奠定了基础.
关键词： 重组胸腺素α1 基因克隆 质粒pMAL-C2x 融合表达 -
结核分支杆菌ESAT-6基因蛋白的表达
目的 构建致病性结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶(Early secretary antigenic target, ESAT-6)基因的pET原核表达载体,诱导表达并初步鉴定该蛋白.方法 设计特异性引物,用PCR方法从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组中扩增ESAT-6基因,产物通过双酶切克隆入pET-32a(+)质粒,经PCR、酶切、测序等方法鉴定后,转入大肠杆菌BL21菌体中IPTG诱导表达,并经镍柱纯化、Western-blotting鉴定.结果 所获得ESAT-6基因序列与GenBank公布的完全一致;表达融合蛋白相对分子质量约2.5×104,并能与特异性单抗结合,具有一定免疫学活性.结论成功表达纯化并鉴定构建了ESAT-6融合蛋白.
关键词： 结核分枝杆菌 早期分泌性抗原靶ESAT-6 载体构建 融合表达 -
人肌纤生成调节因子1融合蛋白在大肠杆菌的表达和抗体制备
目的研究人肌纤生成调节因子1(MR-1)的表达,获得MR-1蛋白,制备MR-1抗体,为MR-1生物功能研究提供基础.方法利用大肠杆菌质粒pGEX-5X-1、pET30a(+)及pET24a(+),分别构建MR-1及其两端与不同标签序列融合的表达载体.在大肠杆菌BL21(DE3)和BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中比较N端和/或C端融合标签序列对该基因表达的影响.通过凝胶蛋白电泳及电洗脱制备目的蛋白,免疫家兔.酶联免疫吸咐试验(ELISA)和Western b1ot检测所制备抗体的滴度和免疫原性.结果利用GST或T7-tag序列在其N端融合,使MR-1在大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL得到表达.利用所表达获得的MR-1-T融合蛋白,制备了针对此蛋白的多克隆抗体.ELISA检测所制备抗体滴度达到1:105,Western hlot显示所制备的多克隆抗体可用于检测天然细胞中的MR-1蛋白.结论MR-1蛋白需在N端与GST或T7-tag序列融合方可实现表达.利用在大肠杆菌表达纯化的蛋白所制备的抗体可用于MR-1生物学功能的研究.
关键词： 人肌纤生成调节因子1 融合表达 多克隆抗体 -
人重组内皮抑素基因的克隆与融合表达
目的构建人内皮抑素(endostatin)融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中表达.方法用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素全基因,连接PGEM-T载体,测序确认,定向克隆重组入pTRX表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.结果经SDS-PAGE分析,出现特异性蛋白质条带,大小与预期相符合.结论人内皮抑素基因在原核细胞表达载体pTRX中获得成功表达,为应用内皮抑素进行肿瘤的抗血管生成治疗奠定了基础.
关键词： 人内皮抑素 反转录多聚酶链反应(RT-PCR) 融合表达 -
GST-Ccd1融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备
目的:利用大肠杆菌DH5a表达GST-Ccd1融合蛋白,并用亲和层析分离纯化,进行动物免疫制备多克隆抗体.方法:利用本室构建好的pGEX-5X-1-Ccd1-N原核表达重组质粒,转化大肠杆菌DH5a,经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得可溶性表达.经谷胱甘肽Sepllarose 4B介质填充的层析柱分离纯化蛋白,制备抗原免疫动物,得到Ccd1的兔源多克隆抗体.结果:ELISA结果显示血清抗体效价可以达到1:40 000.免疫组化分析表明自制的抗体能特异性与Ccd1蛋白相互作用,可以用于实验分析.结论:制备了效价高特异性良好的抗Ccd1多克隆抗体.经实验验证获得的抗体能够满足针时Ccd1的免疫印迹和免疫组化检测的实验要求,为今后深入研究Ccd1表达的组织分布、细胞内定位及其生物学功能提供了有用的实验工具.
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HCV胞膜蛋白E2基因的融合表达、纯化及多克隆抗体制备
目的原核表达HCV胞膜蛋白E2,获得抗E2多克隆抗体.方法利用PCR方法从HCV基因组序列中扩增出831 bp(384～661aa)的E2基因片段并按读框克隆到原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导HCV E2蛋白表达,SDS-PAGE和Western Blot法检测蛋白表达,Ni-NTA偶联的琼脂糖吸附柱纯化融合蛋白,薄层扫描及Bradford 法检测纯化蛋白的纯度＞90%;用表达的E2蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA 法检测抗体效价,Western Blot法检测抗体特异性.结果用原核诱导表达出HCV胞膜蛋白E2免疫新西兰兔后获得多克隆抗体的效价在1∶ 1 280以上,能特异性识别E2蛋白.结论成功构建HCV E2基因的原核表达载体,利用原核表达HCV胞膜蛋白E2制备的多克隆抗体能特异性识别E2蛋白.为进一步开展HCV E2蛋白功能和HCV受体的研究奠定了基础.
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抗菌肽Cecropin A基因原核表达及表达产物的鉴定
背景:Cecropins是一种具有抗菌活性的小分子蛋白质.采用真核细胞表达或人工合成Cecropins,效率低、成本高.目的:克隆表达家蝇抗菌肽基因Cecropin A,并对其重组表达产物进行鉴定.方法:依据GenBank中家蝇Cecropin A基因序列设计特异性引物,用RT-PCR从家蝇幼虫组织中扩增Cecropin A成熟肽基因,将其克隆入原核表达载体pET32a中,与表达载体中的Thioredoxin基因构成融合基因,并转化E.coli BL21.经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导表达.采用家蝇幼虫血淋巴免疫家兔获得抗血清;Western blot和三羟甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定诱导的重组蛋白质.结果与结论:经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导,E.coli BL21可表达Cecropin A成熟肽,兔抗家蝇幼虫血清、三羟甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot结果证实表达产物为Cecropin A成熟肽.说明使用原核表达系统可以获得天然Cecropin A成熟肽.
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人脂联素球状结构域(gAd)基因的克隆、融合表达和纯化
目的建立人脂联素球状结构域(gAd)融合组氨酸标签的原核高效表达体系,并分离纯化gAd.方法从淋巴细胞中提取人基因组DNA,PCR扩增出含有脂联素编码序列的片段,经T-A克隆入pMD18-T载体中,然后设计适当的引物,引入起始密码、C端连续6个组氨酸编码序列、终止密码以及相应的酶切位点,把脂联素球状结构域(gAd)基因亚克隆到表达载体pBV220,将序列鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌DH5α中,用42℃温控诱导表达目的蛋白.结果在大肠杆菌中成功实现了gAd稳定高效表达,表达产物以包涵体形式存在,表达量约占全菌蛋白的19%,用超声破菌,经金属离子(Ni2+)配体亲和层析一步纯化得到了均一蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定得到了较高纯度的gAd.结论已成功表达了gAd融合蛋白,为进一步研究其生物学功能和作用机制奠定了基础.
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口蹄疫病毒2B基因绿色荧光蛋白融合表达质粒的构建及表达
目的 构建口蹄疫病毒(FMDV)2B基因绿色荧光蛋白(GFP)融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达.方法 RT-PCR扩增O型口蹄疫病毒WFL株的2B基因,克隆入表达载体pEGFP-C1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定.将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和2B基因转录水平.结果 经双酶切及PCR鉴定,目的 基因片段大小与预期相符,测序结果与WFL株相应序列一致.荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有2B基因的转录.结论 已成功构建了FMDV 2B基因GFP融合表达质粒,并在BHK一21细胞中获得了表达.
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重组降血压肽在大肠杆菌中的高效表达
目的获得具有高活性的重组降血压多肽.方法人工合成高活性降血压肽单体,经酶切位点串联,克隆至表达载体,并转化宿主菌BL21进行诱导表达.结果经酶切、PCR和测序均证明,串联的基因ACEIP已成功克隆至pGEX-4T-2表达载体中,融合蛋白GST-ACEIP的表达水平达24.6%,表达产物的融合蛋白和多肽含量分别为1.1 g/L和0.14 g/L,其抑制活性达85%.结论已成功制备出高活性的重组降血压多肽,为进一步开发降血压药物奠定基础.
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抗菌肽LfcinB与红色荧光蛋白mApple在酿酒酵母中的融合表达
目的 通过融合牛乳铁蛋白肽基因(bovine lactoferricin B,LfcinB)与红色荧光蛋白(mApple)基因,构建以mApple为报告基因的酵母表达载体,融合表达重组蛋白LfcinB-mApple,并进行活性检测.方法 取含LfcinB和mApple基因的pYES2-α-LfcinB-G13、pYES2-α-mApple-DP-AP质粒,分别经PCR扩增后连接形成片段LfcinB-mApple,插入质粒pYES2-α(质粒pYES2-α-LfcinB-G 13经双酶切所得)中,将构建的重组表达质粒pYES2-α-LfcinB-mApple转入酿酒酵母菌株W303,半乳糖诱导表达.管碟法检测表达的LfcinB-mApple对大肠埃希菌DH5α、金黄色葡萄球菌的抑菌活性;激光共聚焦检测红色荧光蛋白荧光的发射.结果 重组表达质粒pYES2-α-LfcinB-mApple经酶切鉴定和测序证明构建正确;表达的重组LfcinB-mApple对大肠埃希菌DH5α、金黄色葡萄球菌均有明显抑菌活性;重组酵母细胞内观察到红色荧光.结论 重组酿酒酵母成功分泌表达了具有生物活性的LfcinB-mApple,对进一步研究LfcinB的生物功能及大规模生产提供了条件.
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HIV跨膜蛋白gp36和gp41的截短及融合表达
目的将HIV-1的跨膜蛋白gp41和HIV-2跨膜蛋白gp36进行截短,并在大肠杆菌中进行融合表达.方法用PCR将gp41和gp36的编码基因进行截短,回收的PCR产物纯化后克隆到连接载体pGEM-T上,然后用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ和SalⅠ切下目的基因,并构建到表达载体pGEX-4T-3,导入宿主细胞BL21,用IPTG诱导表达.结果酶切鉴定显示,截短的HIV-1 gp41和HIV-2 gp36跨膜蛋白基因大小与预期的一致,表达产物经SDS-PAGE分析显示在相对分子质量66 000处出现融合表达条带,Western blot分析显示,与相应抗体出现特异性反应.结论已成功对gp41和gp36跨膜蛋白进行截短,并构建表达载体进行表达,为跨膜蛋白的进一步应用研究奠定基础.
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人白细胞介素-24基因的克隆、表达和纯化
目的对人白细胞介素-24(hIL-24)进行克隆、表达和纯化.方法分离人外周血单个核细胞,Con A刺激培养,提取细胞总RNA,应用RT-PCR技术从外周血单个核细胞中扩增hIL-24成熟肽编码区,定向克隆至融合表达载体pGEX-4T-1,重组载体pGEX-4T-1/hIL-24经DNA测序鉴定后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,阴离子交换层析纯化融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果所得hIL-24基因经序列分析,与GenBank公布一致.所构建融合表达载体pGEX-4T-1/hIL-24测序正确,转化BL21(DE3)后,37℃诱导表达相对分子质量约为44 000的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的30.63%.经纯化后,纯度达85%以上.Western blot检测能与兔抗人IL-24的多克隆抗血清发生结合反应.结论已成功构建了hIL-24的融合表达载体pGEX-4T-1/hIL-24,并在大肠杆菌中高效表达,纯化后获得了高纯度的融合蛋白,为hIL-24的功能及活性研究奠定基础.
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EGFP-PDGFRβ融合基因表达载体的构建及其转染COS-7细胞条件的优化
目的 构建EGFP-PDGFRβ融合基因表达载体,并优化PEI介导基因转染COS-7细胞的条件.方法 PCR扩增EGFP和PDGFRβ基因,依次连接至pcDNA3.1(+)质粒中,构建融合基因表达载体H-E-P-pcDNA3.1(+),经PEI介导转染COS-7细胞,并对转染条件进行优化.结果 融合基因表达载体经酶切及测序证明构建正确.经PEI介导转染COS-7细胞的佳条件为:DNA浓度2 μg/ml,N/P比值15.5,在无血清条件下转染.此条件适用于滚瓶培养细胞的转染.结论 已成功构建了EGFP-PDGFRβ融合基因表达载体,并优化了经PEI介导转染COS-7细胞的条件.
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脑膜炎球菌表面蛋白fHBP与PorA的融合表达及其免疫原性
目的 构建脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis,Nm)表面蛋白fHBP重组表达质粒,并与PorA蛋白融合表达,对单抗原fHBP和融合抗原fHBP-PorA的免疫原性进行检测.方法 筛选并优化fHBP和PorA基冈序列,设计连接片段将PorA连接至fHBP C-端,构建重组表达质粒pET-24b-fHBP和pET-24b-fHBP-PorA,分别转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达.表达的重组蛋白经镍柱亲和层析和凝胶过滤层析后免疫家兔,制备抗血清,采用间接ELISA、流式细胞术和微量血清杀菌力试验(serum bactericidal assay,SBA)评价抗原的免疫原性.结果 经双酶切和测序鉴定,两个蛋白的重组表达质粒构建正确.重组蛋白fHBP以可溶形式表达,fHBP-PorA以包涵体形式表达,纯化后纯度均在90％以上.抗血清滴度均在1.0× 105以上.流式细胞术检测显示,抗血清与Nm可发生特异性结合,且fHBP-PorA抗血清显示出一定的交叉反应.fHBP和fHBP-PorA抗血清对Nm29019的杀菌滴度为1∶128.结论 fHBP具有较好的抗原性和免疫原性,具备B群脑膜炎疫苗开发前景.多抗原融合策略需更多的优化考虑.
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人巨细胞病毒融合表达载体的构建及鉴定
目的 构建含人巨细胞病毒(HCMV)gB680糖蛋白基因和突变的pp65蛋白基因(pp65m)的融合表达载体,并检测其在COS-7细胞中的表达.方法 用PCR法从HCMV基因组中钓取gB680和pp65m蛋白基因,分别亚克隆入pMD18-T载体中,经酶切鉴定并测序后,构建真核表达载体pVAX1/gB680+pp65m,以ELISA法检测其在COS-7细胞中的瞬时表达.结果 重组质粒含有gB680和pp65m融合基因,并能在COS-7细胞中表达.结论 已成功构建了人巨细胞病毒融合表达载体,并可在真核细胞中表达.
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牛病毒性腹泻病毒E0和E2蛋白的融合表达及纯化
目的 在大肠埃希菌中融合表达牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E0和E2基因,并进行纯化.方法 采用RT-PCR法分别扩增BVDV BA株的E0和E2基因片段,通过酶切位点将二者串联并克隆至原核表达载体pET-28a上,构建重组表达质粒pET-28a-E0-E2,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达的融合蛋白E0-E2经镍离子亲和层析纯化后,进行Western blot分析.结果 重组表达质粒pET-28a-E0-E2经双酶切和测序证明构建正确;表达的融合蛋白E0-E2相对分子质量约为68 500,表达量约占菌体总蛋白的20％,主要以包涵体形式存在;纯化的融合蛋白纯度达95％,可与牛病毒性腹泻病毒阳性血清发生特异性反应.结论 在大肠埃希菌中融合表达了BVDV E0和E2蛋白,纯化后的融合蛋白纯度较高,为BVDV抗体ELISA检测方法的建立及新型疫苗的研制奠定了基础.
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人甲状旁腺素N-端34肽基因的合成、克隆和融合表达
目的构建重组人甲状旁腺素N-端34(PTH34)肽的大肠杆菌融合表达菌株,并对其表达产物进行检测.方法选用大肠杆菌偏爱密码子,设计优化的人甲状旁腺素N-端34肽基因序列,通过6个DNA片段分段合成、片段连接、PCR扩增,经TA克隆到pMD18载体中,经测序验证,构建GST融合表达载体.结果经SDS-PAGE检测PTH(1-34)肽与GST蛋白的融合表达,经Western blot分析具有免疫活性,通过GST亲和层析和Xa因子酶切,利用小分子蛋白电泳可检测到PTH(1-34)肽.结论已获得了能表达GST-PTH(1-34)融合蛋白的菌株.表达产物具有免疫活性,且能被Xa因子消化得到PTH(1-34)肽.
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天蚕素A-蛙皮素杂合肽突变体的构建、表达及其抗菌活性
目的 构建天蚕素A(1～8)-蛙皮素(1～12)杂合基因抗菌肽(CA-MA杂合肽)突变体,在大肠杆菌中融合表达,并进行抗菌活性检测.方法 采用PCR体外定点突变技术,设计1对方向相反的引物,其中1个引物引入突变点,应用高保真的Polybest DNA多聚酶进行重组表达质粒pGEX-4T-1-CA-MA的PCR扩增,使CA-MA杂合肽第16位密码子由AGT突变为TGG.将扩增片段自身连接,构建CA-MA杂合肽突变重组表达质粒pGEX-4T-1-W16-CA-MA,转化E. coli BL21,IPTG诱导表达突变体蛋白W16-CA-MA,并对表达产物进行纯化.分离GST融合蛋白后,进行抗菌活性检测.结果 重组突变表达质粒DNA测序结果表明,在预期位点发生了突变;突变蛋白在大肠杆菌中的表达量约占茵体总蛋白的18%;纯化后蛋白纯度可达75%以上,并具有一定的抗菌活性.结论 已成功获得了具有抗菌活性的杂合肽突变体W16-CA-MA.
关键词： 天蚕素A-蛙皮素杂合肽 突变体 融合表达 抗菌活性 -
牛产气荚膜梭菌α-ε毒素基因的融合表达及其纯化
目的 融合表达产气荚膜梭菌α毒素基因和ε毒素基因的融合基因α-ε,并进行纯化.方法 利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌C57-8株基因组DNA中扩增出α毒素基因的部分基因片段,插入到质粒pET28a-ε上,构建含α-ε融合毒素基因的表达质粒pET28a-α-ε,转化至E coli BL21(DE3)plysS感受态细胞中,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化后,进行Western blot鉴定.结果 重组质粒pET28a-α-ε经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,与预期的基因序列重合率为99％.表达的重组蛋白相对分子质量约78 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的22.7％,纯度为91.2％,可与小鼠产气荚膜梭菌多抗血清特异性结合,具有良好的反应原性.结论 成功构建了重组质粒pET28a-α-ε,并在E coli BL21(DE3)plysS中表达了重组α-ε融合蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,可作为预防牛肠毒血症基因工程亚单位疫苗的候选抗原.
