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等位基因特异荧光PCR法检测CYP2C19基因型
目的 了解人群CYP2C19基因型的分布,评价等位基因特异荧光PCR法检测CYP2C19基因型.方法 等位基因特异荧光PCR法和金标准Sanger DNA直接测序法检测356名供者外周血CYP2 C19基因型,实验采用同步盲法.结果 CYP2C19*1/*1型、CYP2C19* 1/*2型、CYP2C19* 2/*3型、CYP2CI9* 3/*3型、CYP2C19* 2/*2型及CYP2C19* 1/*3型的频率分布:使用PCR荧光法检测时分别为46.6％ (166/356)、33.2％ (118/356)、2.0％(7/356)、0.8％(3/356)、10.7％(38/356)及6.7％(24/356);采用DNA测序法时分别为46.3％(165/356)、33.4％(119/356)、2.0％(7/356)、0.8％(3/356)、11.0％(39/356)及6.5％(23/356).两种方法检测CYP2C19基因型具有一致性(P =0.392),且一致性较好(Kappa=0.987)；两种方法基因型检测结果一致率为99.2％.结论 为保障医疗安全,临床需开展CYP2C19基因型检测；等位基因特异荧光PCR法检测CYP2C19基因型简便可靠.
关键词： CYP2C19 基因型 等位基因特异荧光PCR DNA直接测序 -
类孟买型ABO基因的检测
为研究类孟买型ABO基因的分子基础,在吸收放散试验、唾液血型物质凝集抑制等血清学试验基础上,用PCR-SSP法对5例类孟买型样本进行ABO血型的基因定型,并进行ABO基因第6、第7外显子测序.结果表明,本研究的5例类孟买血型样本,经PCR-SSP法基因定型,其ABO基因型分别为A102B1、A102B1、A102O1、A102B1、B1O1;经直接测序实验,该5例样本的ABO基因测序结果与PCR-SSP基因定型结果相一致,未检测出新的点突变.结论:应用PCR-SSP方法可对类孟买型个体进行常规ABO基因定型,具有简便、快速、可靠的特点.
关键词： 类孟买型 ABO基因 聚合酶链反应-序列特异性引物扩增 DNA直接测序 -
基于PCR技术的中药DNA分子标记鉴别
综述基于PCR技术的中药DNA分子鉴别研究,重点论述了RAPD法和DNA直接测序法的应用,提出了DNA分子鉴别研究的思路与实验设计.
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特异荧光PCR对人ALDH2基因型的研究
目的 评价人ALDH2基因多态性检测试剂盒(荧光PCR法)用于人ALDH2基因c.1510位点(G/A)核苷酸多态性检测的准确性和有效性.方法 将入选人基因组DNA标本371例采用金标准和临床待考评试剂盒进行同步盲法检测,试验结束后揭盲,将试验试剂检测结果与金标准检测结果进行统计比较分析.结果 人ALDH2基因多态性检测试剂盒(荧光PCR法)与DNA直接测序法(Sanger测序法)金标准检测结果相比,两者基因型总符合率为99.19％,临床诊断评价总符合率99.46％,有较高的一致性.结论 人ALDH2基因多态性检测试剂盒(荧光PCR法),无放射性危害,具有高灵敏性、高特异性、试剂周期长等特点,可以在临床检验中推广使用.
关键词： 线粒体乙醛脱氢酶2 基因型 等位基因特异荧光PCR DNA直接测序 -
免疫组织化学法检测肺癌患者EGFR敏感突变的临床研究
目的 探讨免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测EGFR突变的应用价值.方法 通过针对delE746-A750、L858R突变的特异性抗体检测肺癌患者EGFR突变状态,并且与DNA直接测序法进行对照.结果 136例标本中IHC评分0分的48例,其中DNA直接测序法检测突变的3例、评分1+的53例中突变的11例、2+的27例中突变的22例、3+者中的8例均存在EGFR突变.以≤1+为阴性,≥2+为阳性,敏感度为71.43％,特异性为94.68％,阳性预测值(positive predictive value,PPV)为85.71％,阴性预测值(negative predictive value,NPV)为88.12％,κ值为0.683.结论 免疫组织化学检测EGFR突变应以评分≤1+为阴性,≥2+为阳性来评估EGFR突变状态.
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胶质母细胞瘤与IDH1基因突变的关系
目的:探讨IDH1基因突变在胶质母细胞瘤发生、发展中所起的作用.方法:通过提取肿瘤细胞DNA、设计合成引物、目的片段PCR扩增、DNA直接测序对胶质母细胞瘤患者IDH1基因4号外显子进行筛查,了解IDH1基因突变频率、位置、类型等,分析基因型与临床表型的关系.结果:在57例胶质母细胞瘤标本中总共发现了19例突变,其中原发胶质母细胞瘤4例,继发胶质母细胞瘤15例,儿童胶质母细胞瘤0例,全部为4号外显子132号密码子杂合性、错义、点突变.结论:IDH1基因突变可能是胶质母细胞瘤发生、发展过程中的重要分子事件,原、继发胶质母细胞瘤,成人、儿童胶质母细胞瘤可能起源于不同的分子机制.
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一个BDC家系突变筛查及其结果分析
目的:对临床诊断为C型短指症(BDC)的家系进行突变筛查分析,寻找致病基因的分子缺陷,明确其疾病诊断.方法:收集一个BDC家系与11名正常对照,对该BDC的家系与对照样本进行DNA提取后进行GDF5基因扩增后进行直接测序分析.结果:检测到该BDC家系患者GDF5基因:c.826G＞T与c.1017A＞G变化,c.826G＞T可导致276位丙氨酸变为丝氨酸(p.A 276S),而c.1017A＞G的氨基酸在339位仍为赖氨酸.c.826G＞T位点存在于11名正常对照中,而c.1017A＞G位点在6名正常对照中存在.结论:该家系GDF5基因c.826G＞T,c.1017A＞G两个位点变化可能为与BDC相关的新的SNP位点.
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早发性帕金森综合征的PINK1基因变异分析
目的:探讨中国大陆汉族早发性帕金森综合征(early-onset Parkinsonism,EOP)患者PTEN诱导激酶1(PTEN-induced kinase 1,PINK1)基因突变特点.方法:在149例汉族EOP患者中应用DNA直接测序技术(DNA sequencing)检测PINK1基因点突变及小的插入/缺失,应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术检测PINK1基因大片段插入/缺失及重排突变.结果:在本组EOP患者中共发现5例患者存在4个突变,包括3个点突变c.832C>G,c.938C>T和c.1 220G>A,1个第3～8号外显子杂合缺失,其中c.832C>G为新突变;14个已知多态位点,1个新多态位点c.899+18G>A.对多态位点c.189C>T的卡方检验显示EOP组与正常对照组差异有统计学意义(基因型χ2=21.244,P<0.0001;T等位基因χ2=24.353,P<0.0001),对多态位点c.960-5G﹥A的卡方检验显示EOP组与正常对照组差异有统计学意义(基因型χ2=6.524,P=0.038;A等位基因χ2=6.725,P=0.0095).结论:中国大陆汉族EOP患者中存在PINK1基因点突变以及外显子重排突变,本组EOP患者PINK1基因突变率为3.35%,多态位点c.189C>T与c.960-5G>A为中国大陆EOP患者易感因素.
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X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良家系SEDL基因突变研究
目的确定中国汉族人中一个X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良(spondyloepiphyseal dysplasia tarda ,SEDL)大家系SEDL基因突变类型,探讨SEDL发病的分子基础.方法用聚合酶链反应扩增产物双向直接测序方法检测了患者构成SEDL基因可读框的第3～6外显子及相邻侧翼区的DNA序列,将测序结果与GenBank公布的SEDL基因正常序列对比找出突变.然后在家系其他成员中证实该突变. 结果在2例患者(Ⅳ15、Ⅴ3)SEDL基因第2内含子剪接受体处发现了IVS2 -2A→C突变,4个外显子的核苷酸序列未见改变.该突变在4例女性携带者得到证实,她们的基因型表现为野生型与突变型杂合现象.家系中2名未受累男性和15名无关健康个体未检测到这一突变.在该家系还检测出4个无症状的携带者. 结论首次发现SEDL基因IVS2 -2A→C突变.该突变引起SEDL基因第2内含子3′端剪接受体改变,使之不能与外显子3正常剪接,可能是SEDL发病的分子基础.检测该突变可进行基因诊断,有重要的临床价值.
关键词： 迟发性脊椎骨骺发育不良 基因突变 DNA直接测序 剪接受体 -
p53基因突变与喉癌生物学行为的关系
目的探讨p53基因突变与喉癌生物学行为的关系。方法 应用聚合酶链反应单链构象多态性(PCRsingle strand conformation polymorphism, PCRSSCP)银染技术结合DNA直接测序,检测喉鳞癌新鲜或冰冻组织中p53外显子5～8的基因突变。结果 ⅠⅡ、ⅢⅣ喉鳞癌p53基因突变率分别为69.2%(18/26)和85.3% (29/34),P>0.05; 高、中、低分化程度的突变率依次为52.9%(9/17)、83.3%(20/24)和94.7%(18/19),P<0.05;有、无颈淋巴结转移者突变率分别为96.4%(27/28)和62.5%(20/32),P<0.01。从47例SSCP阳性标本中随机抽取20例进行测序,19例测序为阳性,二者符合率为95%。结论 p53基因突变与病理分化程度及颈淋巴结转移有明显相关性。
关键词： 喉鳞癌 p53基因 聚合酶链反应-单链构象多态性 基因突变 DNA直接测序 -
p53基因第8外显子在喉癌中的缺失和点突变
目的探讨抑癌基因p53第8外显子突变在喉鳞癌分子发病机理中所起的作用.方法应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)银染技术和DNA直接测序法,检测喉鳞癌新鲜组织中抑癌基因p53基因第8外显子的突变情况.结果 60例喉鳞癌组织中,15例发生迁移率异常的SSCP区带.在SSCP阳性样本中随机抽出4例进行测序分析,发现两个标本在288位密码子缺失一个A,两个标本在292位密码子上缺失一个A.285、287密码子上共发生3次G→T的颠换,286密码子第3位碱基发生A→T的颠换.结论喉鳞癌p53基因点突变与碱基缺失常常同时并存.p53基因第8外显子突变在喉癌的发生中可能起着重要作用.
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结核分支杆菌耐喹诺酮分子机制的研究
目的了解结核分支杆菌耐喹诺酮药物的分子机制,建立快速的药敏的方法.方法通过16S rRNA聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术分析77株分支杆菌临床分离株;通过PCR-SSCP和直接测序技术(PCR-DS)分析结核分支杆菌的gyrA基因突变的情况.结果75株为结核分支杆菌复合群.以结核分支杆菌标准菌株H37Rv和卡介苗为对照,30株喹诺酮敏感株的gyrA基因的SSCP图谱均泳动正常,测序分析与对照株相同.45株耐喹诺酮的菌株中,34株(75.6%)gyrA基因SSCP图谱泳动异常;测序证实10株为90位密码子的突变,24株为94位密码子突变,所有gyrA突变株的氧氟沙星4μg/ml≤MICs≤32μg/ml,左氧氟沙星2μg/ml≤MICs≤16μg/ml.结论gyrA基因突变,尤其90位和94位密码子突变是结核分支杆菌耐喹诺酮的主要分子机制,PCR-SSCP可能成为测定部分结核分支杆菌喹诺酮耐药基因型的简便、快速的方法,并有望直接用于临床标本喹诺酮敏感性试验.
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ARLTS1基因在早发性卵巢癌中的突变分析
目的 探讨中国南方地区汉族妇女早发性卵巢癌与ADP核糖体化因子样肿瘤抑制基因1(ARLTS1)突变的关系.方法 采集早发性卵巢癌、晚发性卵巢癌患者及健康对照妇女的病理石蜡卵巢癌标本及新鲜血液标本,抽提DNA行ARLTS1基因的PCR扩增, 扩增产物进行高效液相色谱法分析(DHPLC),对杂合峰型的DNA样本测序以确定特异性的突变.结果 早发性卵巢癌组ARLTS1 Cys148Arg(T442C)基因突变所致的发病风险显著高于健康对照组(TC+CC vs TT, OR=3.93, 95% CI为1.50～10.32, P=0.0044; CC vs TT, OR=5.25, 95% CI为1.28～21.58, P=0.017).与晚发性卵巢癌组相比,ARLTS1 Cys148Arg基因突变也可显著增高早发性卵巢癌风险(TC+CC vs TT, OR=3.56, 95% CI为1.36～9.33, P=0.0085; CC vs TT, OR=4.0, 95% CI为1.04～15.38, P=0.038).与健康对照组相比,ARLTS1 Cys148Arg基因突变对晚发性卵巢癌的发病风险影响无明显差异(TC+CC vs TT, OR=1.11, 95%CI为0.46～2.66, P=0.82).ARLTS1 Ser99Ser (S99S)突变在早发性卵巢癌组、晚发性卵巢癌组和健康对照组间发生率均差异无统计学意义.结论 ARLTS1 Cys148Arg突变与早发性卵巢癌发生风险显著相关,提示ARLTS1基因突变可能是早发性卵巢癌发病相关的重要遗传学因素.
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基于基因芯片技术的人乳头瘤病毒分型检测方法及应用评价
目的 评价基因芯片法人乳头瘤病毒分型检测试剂盒(HPG)的临床应用价值.方法 采集慢性宫颈炎或不规则阴道流血女性的宫颈上皮脱落细胞151例,应用HPG检测方法、第二代杂交捕获技术(HC2)检测方法以及DNA直接测序法进行检测,通过对HPG与HC2、DNA直接测序结果的平行对照,对HPG检测方法进行评价.结果 HPG检测方法和HC2检测方法的总一致率为87.42％(kappa=0.75,P＜0.05),以DNA直接测序结果为金标准,HPG检测方法对高危险HPV的灵敏度和特异度分别是100％、96.49％,HPG方法和DNA直接测序方法的一致率为98.70％(kappa=0.97,P＜0.05).通过HPG检测结果发现,多重HPV感染率为23.84％,HPV阳性感染率较高的HPV亚型依次为HPV 16(13.25％)、58(11.92％)、52(11.92％)、31 (6.62％)、39(5.96％)、33(5.96％).结论 HPG检测法和HC2检测法以及DNA直接测序法有着良好的一致率,HPG检测法可以实现HPV准确分型检测,适用于临床检测工作的需要.
