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miR-93-5p靶向调控Smad5表达抑制小鼠C3H10T1/2细胞成骨分化的研究
目的 探讨miR-93-5p是否通过靶向调控其预测靶基因Smad5的表达,从而抑制小鼠MSCsC3H10T1/2细胞的成骨分化.方法 构建Smad5 3'-UTR-荧光素酶报告载体(pmiR-RB-REPORTTM),通过双荧光素酶报告基因检测,观察miR-93-5p对Smad5 3'-UTR荧光素酶活性的影响,鉴定Smad5是否为miR-93-5p的靶基因.将miR-93-5p mimics(M组)与miR-93-5p inhibitor(In组)及其对应的阴性对照组miR-93-5p mimics阴性对照(MC组)与miR-93-5p inhibitor阴性对照(InC组)分别转染至C3H10T1/2细胞中,并进行成骨诱导培养,48 h后分别采用实时荧光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)及Westemblot检测各组细胞Smad5在mRNA及蛋白水平的相对表达量;14d后通过茜素红染色检测各组细胞外钙盐的沉积情况,了解miR-93-5p对C3H10T1/2细胞成骨分化的调控效应.结果 双荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-93-5p能与Smad5 mRNA3'-UTR特异性结合,抑制其荧光素酶活性(p＜0.05).qRT-PCR检测示,M组及In组Smad5的mRNA相对表达量与对应阴性对照组MC组及InC组比较差异均无统计学意义(P＞0.05);Western blot检测示,M组及In组Smad5蛋白相对表达量与对应阴性对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),其中M组较MC组表达量下调,而In组则较InC组表达量上调.茜素红染色示,M组钙盐沉积较MC组明显减少,而In组则较InC组钙盐沉积明显增多.结论 Smad5是miR-93-5p的靶基因,miR-93-5p可通过靶向调控Smad5的表达,抑制小鼠C3H10T1/2细胞成骨分化.
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MSCs老化研究进展
目的 综述MSCs老化研究进展,总结在MSCs老化研究中取得的成就和当前面临的困境. 方法 广泛查阅国内外有关MSCs老化研究的文献,并进行综述. 结果 人工转导使MSCs表达端粒酶延缓老化,甚至使细胞永生,但也存在潜在安全隐患;年龄相关的细胞老化研究由于研究对象选择不规范,导致结果不一;从多方面改善细胞体外培养条件有助于延缓老化;氧化应激学说似乎并不能很好说明细胞老化现象. 结论 MSCs老化机制研究仍是组织工程种子细胞研究难点,针对MSCs老化机制的研究有助于加速组织工程向临床应用转化.
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血管化组织工程骨构建中细胞共培养体系的研究进展
目的 对构建血管化组织工程骨的细胞共培养体系策略进行综述. 方法 广泛查阅近年有关血管化组织工程骨构建中细胞共培养的相关文献,并对成骨细胞和内皮细胞两种细胞的选择,培养模型和维度,支架材料制备及表面修饰,作用机制,培养条件和应用进展进行综述. 结果 血管化是组织工程骨构建及其临床应用的前提条件.能分化成骨的成体干细胞MSCs和定向分化为内皮细胞的内皮祖细胞共培养体系是目前的研究热点.培养条件的进一步优化及其如何实现以微创和自体移植为目标的临床应用尚需进一步研究. 结论 细胞共培养体系策略在血管化组织工程骨构建中具有广阔的临床应用前景.
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微小RNA-451靶向调节钙结合蛋白39对MSCs成骨分化的促进效应
目的 探讨微小RNA-451(micro RNA-451,miRNA-451)靶向调节钙结合蛋白39(calcium binding protein 39,CAB39)表达,促进MSCs向成骨细胞分化的效应. 方法 选择pMIR-report质粒及pRL-TK质粒,通过双荧光素酶基因报告系统,鉴定CAB39是否为miRNA-451的靶基因.将pre-miRNA-451(A组)及anti-miRNA-451(C组)分别转染到C3H10T1/2细胞中,同时设置相应的pre-miRNA阴性对照组(B组)和anti-miRNA阴性对照组(D组)；成骨诱导培养7、14 d,采用实时荧光定量PCR检测成骨标志物Runx2、ALP mRNA相对表达量;诱导培养14 d,采用Western blot检测细胞中CAB39蛋白表达,茜素红染色观察细胞外钙基质沉积情况. 结果 经鉴定,CAB39是miRNA-451的靶基因.实时荧光定量PCR检测示,成骨诱导培养7、14d,A组Runx2、ALP mRNA相对表达量显著高于B组,C组显著低于D组,差异均有统计学意义(P＜ 0.05).成骨诱导培养14d,Western blot检测示A组CAB39蛋白表达量为0.55士0.05,较B组1.00±0.07明显降低；而C组为1.21士0.05,较D组1.00±0.04明显增高；差异均有统计学意义(P＜ 0.05).茜素红染色示A组细胞外钙基质沉积较B组明显增多,而C组细胞外钙基质沉积较D组明显减少. 结论 miRNA-451可通过抑制CAB39表达,促进MSCs成骨分化.
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MSCs修复烧伤创面的研究进展
目的 综述MSCs修复烧伤创面的研究进展. 方法 广泛查阅MSCs参与修复烧伤创面及其相关机制方面的文献,并进行分析总结. 结果 MSCs具有自我更新、快速增殖、分化及旁分泌功能,通过分化为各种皮肤创面细胞及调节创面微环境,促进烧伤创面修复. 结论 MSCs在烧伤领域具有广阔应用前景,但烧伤创面的恶劣微环境也对细胞生存及转归提出了挑战.
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椎间盘再生的治疗策略
目的 对椎间盘再生的种子细胞、支架材料、生长因子及应用前景进行综述. 方法 广泛查阅近年有关以生物学修复重建为基础的椎间盘再生策略,包括细胞治疗和组织工程的相关文献,并对新进展进行综述. 结果 以MSCs为基础的种子细胞和多重仿生支架材料的设计是研究热点,如何有效结合种子细胞、支架材料和生长因子的相互作用及其调控尚需进一步研究. 结论 椎间盘的生物学再生手段具有广阔的临床应用前景.
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组织工程骨软骨复合体构建的研究进展
目的 对构建组织工程骨软骨复合体的相关研究进展进行综述,讨论构建中存在的不足. 方法 广泛查阅近年来国内外有关组织工程骨软骨复合体构建研究的相关文献,并对新进展进行综述. 结果 构建组织工程骨软骨复合体的体内研究较多,将不同组织来源的MSCs作为种子细胞是研究热点；单相支架的应用受到限制,双相和三相支架的研究是新趋势；生物反应器的设计和性能还需进一步优化. 结论 构建组织工程骨软骨复合体将有望成为一种治疗软骨缺损的具有潜力的方法.
关键词： 组织工程骨软骨复合体 MSCs 支架 生物反应器 -
髓核细胞表型标记的研究进展
目的 综述髓核细胞表型标记的研究进展.方法 广泛查阅近年关于髓核细胞表型标记的文献,并对其进行分析.结果 由于不同的生物力学特性,髓核细胞和关节软骨细胞的形态及细胞外基质组分如蛋白多糖与Ⅱ型胶原α1的比率存在差异;通过髓核细胞的表面标记(CD24)、基因标记(低氧诱导因子1α、葡萄糖转运蛋白1、基质金属蛋白酶、VEGF-A等)及细胞内各种分子标记(角蛋白19和磷脂酰肌醇聚糖3、配对盒1、叉头蛋白和整联蛋白涎蛋白等)可以初步鉴别髓核细胞.结论 髓核细胞与关节软骨细胞表型标记存在差异,但仍缺乏特异性标记物.
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兔自体细胞-载体复合物修复关节软骨缺损的实验研究
目的 研究兔MSCs向软骨细胞方向诱导后复合自体双相骨基质明胶(bone matrix gelatin,BMG)对膝关节软骨缺损的修复作用.方法 健康成年新西兰大白兔24只,雌雄不限,体重2～3 kg,随机分为A、B、C组,每组8只.取A组骨髓行原代培养,胰酶消化按1:2比例传至第5代,倒置相差显微镜观察细胞形态.取1、3、5代细胞绘制生长曲线.于第3代MSCs生长密集时加入TGF-a1 10 ng/mL、IGF-1 10 ng/mL、维生素C 50 ng/mL诱导8 d后倒置相差显微镜下观察,爬片行免疫组织化学及Mallory染色.取A组髂骨按Urist方法 制备双相BMG,将第3代经诱导8 d得到的种子细胞以5 X 106/mL密度接种于自体BMG制备细胞.载体复合物,体外培养3 d后扫描电镜观察.制作膝关节软骨直径3 mm,深3 mm的缺损模型,A组植入自体细胞.载体复合物,B组植入自体BMG,C组不作处理,第8、12周取材行大体观察、HE染色、免疫组织化学染色观察,Wakitani法组织学评分.结果 倒置相差显微镜观察MSCs原代细胞呈短梭形;传代细胞呈长梭形.传代细胞1～3 d增殖缓慢,3 d后增殖旺盛,7～8 d进入平台期,第3代增殖为旺盛.诱导后MSCs细胞呈椭圆形,Ⅱ型胶原、S-100免疫组织化学染色阳性,Mallory染色胞浆蓝染.细胞-载体复合物扫描电镜观察:BMG结构符合细胞载体要求,细胞种植于BMG后生长良好.动物实验:大体观察A组术后8、12周缺损处均由透明软骨样组织修复,8周较12周表面稍凹陷;B、C组术后8、12周均为纤维样组织修复,表面凹凸不平.组织学观察HE染色A组术后8、12周修复组织与周围软骨组织结合良好,以圆形、椭圆形透明软骨样细胞为主,12周较8周细胞数多且大:B、C组均为纤维样组织修复,12周较8周纤维样组织增厚.Ⅱ型胶原免疫组织化学染色A组术后8周呈阳性、12周呈强阳性;B、C组均无表达.Wakitani评分术后8周A、B、C组分别为(3.50±1.51)、(10.00±1.41)、(12.00±0.93)分,术后12周分别为(1.13±0.99)、(8.38±1.30)、(10.13±1.64)分,A组优于B、C组,B组优于C组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 自体MSCs向软骨细胞方向诱导后,复合自体BMG对关节软骨缺损有较好的修复作用.
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间充质干细胞在肿瘤发展过程中的作用
肿瘤间质在肿瘤发展过程中的作用逐渐受到人们的重视,作为肿瘤间质的重要组成成分之一,骨髓来源的间充质干细胞,在肿瘤的发生发展中有着不可忽视的作用.本文对间充质干细胞与肿瘤发生发展的研究进展作一综述.
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胃癌来源exosomes诱导间充质干细胞促进裸鼠皮下移植瘤生长
目的:探讨胃癌细胞(SGC7901细胞)来源exosomes作用于人脐带来源间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs)其EMT(epithelial-mesenchymal transition)相关分子表达以及对SGC7901细胞裸鼠皮下移植瘤的影响.方法:采用离心超滤和蔗糖密度梯度超速离心方法从胃癌细胞株SGC7901细胞的培养上清液中分离出胃癌细胞exosomes,透射电子显微镜观察其大小和形态,Western blot检测其标志性蛋白CD9和CD81的表达.Western blot分析SGC7901细胞分泌exosomes作用于hucMSCs后其EMT相关分子TGF-β、IL-6和N-cadherin的表达水平;裸鼠皮下移植瘤实验观察裸鼠移植瘤的生长情况.结果:透射电子显微镜下观察SG7901-exosomes具有椭圆或碟状的囊泡结构;直径在30 ～ 100 nm之间,表达CD9和CD81蛋白;SGC7901-exosomes作用于hucMSCs后其EMT相关分子TGF-β、IL-6和N-cadherin的表达水平升高;且SGC7901-exosomes诱导过的hucMSCs能促进裸鼠皮下肿瘤的发生和发展.结论:SGC7901分泌的exosomes能促进hucMSCs高表达TGF-β、IL-6和N-cadherin;能促进SGC7901细胞裸鼠皮下移植瘤的发生和生长.
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骨髓基质细胞脑室内移植对脑外伤后神经功能障碍的治疗作用
目的:探讨骨髓基质细胞(MSCs)移植到实验性脑外伤大鼠侧脑室后对神经功能障碍的治疗作用.方法:从GFP转基因SD大鼠分离MSCs,体外扩增至第五代.取SD大鼠96只,供制作模型.其中随机选取24只作为正常对照组,72只采用Feeney自由落体方法建立大鼠脑外伤模型,造模后7 d,随机分为三组:MSCs治疗组、IMDM对照组、TBI对照组,每组24只.MSCs治疗组经侧脑室移植MSCs,IMDM对照组经侧脑室注射同体积的IMDM基础培养液,TBI对照组经侧脑室空白进针,分别于移植后2、4、8、12周末,以神经功能评分和免疫荧光染色评价MSCs移植后对大鼠神经功能的改善情况和在大鼠脑内存活迁移情况.结果:经侧脑室移植的MSCs可向脑损伤区域迁移,少数能表达一些神经元和星形胶质细胞的特异性标志物,如NeuN和GFAP.侧脑室移植MSCs治疗组大鼠神经功能恢复的程度优于侧脑室注射IMDM对照组和TBI对照组,有统计学差异(P<0.05),IMDM对照组和TBI对照组神经功能恢复的程度相比无明显差异(P>0.05).结论:MSCs通过侧脑室同种异体移植后能存活并向损伤区域迁移聚集,少数可分化为神经元和星形胶质细胞,可促进外伤性脑损伤所造成的神经功能障碍的恢复.
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Wnt3a促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化
目的:寻找促进骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的Wnt信号分子.方法:首先体外分离培养大鼠MSCs并传代,形态学观察和流式细胞学检测细胞表型CD44、CD9、CD34和CD45.采用bFGF分别联合Wnt3a或Wnt5a的方案诱导分化.免疫组化和RT-PCR的方法比较Wnt3a和Wnt5a对MSCs向神经元样细胞分化的影响.结果:MSCs为长梭形,CD9、CD44高表达,CD34、CD45低表达.Wnt3a诱导组的Nestin和NSE呈阳性,而GFAP无明显表达,诱导后细胞的活力良好.Wnt5a诱导组Nestin呈弱阳性表达,而NSE及GFAP阴性.RT-PCR结果显示Wnt3a诱导组Nestin在诱导前后均有表达,NSE在诱导后5 d可见明显的扩增条带,10 d后更加明显.GFAP在诱导10 d后出现较弱的扩增条带.Wnt5a组、对照组MSCs在诱导后10 d Nestin有微弱表达,NSE和GFAP几乎无表达.结论:Wnt3a分子能够促进体外培养的MSCs向神经元样细胞分化.
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光损伤鼠视网膜片培养上清液诱导 MSCs 分化为视网膜样细胞的研究
目的：应用大鼠视网膜片光损伤后的培养上清液，在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（ mesenchymal stem cells ， MSCs）成为视网膜样细胞的可能性。
方法：贴壁筛选法分离、培养大鼠MSCs ，流式细胞仪对其细胞纯度鉴定。取材大鼠视网膜神经上皮层作为视网膜片，常规石蜡切片HE染色鉴定各层组织完整性。电镜观察大鼠视网膜片光损伤程度。制备3种诱导分化大鼠MSCs的条件培养液。3种条件培养液均培养诱导至第3代大鼠MSCs 7～8d，用RT-PCR检测视紫红质（Rhodopsin）、神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、胶质纤维酸性蛋白（ glial fibrillary acidic protein ，GFAP）等视网膜细胞标志物在诱导后细胞中的表达情况。
结果：HE染色显示大鼠视网膜片取材结构完整，电镜显示大鼠视网膜片光损伤后结构损伤严重。 RT-PCR鉴定：条件培养液诱导大鼠MSCs 7～8d，条件培养液Ⅰ组Rhodopsin （0．3915±0．00644）、NSE （0．2019±0．00682）、GFAP （0.1972±0．00211），条件培养液Ⅱ组Rhodopsin（0．0983±0．00319）、NSE （0．1048±0．00323）、GFAP （0．1040±0.00254），条件培养液Ⅲ组Rhodopsin（0．0044±0．00126）、NSE（0．0498±0．00149）、GFAP（0．0467±0．00333），组间差异有统计学意义。
结论：光损伤大鼠视网膜片培养上清液可诱导大鼠MSCs分化为视网膜样细胞，为干细胞治疗视网膜变性疾病提供新思路。 -
Ad-HGF修饰MSCs异体移植对烧伤创面愈合的作用
目的:探讨携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(Ad-HGF)修饰的骨髓间充质干细胞(MSCs)局部异体移植对烧伤创面愈合的作用.方法:密度梯度离心法体外分离培养雄性Wistar大鼠MSCs,并以感染复数(MOI=100)体外转染Ad-HGF.30只雌性Wistar大鼠随机分为:MSCs治疗组(A组),Ad-HGF修饰MSCs治疗组(B组),Ad-GFP修饰MSCs治疗组(C组),Ad-HGF治疗组(D组),空白对照组(E组).复制大鼠深Ⅱ度烧伤模型,将细胞悬液、病毒悬液及生理盐水于创面下多点注射.伤后3、5、7、14、21 d观察创面收缩率并采集创面标本,行HE染色观察创面愈合情况.结果: 伤后7、14 d B组与A组、C组、D组、E组比较,创口收缩率显著提高(P＜0.05); HE染色可见B组表皮明显厚于其他各组,并可见钉脚下伸.结论:Ad-HGF修饰MSCs异体移植可显著提高烧伤创面愈合速度和质量,为烧伤创面修复提供了新的策略.
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淫羊藿含药血清对绝经后骨质疏松症大鼠MSCs成脂分化干预作用研究
目的:探讨淫羊藿含药血清对绝经后骨质疏松症大鼠MSCs成脂分化的干预作用.方法:SPF级SD雌性大鼠,共15只.无菌条件下分离培养骨髓间充质干细胞,传至3代.将所获的细胞随机分为空白组、成脂诱导组、成脂诱导西药组、成脂诱导中药高剂量组、成脂诱导中药中剂量组、成脂诱导中药低剂量组共6组,每组8孔.通过淫羊藿高、中、低剂量含药血清以及尼尔雌醇含药血清配合成脂诱导剂分别对MSCs进行干预,并与空白组、成脂诱导剂组进行对比;观察各组干预后7,14 d成脂分化情况.结果:诱导第7 d,与空白组比较,中药各组油红染色均呈显著性差异(P<0.05);成脂诱导组呈极显著性差异(p＜0.01);与成脂诱导组比较,成脂诱导西药组油红染色有极显著性差异(P＜0.01),但成脂诱导中药组呈显著性差异(P＜0.05).诱导第14 d,各组与空白组比较均呈显著性或极显著性差异(P＜0.05,P＜0.01);与成脂诱导组比较,成脂诱导中药高剂量组油红染色呈显著性差异(P＜0.05),成脂诱导西药组有极显著性差异(P＜0.01).结论:成脂诱导中药高剂量组及成脂诱导西药组均能抑制MSCs成脂分化,但短时间内高剂量淫羊藿含药血清功效略逊于西药尼尔雌醇.
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双机群集方案在CIQ2000系统服务器升级中的应用
通过分析比较小型机以及PC服务器群集技术方案,总结了群集技术的分类;根据CIQ2000系统服务器升级改造的要求,设计了双机群集方案;选择了双机群集系统的硬件配置、工作模式、群集软件等,并安装实现CIQ2000系统与ORINET系统的双机互备群集;简要介绍了双机群集系统的应用效果.
