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匹诺塞林缓解大鼠肝细胞系BRL-3A低氧/复氧损伤
目的 探讨匹诺塞林(PIN)对低氧/复氧(H/R)诱导的大鼠肝细胞损伤的保护作用及其可能机制.方法 将大鼠肝细胞(BRL-3A细胞系)分为正常对照组、PIN实验组、低氧复氧损伤模型组和PIN预处理组.CCK-8检测细胞存活率;Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞计量术检测细胞凋亡;检测细胞培养液中谷丙转氨酶(ALT)活性;ELISA检测TNF-α和IL-1β含量;Western blot检测细胞中TLR4、IκB-α和NF-κB P65蛋白水平;RT-qPCR检测细胞中TLR4、IκB-α和NF-κB P65mRNA表达.结果 在H/R条件下细胞存活率明显降低(P<0.01),细胞凋亡率增高(P<0.001),ALT活性升高(P<0.01),IL-1β和TNF-α含量增多(P<0.01),TLR4和NF-κB P65蛋白与mRNA表达水平显著提高(P<0.01)而IκB-α降低(P<0.05);经PIN预处理后,细胞存活率显著提高(P<0.01),细胞凋亡率显著减小(P<0.001),ALT活性降低(P<0.01),IL-1β和TNF-α含量降低(P<0.01),TLR4和NF-κB P65蛋白与mRNA表达水平明显降低(P<0.01)而IκB-α升高(P<0.05).结论 PIN对H/R诱导的BRL-3A肝细胞的损伤具有保护作用,且该作用可能是通过TLR4/NF-κB信号通路实现的.
关键词： 匹诺塞林 低氧/复氧 肝细胞损伤 Toll样受体4 核转录因子-κBp65 -
人真皮微血管内皮细胞的原代培养及低氧/复氧模型的建立
目的:培养人真皮微血管内皮细胞,建立人真皮微血管内皮细胞低氧/复氧模型.方法:采用酶消化及联合磁珠分选法,得到人真皮微血管内皮细胞(HDMECs),体外培养传至P5代,采用Ⅷ因子免疫荧光及CD309、CD34流式细胞学进行鉴定.用缺氧Buffer加低氧舱的方法低氧处理P5代HD-MECS.实验分为四组,Con组不做任何处理、H8组低氧8小时组,H8R12组低氧8小时复氧12小时组、H8R24组低氧8小时复氧24小时组.TUNEL(脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法)染色法检测细胞凋亡,蛋白质印迹法(Western Blot)检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白的表达.结果:联合法分离的细胞,经过2次CD31磁珠分选后,可见细胞短梭形,呈铺路石样.细胞传至P5,Ⅷ因子免疫荧光染色阳性率为(95±2.61)％.流式细胞仪检测CD309阳性率为(95.4±1.34)％;CD34阳性率为(42.5±3.23)％.TUNEL染色、Western Blot结果显示:H8组的细胞凋亡率和活化的Caspase-3表达高于Con组(P＜0.05),H8R12组、H8R24组细胞凋亡率和活化的Caspase-3表达高于H8组(P＜0.05).结论:本研究采用磁珠分选的办法成功培养了HDMECs,并且建立了HDMECs低氧/复氧模型,为临床研究游离皮瓣缺血再灌注损伤机制提供实验基础.
关键词： 人真皮微血管内皮细胞 低氧/复氧 细胞凋亡 -
藤茶水提液对低氧/复氧损伤小鼠的保护作用
目的 探讨藤茶水提液对小鼠低氧/复氧损伤的保护作用.方法 取40只健康昆明种小鼠,随机分为四组:生理盐水对照组和藤茶水提液处理组1、2、3组,四组分别用生理盐水和藤茶水提液(10、20、30ml/kg)灌胃4周后,再建立小鼠低氧/复氧损伤的模型,检测小鼠血液中活性氧(ROS)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)值. 结果 藤茶水提液可降低小鼠ROS和MDA值,增强SOD活性,对CAT作用不明显. 结论 藤茶水提液对小鼠低氧/复氧损伤有明显的保护作用.
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补充硒蛋氨酸促进低氧/复氧损伤神经元活作用的体外研究
目的 研究低氧/复氧损伤时补充硒蛋氨酸(selenomethionine,SeMet)对神经元存活的影响及可能机制分析.方法 原代培养大鼠脑皮质神经元低氧1h复氧6h,低氧/复氧同时加入SeMet.实验分为正常对照组、单纯低氧/复氧组、低氧/复氧补充SeMet 1、1.5、2 μmol/L组.用CCK-8试剂检测细胞活力, Annexin V-FITC/PI双标记检测细胞凋亡,细胞总谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活力用试剂盒分析,Western-Blotting进一步分析谷胱甘肽过氧化物酶-1(GPx-1)和磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(GPx-4)表达.结果 低氧1h/复氧6h后神经元损伤明显,与对照组相比细胞活力降低至46％,凋亡率达到70.5％.补充SeMet可使神经元细胞活力下降减轻、神经元凋亡减少.GPx活力分析和Western-Blotting结果表明低氧/复氧时补充SeMet可使细胞总GPx活力增加,GPx-1和GPx-4,特别是GPx-4蛋白量明显增加.结论 神经元低氧/复氧损伤时补充SeMet可增加GPx-1和GPx-4的表达进而促进神经元存活.
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恩施硒茶对小鼠低氧/复氧损伤的保护作用研究
微量元素硒与动物体的免疫、生殖、视力和抗癌等机能及包括克山病、大骨节病等在内的40多种疾病的发生有关.我国缺硒地区广泛分布,通过饮食途径增加硒的摄入是目前研究热点之一.有"中国硒都"之称的恩施位于湖北西部地区,盛产绿茶,形成天然结合产物--硒茶.本室曾报道了这种硒茶的降脂作用明显优于普通绿茶[1],本研究进一步观察这种硒茶的抗氧化作用,并探讨其作用机制.
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丹参对心肌低氧/复氧损伤的保护作用的研究
目的:研究中药丹参(SM)对心肌低氧/复氧损伤的保护作用.方法:运用31P-NMR技术对离体灌流大鼠心脏的高能磷酸化合物含量及细胞内的pH值(pHi)进行动态跟踪.结果:丹参注射液能明显减轻低氧期间心肌高能磷酸合物含量的下降,促使复氧期间PCr、ATP相对含量的恢复,减少低氧及复氧阶段心肌pHi的下降.结论:丹参能改善低氧及复氧期间心肌能量代谢水平,减轻心肌低氧/复氧损伤,并能显著改善细胞内酸碱平衡状况.
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低氧预处理对低氧／复氧心肌能量代谢的作用
目的：研究低氧预处理(HPC)对心肌的保护作用。方法：借助 31 P-NMR图谱技术，在模拟Langendorff离体灌流大鼠心脏的正常生理条件下 ，跟踪心肌高能磷酸化合物含量的动态变化。结果：在30 min低氧期，PCr、ATP 相对含量及PCr／Pi值逐渐减小，但HPC组减小的速度比对照组慢；而在复氧期， HPC组能 提高心肌高能磷酸化合物含量的恢复程度，特别在复氧初期， HPC组PCr、 ATP相对含量及P Cr／Pi值立即有了恢复；在本实验中，HPC对pHi的改善不显著。结论： HPC能降 低后续长时间低氧及复氧阶段的心肌能量代谢，对心肌的低氧／复氧损伤具有保护作用。
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线粒体钙单向转运体在心肌低氧/复氧损伤中的作用
目的:观察线粒体钙单向转运体在心肌低氧/复氧损伤中的作用并探讨其机制.方法:应用Langendorff大鼠心脏灌流模型,低氧/复氧(H/R)采用冠脉前降支结扎30 min、复灌120 min的方法.用生物信号采集系统记录左室发展压(LVDP)、左室压大上升/下降速率(±dP/dtmax)、左室舒张末压(LVEDP);分光光度法分别检测冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量和线粒体活性氧(ROS);TTC染色法检测心肌梗死面积.结果:与单纯低氧/复氧组相比,复氧起始给予线粒体钙单向转运体抑制剂钌红(5μmol/L)明显改善左心室各项功能指标,减小心肌梗死面积,降低线粒体ROS和冠脉流出液中LDH含量;而在复氧期起始给予线粒体钙单向转运体激动剂精胺(20μmol/L),显著升高了线粒体ROS活性,冠脉流出液中LDH含量在复氧5 min、20 min、30 min时显著增多,左心室各项功能指标与心肌梗死面积与单纯低氧/复氧组相比无显著差异.ROS清除剂MPG(1 mmol/L)与精胺联合应用则取消了精胺的作用.结论:抑制线粒体钙单向转运体可能通过减少线粒体ROS的生成减轻心脏低氧/复氧损伤.
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绞股蓝总黄酮对低氧/复氧心肌细胞Ca2+及NOS-NO系统的作用
目的:探讨纹股蓝总黄酮对培养心肌细胞低氧/复氧报伤的Ca2+超载、一氧化氮合酶一氧化氮(NOS-NO)系统的影响.方法:培养心肌细胞,建立低氧/复氧损伤模型;荧光分光光度法测定心肌细胞内Ca2+,比色法测心肌细胞培养上清液NO含量、细胞匀浆NOS活性.结果:绞股蓝总黄酮降低低氧/复氧心肌细胞内Ca2+、T-NOS、iNOS活性,升高NO含量.结论:绞股蓝总黄酮可抑制低载/复氧损伤时心肌细胞Ca2+超载及NOS-NO系统的激活.
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富硒板党对小鼠益智和低氧/复氧损伤的保护
目的探讨富硒板党对小鼠益智和低氧/复氧损伤的保护作用.方法益智实验采用苯异丙腺甘(PIA)致小鼠学习记忆障碍等益智模型;抗氧化实验采用小鼠低氧/复氧损伤的模型,检测小鼠血液中活性氧(ROS)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)值.结果富硒板党水煎液可提高小鼠的学习记忆能力,明显延长小鼠游泳时间;降低ROS和MDA值,增强SOD活性,对CAT作用不明显.结论富硒板党对小鼠具有益智和低氧/复氧损伤的保护作用.
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参附注射液对离体大鼠缺氧/复氧心肌的保护作用
目的探讨参附注射液对缺血/再灌注损伤心肌的保护作用及其机制.方法采用Langendorlf大鼠离体心脏灌流技术,制备心肌缺氧/复氧损伤模型,分别在缺氧前及缺氧后,用参附注射液对心肌给予保护,利用高效液相色谱仪(HPLC)测定离体大鼠心肌组织中的高能磷酸化合物的含量变化,利用H--600透射电子显微镜对心肌细胞超微结构进行观察.本实验共分4组:正常对照组,单纯缺氧/复氧组,参附注射液前、后保护组.结果①单纯缺氧/复氧组心肌组织中AMP、ADP、ATP及AN含量均明显低于正常对照组(P＜0.01).②参附注射液前、后保护组大鼠心肌组织内的AMP、ADP、ATP、AN含量均高于单纯缺氧/复氧组(P＜0.01),且接近正常水平(P＞0.05).电镜结果也证明参附注射液对缺氧/复氧心肌细胞超微结构具有明显的保护作用.结论参附注射液无论在缺氧前预灌注时及缺氧后再灌注时给予,均能通过提高心肌组织中高能磷酸化合物的含量,保护心肌细胞超微结构来保护心肌.
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低氧后处理诱导的低氧诱导因子-1α表达上调减轻H9c2心肌细胞低氧/复氧损伤
本文旨在探讨低氧后处理(hypoxic postconditioning)对低氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)所致的心肌细胞损伤以及低氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α,HIF-1 α)表达的影响,并分析二者之间可能的关系.利用H9c2心肌细胞株建立低氧/复氧和低氧后处理模型,通过测定细胞存活率、细胞培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的活性及caspase-3活性来观察低氧/复氧造成的H9c2细胞的损伤,用Westem blot检测H9c2细胞内HIF-1α的蛋白水平,用real-time PCR检测细胞内HIF-1α的mRNA水平.结果显示,低氧后处理提高了低氧/复氧H9c2细胞的存活率,降低了LDH及caspase-3活性.同时,低氧后处理增加了H9c2细胞内HIF-1α的蛋白水平.预先利用HIF-1α脯氨酸羟化酶抑制剂DMOG上调HIF-1α的蛋白水平后,由低氧/复氧导致的H9c2细胞的损伤明显减轻,其效应与低氧后处理完全一致.对H9c2细胞内HIF-1α蛋白水平与细胞存活率进行相关性分析,结果显示二者呈显著正相关(r=0.743,P＜ 0.01)；而运用siRNA方法抑制细胞内HIF-1α基因表达后,显著削弱了低氧后处理减轻低氧/复氧细胞损伤的效应.以上结果提示,HIF-1α表达上调是低氧后处理减轻细胞低氧/复氧损伤的机制之一.
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短暂低氧/复氧对培养新生兔心肌细胞丝裂素活化蛋白激酶活性的影响
心肌细胞短暂低氧可诱导对后续长时间低氧所致细胞严重损伤的耐力增强,已在心脏预处理(PC)模型上得到证实,但PC发生的细胞内信号传导途径目前尚不清楚.我们在培养的新生兔心肌细胞低氧/复氧模型上,观察丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)和核蛋白体S6激酶(S6K)活性改变.结果发现:低氧60min后、复氧15 min,细胞总MAPK和核MAPK活性分别较对照组增加95%和230%(P＜0.01);S6K活性在复氧30 min较对照组增高142%(P＜0.01).应用磷酸酯酶1(PPase1)抑制剂ocadaic acid(OA,1μmol/L),可加强低氧/复氧引起MAPK和S6K激活,而酪氨酸激酶(Tyr K)阻断剂(genistein),蛋白激酶C(PKC)阻断剂(H7)和预先用PKC激动剂(PMA)孵育使细胞PKC下调,都减轻了低氧诱导的MAPK和S6K的激活.蛋白激酶A(PKA)抑制剂(H 89)、钙调素依赖蛋白激酶(PKM)抑制剂(W7)和PPase2a抑制剂(OA,10 nmol/L)却无影响.结果表明,心肌细胞短暂低氧/复氧激活了MAPK和S6K激活过程为PKC,Tyr K和PPasel所参与,似未涉及PKA,PKM和PPase2a.
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CXCR4基因修饰对骨髓间充质干细胞向急性肾损伤微环境定向迁移的放大效应及机制
目的:低氧/复氧预处理肾小管上皮细胞(HR-RTECs)体外模拟急性肾损伤(AKI),与CXCR4基因修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)共培养,观察该共培养环境下CXCR4基因修饰对BMSCs定向迁移力的影响,探讨其可能机制,并以动物模型进一步验证. 方法:Gateway技术构建含CXCR4目的基因的质粒[绿色荧光蛋白(eGFP)为示踪基因)],同时构建仅含eGFP的对照载体,以携带上述质粒的慢病毒为载体转染BMSCs合成CXCR4-BMSCs和null-BMSCs,检测转染细胞活力、分化潜能及CXCR4在转染细胞中的表达.RTECs于HR环境中各培养12h获得HR-RETCs.实验共分四组,将BMSCs、CXCR4-BMSCs、null-BMSCs分别与HR-RTECs共培养,BMSCs与RTECs共培养作为对照.培养48h后检测各组BMSCs的定向迁移能力,ELISA检测RTECs培养上清中基质细胞衍生因子1(SDF-1)浓度,Western印迹检测BMSCs内pAKT、pMAPK水平.构建AKI小鼠模型,随机分为BMSCs移植组、CXCR4-BMSCs移植组和null-BMSCs移植组,移植细胞均采用5溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记,移植7d后处死,免疫组化法检测移植细胞在肾组织的分布. 结果:成功转染的BMSCs活力及分化潜能均无变化,CXCR4表达在CXCR4-BMSCs中明显增加.HR-RTECs模拟的AKI共培养环境可增强BMSCs的迁移能力,空载体转染对BMSCs的迁移能力并无额外影响,但CXCR4修饰的BMSCs向AKI微环境的迁移细胞数进一步显著增加.HR-RTECs培养上清中的SDF-1浓度增加,与其共培养的三种BMSCs内的pAKT、pMAPK水平也均增加,且以CXCR4-BMSCs的pAKT、pMAPK水平强.CXCR4基因修饰可显著增加AKI肾组织中BrdU+细胞(BMSCs)的比例. 结论:AKI微环境对BMSCs有明显趋化作用,CXCR4基因修饰可进一步增强BMSCs的定向迁移能力,SDF-1/CXCR4轴为发挥作用的主要趋化因子/受体,其下游的AKT和MAPK通路为发挥作用的可能信号机制.CXCR4-BMSCs移植有望成为修复AKI的一种新的有效方法.
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吡那地尔对低氧/复氧乳鼠心肌细胞内游离钙浓度的影响
目的:研究低氧/复氧(H/R)对心肌细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的影响以及吡那地尔(Pinacidil)减轻H/R过程中钙超载的作用. 方法:采用新生SD大鼠进行心肌细胞培养,建立心肌细胞H/R模型.实验分:①正常对照组;②H/R组:细胞低氧30 min/复氧30 min;③吡那地尔组:先加入终浓度为25 μmol/L的吡那地尔,再行低氧30 min/复氧 30 min.以Fluo-3/AM荧光指示剂负载, 应用激光共聚焦显微镜技术检测心肌细胞[Ca2+]i变化. 结果:对照组心肌细胞[Ca2+]i荧光强度和荧光光密度值较低.低氧30 min后复氧即刻,[Ca2+]i荧光光密度值开始增加,复氧30 min后[Ca2+]i荧光强度和荧光光密度值显著增高(与对照组相比,P<0.01).而吡那地尔组细胞内荧光光密度值较H/R组显著降低(P<0.01). 结论:心肌细胞H/R导致钙超载;而吡那地尔有明显减轻心肌细胞H/R时Ca2+超载的作用.
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RNA干扰沉默基质交感分子1减轻H9C2细胞低氧/复氧损伤
目的 探讨沉默基质交感分子1(STIM1)对H9C2心肌细胞低氧/复氧损伤的影响.方法 培养H9C2心肌细胞,建立心肌细胞低氧/复氧(H/R)模型,STIM1-siRNA转染H9C2心肌细胞以下调STIM1表达.流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组STIM1及凋亡相关蛋白表达情况.结果 与对照组比较,H-/R组的STIM1表达量明显增加(P＜0.05),Bax/Bcl-2蛋白比率增高,Caspase-3上调,细胞凋亡率增加(P＜0.05).STIM1-siRNA转染能显著下调STIM1基因的表达(P＜0.05),减少细胞内Ca2+浓度,并且Bax/Bcl-2比率降低,Caspase-3表达下调,细胞凋亡率明显下降(P＜0.05).结论 心肌细胞发生缺血再灌注时STIM1表达量明显增加,STIM1-siRNA转染下调STIM1基因的表达可以减轻低氧/复氧引起的心肌细胞凋亡.
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α-硫辛酸对H9 c2心肌细胞低氧及低氧/复氧损伤的保护作用及其机制探讨
目的：探讨α-硫辛酸(α-LA)对H9c2心肌细胞低氧及低氧/复氧损伤的保护作用及其作用机制。方法研究包括H9 c2心肌细胞低氧实验和低氧/复氧实验两部分,分成常氧组、低氧组或低氧/复氧组、LA组、乙醛脱氢酶抑制剂异黄酮苷(Daidzin)组(Daidzin组)、二甲亚砜(DMSO)溶剂对照组( DMSO组)。采用噻唑蓝( MTT)比色法检测心肌细胞存活率；微量酶标法测定乳酸脱氢酶( LDH)活性；ELISA法检测心肌细胞乙醛脱氢酶2(ALDH2)活性；硫代苯巴比妥酸法检测丙二醛( MDA)水平。结果与常氧组比较,低氧组及低氧/复氧组细胞存活率均下降(P<0．01),LDH活性及MDA含量均升高(P<0．01)；与低氧组或低氧/复氧组比较, LA组细胞存活率上升( P <0．01)、ALDH2活性增加( P <0．05)、LDH活性及MDA含量降低(P<0．01)；LA组、Daid-zin组、DMSO组3组比较, LA组与DMSO组间存活率、AL-DH2、LDH、MDA比较差异均无统计学意义( P>0．05)；Daid-zin组与LA组、DMSO组比较,细胞存活率及ALDH2活性降低(P<0．05),LDH活性及MDA含量升高(P<0．05),差异均有统计学意义( P<0．05)。结论α-LA可通过上调AL-DH2活性并减少过氧化终产物形成,终减轻心肌细胞低氧及低氧/复氧过程中的氧化损伤。
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黄精提取物对小鼠低氧/复氧损伤的保护作用
目的 探讨黄精提取物对小鼠低氧/复氧损伤的保护作用.方法 将小鼠用黄精提取物处理后,建立小鼠低氧/复氧损伤的模型,观察小鼠血液中ROS,SOD,MDA等的变化.结果 黄精提取物能降低小鼠ROS和MDA值,增强SOD活性,对CAT作用不明显. 结论黄精提取物对小鼠低氧/复氧脂质过氧化损伤有保护作用.
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凤鸣藤茶抗氧化作用的研究
目的 观察凤鸣藤茶对小鼠低氧/复氧损伤的保护作用;方法 将昆明种小鼠随机分为对照组、藤茶组(2.7g/kg、4.5g/kg、9g/kg 3个剂量组),喂养30 d,低氧/复氧处理后检测各组小鼠活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷光甘肽过氧化物酶(GSH-PX)水平;结果 与对照组比,藤茶组GSH-PX、SOD的活性明显增强(P＜0.01),ROS、MDA的含量降低(P＜0.01);结论 凤鸣藤茶能有效降低小鼠体内脂质过氧化水平,防止体内抗氧化酶受自由基诱导的氧化损伤,显著增强机体抗氧化能力.
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富硒板党地上部分对小鼠益智和低氧/复氧损伤的保护作用研究
目的:探讨富硒板党地上部分对小鼠益智和低氧/复氧损伤的保护作用.方法:益智实验采用苯异丙腺苷(PIA)致小鼠学习记忆障碍等益智模型;抗氧化实验采用小鼠低氧/复氧损伤的模型,观察小鼠血液中ROS、SOD、MDA和CAT的变化.结果:富硒板党地上部分水煎液可提高小鼠的学习记忆能力,明显延长小鼠游泳时间;降低ROS和MDA值,增加SOD活性,对CAT作用不明显.结论:富硒板党地上部分对小鼠具有益智和低氧/复氧损伤的保护作用.
