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限制性显示技术制备HIV-1B亚型基因片段的研究
目前已知引起人类艾滋病(AIDS)的人类免疫缺陷病毒(HIV)有HIV-1和HIV-2两个型,其中在世界范围内流行的是HIV-1.该型已确定至少有A～J 11个亚型,而在我国则以B、C、E亚型为主[1].
关键词： 限制性显示 人类免疫缺陷病毒1型 DNA芯片 -
K562细胞株表达基因探针制作的探讨
目的研究基因芯片探针的制备方法,为K562细胞基因表达谱芯片的制作及其在基因表达研究中应用打下基础. 方法以人红白血病K562细胞株为材料,应用一种分离显示基因的新方法即限制性显示(RD-PCR)技术,分离DNA片段,作为基因芯片探针. 结果分离到近千个大小在200～500bp的基因片段,认为该方法可以克服DD-PCR中出现的假阳性较多的缺点,简单易操作,且利用该方法分离的基因探针,制备D NA微集芯片,同全长cDNA探针制作芯片相比,其探针长度小且相对均一,杂交动力学易于控制. 结论限制性显示技术为基因芯片探针的制备提供了一个全新的思路, 并将大大加速基因芯片技术及其应用研究.
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HIV-1基因限制性显示片段的制备（英文）
目的快速分离HIV-1基因片段制备DNA芯片探针. 方法以Sau3AⅠ酶切HIV基因后,将得到的限制性酶切片段两端接上接头.根据酶切位点与接头的序列设计通用引物.在该通用引物的3'端分别延伸1个碱基后,通过引物间的两两组合,将PCR反应分成10个亚组.纯化各组PCR产物,克隆到T载体上.挑取白色菌斑进行快速鉴定后扩大培养阳性克隆、提质粒.以质粒为模板扩增靶片段并测序. 结果每个亚型得到了十几个100～1 000 bp的HIV基因片段. 结论限制性显示技术是一种有效的快速分离制备基因片段的方法.
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HIV-1G亚型基因芯片的制备与杂交分析
基因芯片技术是一种高效、敏感、平行化的基因检测分析新技术[1],对临床疾病的诊断技术将产生革命性的影响,目前主要集中在感染性病原基因的检测方面.我们尝试将该技术应用于人免疫缺陷病毒(HIV)基因的检测与分型.首先制备HIV基因组探针并分别进行分析,实验中我们采用一种基因显示新技术:限制性显示(restriction display,RD-PCR)[2,3],制备HIV-1G亚型基因探针,并用基因芯片荧光标记杂交的方法对这些探针进行了杂交分析,为基因芯片技术在HIV感染检测的应用中奠定了基础.
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RD技术在HCV cDNA分型芯片探针制备中应用的初步研究
目的研究限制性显示(RD)技术在丙型肝炎病毒(HCV)cDNA分型芯片探针制备中的可行性.方法 Sau3A Ⅰ酶消化HCV-1、HCV-2各亚型全长cDNA,所得的片段与通用接头相连,通过10个选择性引物进行分组PCR,经PAGE电泳结合银染法进行分离,得到较纯净的HCV cDNA限制性片段.对这些片段做分子克隆,并测序鉴定.结果由HCV 3个亚型的全长cDNA得到66个大小相对均一(200～900bp)的限制性片段,平均每个亚型约22个.测序结果表明,属于HCV基因,可以作为HCV分型芯片的探针.结论 RD技术能快速收集大量长度适宜、大小均一的病毒基因片段,适合于分型诊断基因芯片探针的收集.
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限制性显示技术分离差异表达基因--Mac30
为了进一步从基因水平上阐明As2O3治疗白血病的作用机制,以更好地预防和治疗白血病,我们应用限制性显示PCR(RD-PCR)技术收集As2O3处理前后K562细胞的cDNA片段,用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并进一步筛选、分析了细胞内基因表达的变化情况.
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利用荧光标记的通用引物检测基因芯片的制备质量
[目的]报告一种新的基因芯片质量控制方法.[方法]采用限制性显示技术制备一种两端具有1段特异通用引物互补序列的探针,分别以不同浓度梯度的荧光标记通用引物(Cy3-UP)和随机引物(Cy3-RP)与芯片杂交,比较两者杂交效率.[结果]Cy3-UP的杂交结果显著优于Cy3-RP的杂交结果,在较低浓度就可显示较强的荧光信号.[结论]这种新的基因芯片质量控制方法具有较好的敏感性和特异性,可以用于基因芯片的质量控制.
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限制性显示技术在制备丙型肝炎病毒分型芯片探针的应用性研究
目的探讨限制性显示(restriction display,RD)技术在制备丙型肝炎病毒(HCV)分型芯片探针的可行性.方法用限制性内切酶Sau3A I消化HCV1a、1b、2a亚型全长cDNA,所得的限制性内切酶片段与通用接头相连,通过10个选择性引物进行分组PCR,使得各片段得以扩增并分布于10个亚组中,经聚丙烯酰胺电泳(PAGE)结合银染法进行分离.切胶回收后作3次PCR,得到较纯净的HCV cDNA限制性片段.对这些片段做分子克隆,并测序鉴定.结果由HCV 3个亚型1a、2a、1b的全长cDNA得到66个大小相对均一(200～900bp)的限制性片段,平均每个亚型约22个.测序结果表明,属于HCV基因,可以作为HCV分型芯片的探针.结论RD技术能快速收集大量长度适宜、大小均一的病毒基因片段,适合于分型诊断基因芯片探针的收集.
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K562细胞消减cDNA文库的构建及初步鉴定
背景与目的:消减杂交技术是一种寻找和克隆差异基因的方法.本研究目的是通过快速、高质量构建消减cDNA文库,筛选K562细胞中差异表达基因.方法:以用限制性显示(restriction display,RD)技术制备的K562细胞cDNA片段作为消减对象,以正常人淋巴细胞的Sau3A Ⅰ酶解cDNA片段对其进行消减.经过消减后的RD片段被分组扩增出来,并克隆于T载体中,挑选阳性克隆进行测序并进行初步分析.结果:构建的K562细胞消减cDNA文库,包含360个阳性克隆,插入片断大小范围在200～800 bp之间,选取50个克隆进行测序分析,结果为来源于42个已知基因.结论:利用自行建立的消减杂交法,成功构建了特异性K562细胞消减cDNA文库,文库质量可靠,可用于进一步筛选及克隆K562细胞中差异表达基因.
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HIV基因芯片的初步研究
目的建立HIV基因检测芯片的分析技术.方法分离HIV1U26942基因限制性显示片段作探针,应用PixSys5500点样仪将探针打印在氨基包被的玻片上制作基因芯片.然后与随机引物荧光标记的HIV样品进行杂交,以分析限制性显示基因片段的杂交动力学.经杂交后清洗和干燥,扫描芯片进行检测.结果对基因检测芯片的制作与检测的实验条件进行了初步研究并筛选了12个限制性显示基因探针.结论建立的检测芯片的实验方法可行且较特异.
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一个表达序列标签的克隆——应用限制性显示技术
目的应用限制性显示PCR(restriction displaypolymerase chain reaction,RD-PCR)技术分离克隆SH-SY5Y细胞的基因片段.方法从SH-SY5Y细胞中分离提纯mRNA,然后以Oligo(dT18)为锚定引物反转录生成单链cDNA,再以此为模板合成DNA的第二条链;将双链DNA经Sau3A Ⅰ酶切之后,接上接头,经通用引物和选择性引物扩增后,与载体pMD18相连,克隆、测序.结果分离出一段cDNA,经Blast分析,发现与基因组17号染色体的一段序列具有高度的相似性,运用GenScan分析这段DNA序列,提示这段表达序列标签(expressed sequencetag,EST)可能是一个未知基因的一部分.结论 RD-PCR技术是一种简便、有效的分离克隆基因片段的方法,运用生物信息学对EST的染色体定位以及下一步的实验可能具有一定的指导意义.
