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MAGE-A3多克隆抗体的制备及在胃癌细胞检测中的应用
目的:通过原核表达系统制备人黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)蛋白,制备其多克隆抗体,经鉴定后用于胃癌细胞检测.方法:将MAGE-A3全长核酸序列经原核密码子优化后全基因序列合成,克隆至原核表达载体pET21a(+),构建pET21a(+)/MAGE-A3重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达MAGE-A3蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化后的MAGE-A3蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆血清抗体,用ELISA、Western blot、免疫荧光技术分析该多克隆抗体的特异性,并用免疫组织化学技术鉴定MAGE-A3兔多克隆抗体在人胃癌细胞免疫检测应用中的可行性.结果:成功构建重组质粒pET21a(+)/MAGE-A3,并经原核表达系统表达MAGE-A3蛋白.SDS-PAGE显示目的蛋白分子质量大小约为48 kDa,与预期蛋白大小一致,并以His单抗进行Western blot鉴定,出现了特异性的单一条带.MAGE-A3蛋白免疫日本大耳白兔,可诱导兔产生特异性抗体,免疫后第8周达到高峰,经Western blot检测显示多克隆血清可特异性识别靶蛋白,出现阳性单一条带;经免疫荧光检测显示,在MAGE-A3阳性细胞A-375(黑色素瘤细胞株)和SGC-7901细胞(胃癌细胞株)的胞浆内出现荧光团块.表明兔多克隆抗体可特异性识别天然的MAGE-A3蛋白.结合免疫荧光结果后经ELISA检测,可认为该多克隆IgG抗体效价可达1:40000;免疫组织化学检测显示在A-375和SGC-7901肿瘤组织的胞浆内出现团块状棕黄色颗粒样沉淀,而在BGC-823肿瘤组织中呈阴性,表明制备的MAGE-A3兔多克隆抗体能够特异性地识别肿瘤组织中MAGE-A3蛋白.结论:通过原核表达系统制备了MAGE-A3蛋白,并免疫兔制备了MAGE-A3蛋白特异性兔多克隆抗体,同时可以特异性地识别人胃癌细胞中的MAGE-A3蛋白,可作为免疫诊断用抗原.
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乙型脑炎病毒膜蛋白B区多肽抗原的表达、纯化及血清学评价
目的 在原核表达系统中对乙型脑炎病毒包膜糖蛋白(E蛋白)的B区多肽抗原进行高效表达、纯化及血清学评价.方法 利用PCR技术从乙脑减毒活疫苗中扩增编码B区的DNA片段,酶切消化后连接到表达载体pET22b上,用此连接产物转化大肠埃希菌BL21(DE3)并表达B区多肽抗原,表达产物经液相层析纯化;用乙脑病人血清对纯化后的B区多肽抗原进行评价.结果 重组质粒pET22b-JEB经双酶切,其插入的外源基因片段为372 bp,与预期DNA片段大小一致.将纯化前与纯化后的蛋白作SDS-PAGE电泳,均可见一条约16kD的外源基因蛋白带,与计算的相对分子质量相符.经WB和ELISA血清学评价,表明重组B区多肽抗原具有较高的灵敏性及特异性.结论 成功构建了表达载体pET22b-JEB,在原核系统中表达的B区多肽抗原具有良好的血清学检测价值.
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结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化
构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的重组表达质粒,并对其表达产物进行纯化.用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pET-23a(+),构建pET-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌BL21(DE3);PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白.从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出esat-6基因片段,成功构建重组表达质粒pET-esat-6,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为6kD,经亲和纯化后的ESAT-6重组蛋白纯度高,且能被结核病人血清所识别.利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT-6重组蛋白,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础.
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重组人胰岛素类似物蛋白在大肠杆菌中克隆、表达与纯化
目的:设计合成编码Des30、B26H、B28D和B26H-B28D基因.用大肠杆菌BL21(DE3)表达上述4种速效人胰岛素原蛋白,为探知B26H-B28D功能和用植物系统表达速效胰岛素原类似物研究做必要的准备.方法:基于人胰岛素氨基酸和小C肽(TYPGDVPK)序列,按植物(油菜)偏爱密码子设计合成了198 bp编码人速效胰岛素原基因Des30.随后以Des30为模板,用PCR突变技术扩增并创造了基因B26H、B28D和B26H-B28D,井构建了4个原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导、用Ni-NTA亲和柱纯化、复性、胰岛素体外成熟(酶解)获得重组人胰岛素突变体蛋白.结果:4种人速效胰岛素原类似物在宿主菌中均以包涵体形式存在,IPTG诱导时间以8 h为佳.Western blot结果表明,带his-tag的速效人胰岛素原蛋白已成功在宿主菌中表达,用Ni-NTA亲和柱纯化获得了较纯的速效人胰岛索原蛋白.纯化的包涵体蛋白通过低温透析复性,然后用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切,Western blot结果显示.释放出的单体胰岛素与阳性对照一样具有免疫活性,RP-HPLC和MALDI-TOF质谱检测表明,酶切产物分子量峰值分别与预测的人胰岛素类似物分子量一致.结论:该研究为B26H-B28D功能研究和用植物系统表达人类胰岛素的研究奠定基础.
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Cys C的原核表达载体构建和鉴定
目的:构建人胱抑素C(Cys C)的原核表达载体,为进一步表达纯化Cys C重组蛋白奠定基础.方法:从HL-60细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增Cys C基因,再将目的基因克隆至PET32a(+)表达载体中,构建人Cys C原核表达质粒PET32a(+)/Cys C;再将此重组子进行双酶切电泳鉴定和测序鉴定.结果:酶切电泳鉴定结果显示Cys C基因克隆入载体中,测序结果证实克隆的基因序列与GeneBank中的Cys C序列相符.结论:获得了人Cys C原核表达质粒PET32a(+)/Cys C,为进一步表达和纯化Cys C重组蛋白奠定了工作基础.
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人胱抑素C的原核表达纯化鉴定及抗血清的制备
目的 构建人胱抑素C(cystatin C, Cys C)的原核表达载体,并用纯化的Cys C重组蛋白免疫家兔,制备Cys C抗血清. 方法 从HL-60细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增Cys C基因,将测序正确的目的基因克隆至pET32 (a)表达载体中,并诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达;所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化、透析复性、Western blot鉴定后,免疫家兔制备抗血清,抗体效价和特异性分别采用ELISA、Western blot进行检测.结果 测序证实克隆的基因序列与GeneBank中的Cys C序列相符;SDS-PAGE、Western blot结果证实获得相对分子质量为35×103的Cys C 融合蛋白,其表达形式为不溶性包涵体;此包涵体蛋白经Ni2+亲和层析能有效纯化,以该蛋白免疫家兔制备抗血清,抗体效价为1∶8 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合. 结论 获得了Cys C重组蛋白及特异性多克隆抗体.
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融合蛋白TAT-HIF-1α-PAS-B原核表达载体的构建、表达及纯化
目的 构建蛋白转导结构域TAT和人缺氧诱导因子1α PAS-B结构域融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化.方法 分别构建原核表达质粒pTAT-PAS-B、pET-PAS-B和pTAT-EGFP;在大肠杆菌BL21(DE3)pLyss内,以IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定,利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(NiNTA-His)亲和层析法对重组蛋白进行纯化.结果 成功构建了PAS-B结构域的原核表达载体,经过优化表达和纯化条件,融合蛋白在IPTG诱导下获得特异性表达,纯化得到了高纯度的目的蛋白.结论 含人缺氧诱导因子1αPAS-B和TAT结构域融合蛋白的成功表达及纯化,为应用该融合蛋白调控体内HIF-1α的活性奠定了基础.
关键词： 原核表达系统 TAT蛋白转导结构域 缺氧诱导因子1α PAS-B结构域 -
两种人乳腺珠蛋白基因亚型cDNA的克隆及其原核表达
目的克隆hMAM编码全长cDNA,建立hMAM蛋白原核表达系统及其纯化方法,为进一步研究hMAM的结构、功能及其在乳腺癌免疫诊断中的应用奠定工作基础.方法自乳腺癌组织和乳腺癌细胞株MD-MB453提取总RNA,通过RT-PCR克隆bMAMcDNA,构建pGEX-KG-hMAM表达质粒,在大肠杆菌BL21中表达,鉴定表达产物的形式后建立目的蛋白的纯化方法.结果乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中发现两种hMAMcDNA亚型:hMAM和hMAM(Isoform),长度分别为279和270bp,二者相差9个连续碱基,其翻译产物相差3个连续氨基酸残基;GST-hMAM蛋白在本原核表达系统中以不溶性包涵体形式存在,通过改良的纯化方案可以获得纯化的复性蛋白.结论获得hMAMcDNA并发现一个新的hMAM突变体;hMAM可在pGEX-KG中与GST融合,实现高效表达;通过本法建立的改良的纯化流程,可获得纯度达96.5%的hMAM的两种融合蛋白,为进一步研究两种亚型hMAM的结构、功能及其在乳腺癌免疫诊断中的应用奠定了工作基础.
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SERPINA3K原核表达系统的构建及其表达
目的:通过构建丝氨酸蛋白酶抑制因子SERPINA3K的原核表达载体,并将其转化到Rosetta-g ami2感受态细胞中,表达重组SERPINA3K,从而为对其功能的深入研究奠定了基础.方法:以小鼠MS-1细胞cDNA为模板通过PCR的方法扩增Serpina 3k基因的表达全片段,再将其插入到原核表达载体pET-41a中,酶切并测序鉴定重组体.将构建好的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta-gami2感受态细胞,表达产物用Western blot鉴定.结果:原核表达载体pET-4 1a-Serpina 3k成功构建,可在大肠杆菌Rosetta-gami2中高效表达,得到重组蛋白SERPINA3K,经Western blot鉴定正确.结论:成功构建SERPINA3K原核表达载体且获得表达,为研究SERPINA3K生物学活性及产品开发提供了实验基础.
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原核表达系统中 HPV16 L1蛋白的表达与纯化
为了建立HPV16L1蛋白原核表达系统的纯化方法,纯化目的蛋白,我们构建了pGEX4T-HPV16L1表达质粒.在大肠杆菌BL21表达系统中表达,经过包涵体提取,8M尿素溶解, 分级透析除去尿素,亲和层析进行提纯.结果显示,HPV16L1蛋白在原核表达系统以不溶性包涵体形式存在,通过本方法可以获得纯化的HPV16L1蛋白,为HPV16L1的应用研究打下了基础.
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人VIGILIN基因分段克隆及表达
目的 探讨入高密度脂蛋白结合蛋白(HDLBP)-VIGILIN蛋白与其他蛋白质相互作用的机制.方法 根据VIGILIN基因全长编码区的结构域,将VIGILIN基因全长编码区分为N端、KH1-7、KH8-12、KH13-14、C端5段,以pDsred2-N1/VIGILIN为模板分别扩增5个片段及全长cDNA后克隆至pGEX 5X 3原核表达载体,测序,然后将鉴定后的重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21中进行诱导表达GST-VIGILIN融合蛋白,并用SDS-PAGE电泳及Western blot检测蛋白表达结果.结果 成功扩增了人VIGILIN基因编码区分段片段,并且构建到原核表达载体中,经酶切、测序鉴定证实序列完全正确,重组载体构建成功,并且在pGEX原核表达系统中诱导表达GST-VIGILIN融合蛋白,经SDS-PAGE电泳及Western blot检测初步证实表达成功.结论 本实验首次根据VIGILIN蛋白不同的结构域成功构建了GST-VIGILIN分段克隆原核表达载体,并且对融合蛋白表达条件进行了优化,成功表达了GST融合蛋白.
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重组人细胞角蛋白9cDNA的原核表达及纯化
目的 克隆人细胞角蛋白CK9的cDNA,通过原核表达系统表达融合蛋白并进行纯化和鉴定.方法 从人角质形成细胞系(HaCaT)中提取RNA,以RT-PCR反转录cDNA,使用特异性引物PCR扩增出人CK9编码区全长并克隆到pET-28a载体上,再用IPTG诱导融合蛋白his-CK9的表达.表达的融合蛋白通过Ni2+亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 测序鉴定构建表达载体中CK9的cDNA序列正确;融合蛋白his-CK9可在大肠杆菌中诱导表达;纯化的融合蛋白his-CK9纯度较高;纯化的融合蛋白his-CK9可与商品化CK9抗体特异性结合.结论 成功构建原核表达载体pET-28a-CK9,并成功诱导及纯化融合蛋白his-CK9.
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多房棘球蚴重组蛋白 CTB_Emy162的原核表达及分离纯化#
目的：构建融合基因 CTB_Emy162原核表达系统，纯化得到多房棘球蚴重组蛋白CTB_Emy162。方法根据多房棘球蚴抗原 Emy162在 GenBank 中的序列，用生物信息学软件OptimumTM Codon 优化密码子适应指数（CAI）、优密码子频率（FOP）及 GC 含量从而获得适合大肠杆菌 BL_21表达的 Emy162基因序列。PCR 扩增 Emy162基因，定向在 pET_28a_CTB 的 CTB 基因5′端插入 Emy162基因。构建 CTB 和 Emy162双基因原核表达质粒 pET28a_CTB_Emy162，将该质粒转化于 E.coli BL_21（DE3）中，经 IPTG 诱导蛋白表达后，利用 Ni_NTA 柱亲和层析及离子交换色谱纯化后获得目的蛋白。结果 OptimumTM Codon 获得优化后的 Emy162序列，经生物公司测序及酶切鉴定结果证明重组质粒 pET28a _ CTB _ Emy162构建成功，进一步实验结果表明CTB_Emy162在原核表达系统 pET_28a 中主要以包涵体形式存在，在可溶部位少量表达。继而经Ni_NTA柱亲和纯化及离子交换色谱纯化获得 CTB _ Emy162纯蛋白。结论以大肠杆菌E.coli BL_21（DE3）及 pET _28a 构成的原核表达系统能够成功表达重组蛋白 CTB _ Emy162， Ni_NTA纯化柱能够纯化目的蛋白 CTB_Emy162。
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肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白2(FhSAP-2)的原核表达及分离纯化
目的 建立肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白2(FhSAP-2)原核表达系统.方法用生物信息学软件OptimumTM Codon优化密码子适应指数(CAI)、优密码子频率(FOP)及GC含量以获得适合大肠杆菌BL-21表达的FhSAP-2基因序列,并克隆到原核表达载体pET22b和pET28a中,经IPTG诱导其表达并经亲和层析及离子交换色谱纯化后获得目的 蛋白.结果 OptimumTM Codon获得优化后的FhSAP-2序列,经测序及酶切鉴定结果表明重组质粒pET22b-FhSAP-2、pET28a-FhSAP-2构建成功,进一步实验结果表明FhSAP-2在pET28a中包涵体部位表达,可溶部位不表达;在pET22b中可溶部位表达量低,包涵体部位无表达.继而经Ni-NTA柱亲和纯化及离子交换色谱纯化获得电泳纯的FhSAP-2蛋白.结论成功建立FhSAP-2的原核表达系统.
