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系统性红斑狼疮患者外周血miR-7的表达及其意义
目的 研究microRNA-7(miR-7)在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血的表达及其意义.方法 20例SLE患者和20例性别年龄匹配的健康对照者,荧光定量PCR检测PBMC、B细胞、T细胞和单核细胞中miR-7的表达以及靶基因PTEN的mRNA水平,通过电转染方法将miR-7的前体Pre-miRTM-miR-7 Precursor/抑制剂anti-miRTM-miR-7抑制剂转染至SLE患者B细胞中,流式细胞检测B细胞增值功能.应用生物信息学方法及双荧光素酶报告基因系统预测并验证miR-7的靶基因.结果 SLE患者PBMC及B细胞中miR-7的表达显著高于健康对照(P＜0.01).PTEN是miR-7的一个靶基因,转染miR-7的前体至SLE患者B细胞可抑制PTEN表达(P＜0.05),促进B细胞增殖(P＜0.05),转染miR-7抑制体则可以促进PTEN表达(P＜0.05),抑制B细胞增值(P＜0.05).结论 miR-7参与了SLE的发病机制,调控PTEN的表达,并介导了SLE患者B细胞的增殖,是SLE潜在的治疗靶点.
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miRNA-7对食管癌细胞TE-1化疗耐药的影响
目的 探讨微小RNA-7(miRNA-7)过表达对食管癌细胞TE-1顺铂敏感性的影响及其可能机制.方法 用Lipofectmin 2000法向食管癌细胞株TE-1转染组瞬时转染miRNA-7 mimic ,向转染对照组瞬时转染mimic Negative Control,通过RT-PCR检测以上2组及空白对照组的miRNA-7以及表皮生长因子受体(EGFR)mRNA表达情况.Western blot法分别检测转染组与转染对照组总EGFR及细胞浆、细胞核内的EGFR蛋白表达.CCK-8检测转染组与转染对照组TE-1的顺铂半数抑制浓度(IC50).免疫荧光共聚焦显微镜观察转染组与转染对照组EGFR的表达.结果 转染组较转染对照组及空白对照组的miRNA-7表达显著增高,EGFR mRNA表达下降(均P<0.001);转染组较转染对照组总EGFR降低,核内EGFR增高(均P<0.01),胞浆EGFR表达降低(P<0.05);CCK-8结果显示,TE-1中miRNA-7过表达后顺铂(48 h)IC50较转染对照组增高(P<0.01);免疫荧光示转染组较转染对照组核内EGFR增高且胞膜与胞浆EGFR表达减少.结论 食管癌细胞TE-1中miRNA-7过表达可通过EGFR核转位增多使顺铂产生耐药性.
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microRNA-7基因敲减对小鼠CD4＋SP细胞胸腺发育的影响
目的：研究microRNA-7（ miRNA-7，miR-7）基因敲减对小鼠CD4＋SP细胞胸腺发育的影响。方法：检测miR-7基因敲减（miR-7 knock down，miR-7KD）和野生型（Wild-type，WT）小鼠胸腺重量及细胞总数变化；HE染色观察miR-7KD小鼠胸腺的形态学结构改变；FACS检测胸腺CD4＋单阳性（Single positive，SP）细胞的比例并计算细胞总数，同时检测CD4＋SP细胞CD44及CD62L表达变化；核抗原Ki-67染色法检测CD4＋SP细胞的增殖情况；FACS检测CD4＋SP细胞的凋亡变化；Western blot 技术检测胸腺中总ERK1／2和磷酸化ERK1／2表达水平变化。结果：与WT小鼠相比，miR-7KD小鼠胸腺体积、重量以及细胞总数均显著减少，且形态学结构发生改变（ P＜0.05）；FACS结果显示，miR-7KD小鼠胸腺CD4＋SP细胞比例明显降低，且细胞总数减少（ P＜0.05）。此外，CD4＋SP细胞的CD44表达水平显著增加，而CD62 L表达水平明显减少（ P＜0.05）；同时，CD4＋SP细胞增殖及凋亡比例均显著增加（P＜0.01）；后，miR-7KD小鼠胸腺中ERK1／2以及磷酸化ERK1／2的表达均明显下调（ P＜0.05）。结论：miR-7基因敲减后可显著影响CD4＋SP细胞的胸腺发育，这可能与细胞活化水平及ERK1／2信号通路改变有关。
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微小RNA-7的研究进展
微小RNA-7(miR-7)是于2001年由Lagos首次报道的一类非编码小分子RNA.在人和小鼠的基因组序列中均有三种不同的DNA序列可以转录加工为成熟的miR-7分子.近来的研究显示,miR-7在大脑、胰腺等器官发育以及相关临床疾病的发生中发挥了重要作用.本文中,我们分别从组织器官发育和临床疾病两方面对miR-7相关研究进展进行综述.
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miR-7靶向沉默EGFR抑制大鼠星形胶质细胞活化
目的 探讨微小RNA-7(miR-7)对星形胶质细胞活化的影响及分子机制.方法 培养大鼠皮层星形胶质细胞,分别用培养液(对照组)、睫状神经营养因子(CNTF,用于活化星形胶质细胞)、miR-7 mimic+CNTF、miR-7 mimic control+CNTF、miR-7 inhibitor + CNTF 及 miR-7 inhibitor control +CNTF处理,采用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和表皮生长因子受体(EGFR) mRNA表达,通过Western blot检测GFAP、EGFR、信号传导蛋白和转录激活物3(STAT3)、磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白表达.构建野生型 pGL3-EGFR 及突变型 pGL3-EGFR-m重组质粒,分别与miR-7 mimic共转染HEK293T细胞,检测荧光素酶报告基因活性.此外,以EGFR siRNA或STAT3抑制剂 S31-201处理星形胶质细胞,再与 miR-7 inhibitor 和CNTF孵育,然后用qRT-PCR、Western blot检测GFAP mRNA与蛋白表达.结果 CNTF 组 GFAP、EGFR 表达水平及 p-STAT3/STAT3比值较对照组增加(P<0.01),与CNTF组比较,miR-7 mimic + CNTF 组 GFAP、EGFR 表达水平及 p-STAT3/STAT3比值降低,miR-7 inhibitor +CNTF 组 GFAP、EGFR表达水平及 p-STAT3/STAT3比值升高(P <0.01).与对照组比较,miR-7 mimic 转染明显减少野生型EGFR荧光素酶活性(P<0.01).EGFR siRNA或S31-201预处理几乎完全逆转 miR-7 inhibitor 诱导的 GFAP 表达上调(P <0.01).结论 miR-7通过抑制EGFR/ STAT3信号通路拮抗CNTF诱导的大鼠星形胶质细胞活化.
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微小RNA-7在上皮性卵巢癌原发灶及转移灶中表达的研究
目的：检测上皮性卵巢癌组织原发灶、转移灶中miR-7及其靶标EGFR蛋白的表达,探讨miR-7及EGFR与卵巢癌转移的关系。方法：采用显色原位杂交( CISH )检测miR-7在卵巢癌组织原发灶、转移灶石蜡切片中的表达；采用免疫组化检测EGFR蛋白表达。结果：上皮性卵巢癌转移灶中miR-7表达显著低于原发灶( P<0.05),而EGFR表达显著高于原发灶(P<0.05)；miR-7与EGFR表达具有相关性(r=-0.441,P<0.05)。结论：miR-7可能通过EGFR抑制卵巢癌的转移,miR-7可能成为治疗卵巢癌的新靶标。
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微小RNA-7调控EGFR抑制上皮性卵巢癌细胞上皮间质转化的研究
目的:探讨微小RNA-7(miR-7)调控人上皮性卵巢癌(EOC)细胞上皮间质转化,抑制肿瘤侵袭转移的作用及机制.方法:选取EOC细胞株HO-8910pm、ES-2,用lipofectmin 2000体外瞬时转染miR-7质粒,分别通过实时PCR和Western blot检测转染前后细胞株miR-7及EGFR蛋白表达情况；Western blot法检测转染前后细胞株上皮标记β-catenin、间质标记Vimentin及EGFR下游信号通路AKT、ERK蛋白磷酸化水平;实时PCR检测转染前后EMT相关转录因子Snail、Slug、ZEB1、ZEB2的表达.Transwell肿瘤细胞侵袭实验检测转染前后细胞体外侵袭能力.结果:转染miR-7质粒后,HO-8910pm细胞miR-7的表达水平提高了(8.015±0.181)倍,ES-2细胞miR-7表达提高了(28.03±1.253)倍；EGFR蛋白表达均显著下降；转染后细胞的侵袭能力显著下降,HO-8910pm与ES-2的侵袭抑制率分别为62.33％、71.32％；转染后两种细胞的β-catenin蛋白表达均升高,而Vimentin蛋白表达降低；转录因子Snail、Slug的表达较未转染前显著降低(P＜0.05),转染前后ZEB1、ZEB2无显著差异；转染后细胞p-AKT,p-ERK1/2表达均下降.结论:miR-7可通过调控EGFR的表达抑制其下游AKT和ERK1/2信号通路的活化以及逆转EMT,从而抑制EOC细胞的侵袭转移能力.
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微小RNA-7抑制人卵巢癌细胞株增殖及侵袭能力的研究
目的:探讨微小RNA-7(miR-7)对低转移人卵巢癌细胞株HO-8910、高转移人卵巢癌细胞株HO-8910pm增殖及侵袭转移能力的影响.方法:检测两种细胞株的miR-7表达情况,构建miR-7质粒,通过lipofectmin 2000瞬时转染miR-7低表达的细胞株,通过实时PCR检测转染前后细胞株miR-7以及EGFR mRNA表达情况,Western blot法检测EGFR蛋白表达.细胞划痕实验、transwell实验检测细胞体外迁移及侵袭能力；CCK-8检测增殖能力变化.结果:HO-8910细胞miR-7表达为HO-8910pm的(2.517±0.508)倍；转染后HO-8910pm的miR-7表达提高了(8.015±0.1805)倍,同时抑制EGFRmRNA及蛋白表达,抑制侵袭、迁移、增殖能力(P＜0.05)；而miR-7表达相对高的HO-8910体外迁移、侵袭及增殖能力均低于HO-8910pm.结论:miR-7可通过调控EGFR的表达抑制HO-8910、HO-8910pm的增殖及侵袭转移能力,miR-7可能为临床治疗卵巢癌提供新靶标.
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微小RNA-126和微小RNA-7在食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义
目的 探讨微小RNA-126(miR-126)和微小RNA-7(miR-7)在食管鳞状细胞癌(ESCC)中的表达情况及其与ESCC临床病理特征、预后之间的关系.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测116例ESCC组织和癌旁正常组织中miR-126和miR-7的表达差异,并对miR-126和miR-7表达情况与ESCC患者临床病理特征、预后的相关性进行统计学分析.结果 miR-126不同程度低表达病例数为73(62.9％),正常表达病例数为35 (30.2％),高表达病例数为8(6.9％);miR-7不同程度低表达病例数为52(44.8％),正常表达病例数为35(30.2％),高表达病例数为29 (25.0％).miR-126和miR-7表达降低组无瘤生存期均较非降低组短(x2=4.268,P＜0.05;x2 =4.993,P＜0.05);miR-126低表达与ESCC肿瘤位置、家族史和饮酒相关(x2=14.564,P＜0.05;x2=5.691,P＜0.05;x2 =4.971,P＜0.05),与性别、年龄、分化程度、浸润程度、淋巴转移、吸烟不相关(均P ＞0.05);miR-7低表达与ESCC的临床病理特征均不相关(均P＞0.05).结论 miR-126和miR-7的低表达可能与ESCC患者预后相关,具有一定的临床检测意义.
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肝细胞癌患者血清中miR-7、硒蛋白P水平变化及意义
目的 观察肝细胞癌(HCC)患者血清中miR-7、硒蛋白P(SeP)水平变化并探讨其意义.方法 选择首次确诊为HCC的57例患者作为病例组,同时期体检健康者50例作为对照组,采用RT-PCR法检测两组血清中miRG相对表达量,采用ELISA法检测血清SeP水平,分析病例组血清miR-7和SeP水平相关性及其与患者临床病理特征的关系,采用受试者工作特征曲线(ROC)评估血清miR-7和SeP单独及联合检测诊断HCC的价值.结果 病例组、对照组血清miR-7相对表达量分别为0.52±0.16、1.18±0.43,血清SeP水平分别为(2.49±0.71)、(4.54±1.12) mg/L,两组比较差异有统计学意义(P均=0.000).病例组血清miR-7水平与SeP水平呈正相关(r=0.487,P=0.013).血清miR-7表达与HCC患者肿瘤个数、肿瘤直径有关(P均＜0.05),血清SeP水平与HCC患者肿瘤直径有关(P＜0.05);血清miR-7和SeP单独及联合检测诊断HCC的ROC曲线下面积分别为0.830、0.934、0.966,敏感度分别为75.44％、80.70％、89.47％,特异度分别为84.00％、92.00％、96.00％.结论 miR-7和SeP在HCC患者血清中表达降低,二者可作为HCC早期诊断的特异性生物标志物.
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m iR-7对乳腺癌细胞阿霉素耐药性的逆转作用及机制
目的：探讨microR （ miR）-7对乳腺癌细胞阿霉素耐药性的逆转作用及可能的下游分子机制。方法采用ADR诱导体外人乳腺癌MCF-7细胞，建立阿霉素耐药性MCF-7／ADR细胞株；MCF-7或MCF-7／ADR乳腺癌细胞转染miR-7过表达载体（miR-7 mimic）或干扰miR-7载体（miR-7 inhibitor）48 h后，阿霉素（100 ng／mL）处理24 h，MTT法测算细胞存活率；荧光定量PCR法测定miR-7和ABCC10 mRNA表达；蛋白免疫印迹法检测ABCC10蛋白表达。结果 MCF-7／ADR细胞表达低水平的miR-7和高水平的ABCC10。 MCF-7／ADR过表达miR-7，ABCC10 mRNA和蛋白表达受抑制，细胞的阿霉素敏感性增加，细胞活性下降；MCF-7低表达miR-7，ABCC10 mRNA和蛋白表达增加，细胞的阿霉素敏感性降低，而细胞活性增加。结论调控miR-7表达能逆转乳腺癌细胞阿霉素耐药性，其机制可能是miR-7通过调节ABCC10表达实现。
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转染 miR-7类似物的卵巢癌 ES-2细胞迁移、侵袭能力及 EGFR 表达变化
目的：观察转染miR-7类似物的卵巢癌ES-2细胞迁移、侵袭能力及表皮生长因子受体（ EGFR）表达变化。方法将卵巢癌ES-2细胞分为观察组和对照组，观察组转染miR-7类似物，对照组转染无关序列，继续培养24 h，用real-time PCR法检测两组细胞miR-7，用细胞划痕实验检测两组细胞迁移能力，用Transwell细胞侵袭实验检测两组细胞侵袭能力，用Western blotting法检测两组细胞中EGFR蛋白，用real-time PCR法检测两组细胞中EG-FR mRNA。结果观察组、对照组miR-7相对表达量分别为1．57±0．21、0．13±0．02，划痕愈合率分别为35．32％±5．43％、84．21％±4．35％，穿膜细胞数分别为（149±28）、（532±54）个，EGFR蛋白相对表达量分别为1．27±0．31、3．65±0．67，EGFR mRNA相对表达量分别为0．13±0．04、0．57±0．15，两组比较，P均＜0．05。结论转染miR-7类似物的卵巢癌ES-2细胞miR-7表达上调，同时细胞迁移及侵袭能力下降、EGFR蛋白及mRNA表达降低；推测miR-7表达上调导致了细胞迁移及侵袭能力的下降，miR-7的这一作用是通过下调EGFR表达实现的。
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微小RNA-7对人神经母细胞瘤侵袭和转移能力的影响
目的 探讨微小RNA-7(miR-7)对神经母细胞瘤侵袭和转移能力的影响.方法 将化学合成的miR-7在阳离子脂质体Lipofectamine 2000的介导下,瞬时转染人神经母细胞瘤细胞株,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测细胞中miR-7表达水平；黏附实验和Transwell小室实验检测体外癌细胞游走和侵袭能力；裸鼠转移模型检测体内癌细胞转移能力.结果 化学合成miR-7转染神经母细胞瘤后,miR-7表达上调1128.3倍(P＜0.01),细胞黏附能力下降51.3％(P＜0.01),细胞侵袭能力下降52.9％ (P ＜0.01),裸鼠体内转移能力下降.结论 miR-7转染细胞后能抑制瘤细胞的侵袭和转移能力.
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miR-7敲减CD4+T细胞过继转输对小鼠急性肝损伤模型的影响
目的:观察过继转输微小RNA-7(microRNA-7,miR-7)敲减(knockdown,KD)CD4+T细胞对小鼠急性肝损伤模型的影响,并探讨其意义.方法:利用磁珠分选技术分别获得正常野生型(WT)小鼠和miR-7KD小鼠脾脏中CD4+CD62L+T细胞;CFSE染色标记后,按每只小鼠2×106个细胞,经尾部静脉注射给同系WT小鼠,并利用伴刀豆球蛋白A建立急性肝损伤模型;观察过继转输后2组小鼠肝脏的形态、重量及其重量指数的变化;HE染色观察小鼠肝脏组织的病理学变化;real-time PCR检测小鼠肝脏组织中凋亡相关分子Bax和P53的表达;流式细胞术检测小鼠肝脏组织中CFSE标记的CD4+T细胞活化相关膜分子CD62L表达水平以及细胞因子白细胞介素4(IL-4)和干扰素γ(IFN-γ)的表达变化.结果:与对照组相比,过继转输miR-7KD小鼠CD4+CD62L+T细胞组(miR-7KD转输组)小鼠的肝脏重量明显减轻(P<0.01),但重量指数显著增加(P<0.05);HE染色显示miR-7KD转输组的肝脏细胞损伤增加;real-time PCR结果显示miR-7KD转输组肝脏组织中凋亡相关细胞分子Bax和P53的相对表达水平均明显升高(P<0.05);流式细胞术检测结果进一步显示肝脏组织中的CFSE+细胞活化相关分子CD62L的表达水平明显降低(P<0.01),细胞因子IFN-γ的表达水平明显增加(P<0.05),而IL-4的表达水平显著降低(P<0.01).结论:过继转输miR-7敲减CD4+T细胞可显著加重急性肝损伤模型小鼠的肝组织损伤.这为后续深入探讨急性肝损伤的发生机制提供了重要的实验基础.
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miRNA-7介导Bax和Bcl-2表达对人鼻咽癌CNE-1细胞凋亡的影响
目的:研究过表达微小RNA-7(microRNA-7,miRNA-7)诱导人鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)CNE-1细胞凋亡及其与Bax和Bcl-2表达之间的关联情况.方法:体外利用脂质体Lipofectamine 2000将miRNA-7模拟物转染到人鼻咽癌CNE-1细胞中;采用real-time PCR法检测转染后各实验组细胞中miRNA-7的相对表达情况;CCK-8法检测各组细胞活力的改变;在荧光显微镜下利用Hoechst 33258荧光染色法观察转染后细胞的凋亡;real-time PCR法检测Bax和Bcl-2的mRNA表达水平;Western blot法检测Bax和Bcl-2蛋白表达水平.结果:Real-time PCR结果表明,转染miRNA-7模拟物的CNE-1细胞中其miRNA-7的相对表达水平明显高于无关序列组和空白对照组(P＜0.01);转染miRNA-7模拟物后,CNE-1细胞的活力明显下降(P＜0.01);Hoechst 33258染色检测可发现典型的凋亡细胞核形态学变化;real-time PCR及Western blot结果显示,转染miRNA-7模拟物的CNE-1细胞中Bax的mRNA及蛋白显著上调(P＜0.01),而Bcl-2的mRNA及蛋白则显著下调(P＜0.01).结论:过表达miRNA-7可以通过调节Bax/Bcl-2之间的比例关系来抑制鼻咽癌CNE-1细胞的恶性生长,并促进细胞凋亡.
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TTF-1启动子调控microRNA-7真核表达载体的构建
目的 构建甲状腺转录因子(TTF-1)启动子调控miR-7表达的真核表达载体,并观察其表达miR-7对人肺癌细胞体外生长的影响.方法 抽提人肺癌95D细胞基因组DNA,PCR分别扩增TTF-1启动子序列(promoter)和miR-7前体序列,纯化产物分别经Kpn Ⅰ/Mul Ⅰ双酶切和Mul Ⅰ/HindⅢ双酶切,克隆入PGL3-basic-载体,构建pGL3-basic-TTF-1-promoter-miR-7真核表达载体(命名为p-T-miR-7);将p-T-miR-7真核载体体外瞬时转染人肺癌95D细胞,Real-time PCR探针法检测细胞中miR-7的表达水平;CCK-8实验和克隆形成实验检测细胞增殖情况;划痕实验检测转染后细胞的体外迁移情况.结果 经酶切和测序鉴定成功构建TTF-1启动子调控的miR-7真核表达载体p-T-miR-7;转染后72 h,与对照相比,p-T-miR-7转染组中miR-7的表达水平增加约2.5倍(P＜0.05);CCK-8实验和克隆形成实验显示,p-T-miR-7转染组中95D细胞的增殖能力明显下降(P＜0.05);划痕实验进一步显示,细胞的体外迁移能力也显著削弱(P＜0.05).结论 成功构建TTF-1启动子调控的miR-7真核表达载体,这为后续肺癌基因治疗策略开发提供重要前期实验基础.
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pG-miR-7-Sponge转基因小鼠载体的构建及鉴定
目的 构建pG-miR-7-Sponge转基因小鼠的真核载体并检测其表达活性,为转基因小鼠的建立提供前期实验基础.方法 利用miRNA sponge(海绵体)技术原理,合成miR-7-Sponge序列,酶切连接入真核表达载体eGFP-C2并转化Stbl3感受态细胞,克隆PCR、酶切和测序鉴定重组载体eGFP-C2-miR-7-Sponge(简称pG-miR-7-Sp);将重组载体pG-miR-7-Sp体外瞬时转染人肺癌95D细胞,荧光显微镜下观察细胞的GFP表达情况;Real-Time PCR检测细胞中miRNA-7的表达;MTT法检测细胞的增殖变化.结果 经克隆PCR、酶切鉴定及测序分析,成功构建了真核表达载体pG-miR-7-Sp;pG-miR-7-Sp瞬时转染95D细胞48 h后,与对照组细胞相比,miR-7表达水平明显降低(P＜0.05);同时细胞的生长明显加快(P＜0.05).结论 成功构建pG-miR-7-Sp真核表达载体.
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基于SYBR Green Ⅰ的茎-环Real-time PCR定量检测miRNA-7方法的建立
目的 本研究旨在利用常规荧光燃料SYBR Green Ⅰ,通过茎-环法设计原理,建立有效检测微小RNA-7(miR-7)的Real-time PCR方法.方法 利用miRBase数据库获得miR-7的成熟体序列,分别设计1条miR-7特异性反转录引物,以及Real-time PCR上游和下游引物;观察不同退火温度和不同引物浓度对扩增miR-7的Ct值影响,选择优的退火温度和引物浓度;测定不同稀释度RNA下Real-time PCR扩增miR-7的效果;并利用该方法检测小鼠4个器官中miR-7的灵敏性和特异性.结果 在基于SYBR Green Ⅰ的茎-环Real-time PCR检测法中,miR-7扩增的优退火温度为60℃,优引物浓度为10 μmol/L;在不同稀释度RNA下miR-7的Ct值线性关系较好,且在模板RNA低于100 pg的条件下,该方法仍可有效检测miR-7分子;后有效检测出小鼠4个不同器官中miR-7的差异性表达.结论 成功建立基于SYBR Green Ⅰ的茎-环Real-time PCR定量检测miRNA-7的方法,可为后续研究miR-7的生物学功能提供了重要工作基础.
