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ERK通路在塞来昔布延缓乙酸性大鼠胃溃疡愈合中的作用
目的 明确选择性环氧合酶-2(COK-2)抑制剂塞来昔布对乙酸性大鼠胃溃疡愈合的影响,并从ERK通路的角度探讨其延缓胃溃疡愈合的机制. 方法 将48只Wistar大鼠分为模型组(40只)和假手术对照组(8只).模型组进行乙酸性胃溃疡制模术,假于术对照组行假手术.术后第3天,处死模型组和假手术对照组各8只大鼠.模型组剩余的32只大鼠再随机分为塞来昔布组和生理盐水组.塞来昔布组从制模术后第3天开始胃内灌注0.2%塞来昔布溶液1 ml,生理盐水组灌注等量生理盐水.制模术后第6天和第9天,每次处死塞来昔布组和生理盐水组各8只大鼠,观察塞来旨布对胃溃疡愈合的影响,Western blotting检测其对胃黏膜Raf-1、ERK1/2活性及下游转录因子c-Fos、c-Jun蛋白水平的影响. 结果 制模术后第9天,生理盐水组和塞来营布组的溃疡面积分别为11.9±3.1 mm2和19.7±3.8mm2,与第3天(33.3±7.4mm2)相比均明显缩小(P＜0.01),其中塞来昔布组溃疡而积约为生理盐水组的1.7倍.制模术后第6天和第9天,塞来昔布组Raf-1和ERK1/2活性及c-Fos蛋白水平均显著低于生理盐水组(P＜0.01),而两组在上述两个时间点上c-Jun蛋白水平均无显著性差异. 结论 塞来昔布可能是通过抑制ERK通路的活化而发挥延缓胃溃疡组织增生修复的作用.
关键词： 前列腺素内过氧化物合酶类 胃溃疡 细胞外信号调节MAP激酶类 -
蛋白酶激活受体-2对缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡的影响
目的 探讨蛋白酶激活受体-2(PAR-2)活化对缺血再灌注(1/R)大鼠心肌细胞凋亡的影响及细胞外信号调节激酶(ERK)1/2在此过程中的作用.方法 40只雄性SD大鼠随机均分为5组(n=8):假手术组,I/R组,PD组(0.3mg/kg ERK1/2通路制剂PD98059),PAR-2AP组(3mg/kg PAR-2激活肽SLIGRL-NH2),PD+PAR-2AP组.建立大鼠在体心肌I/R模型.采用末端标记法(TUNEL)检测心肌细胞凋亡,免疫组织化学法检测各组凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达,Western blotting检测各组大鼠心肌组织中磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的表达水平.结果 与假手术组相比,1/R组、PD组、PAR-2AP组、PD+PAR-2AP组的凋亡指数,Bcl-2、Bax蛋白表达及p-ERK1/2水平均明显增高(P＜0.01).与I/R组比较,PAR-2AP可使凋亡指数和Box蛋白表达降低,而使Bcl-2的表达和p-ERK1/2水平增加;与PAR-2AP组比较,PD+PAR-2AP组凋亡指数和Bax蛋白表达增加,Bcl-2的表达和p-ERK1/2水平降低.PAR-2AP抑制凋亡的效应可被PED8059部分阻断.结论 PAR-2活化后可增加Bcl-2蛋白的表达,降低Bax的表达,从而部分抑制大鼠I/R心肌细胞的凋亡,发挥心肌保护效应,其机制可能涉及ERK路径.
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应力刺激下ERK1/2信号通路对成牙骨质细胞OPG/RANKL表达的影响
目的 探讨在机械张应力刺激下细胞外信号调节激酶(ERK1/2)对成牙骨质细胞骨保护素(OPG)和破骨细胞分化因子(RANKL)表达的影响.方法 利用Flexcell FX4000T张应力加载系统和ERK1/2特异性抑制剂PD98059,以体外培养的成牙骨质细胞样细胞OCCM30为研究对象,将细胞随机分为4组:A组(不加力不加抑制剂组);B组(不加力加抑制剂组);C组(加力不加抑制剂组);D组(加力加抑制剂组).采用Western blotting检测张应力加载5、15、30、60min4个时间点的ERK1/2磷酸化水平,荧光定量PCR检测张应力加载12h时的OPG和RANKL mRNA表达水平.结果 机械张应力可迅速激活C组成牙骨质细胞内的ERK1/2信号通路,且在5、15、30min时P-ERK1/2水平明显高于A组,差异有统计学意义(P＜0.05),至60min时恢复至与A组相近的水平;在抑制剂作用下,B、D组P-ERK1/2水平显著降低.张应力作用下细胞OPG mRNA表达减弱,RANKL mRNA表达增强,RANKL/OPG比值增大,而在抑制剂与机械张应力双重作用下,细胞OPG mRNA表达增强,RANKL mRNA表达减弱,RANKL/OPG比值减小,但仍高于抑制剂作用组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 ERK1/2信号通路参与张应力对成牙骨质细胞OPG、RANKL表达的调控,但不是唯一激活通路,可能有其他信号通路共同参与对OPG、RANKL基因表达的调控.
关键词： 牙骨质 应力 物理 细胞外信号调节MAP激酶类 骨保护素 -
咖啡酸苯乙酯靶向调控人结肠癌HT-29细胞FAK-ERK信号通路的研究
目的 探讨咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CAPE)对结肠癌HT-29细胞FAK-ERK信号转导通路中相关蛋白表达的作用,寻找其作用靶点,试图阐明CAPE抗肿瘤作用的分子机制.方法 用不同浓度CAPE处理HT-29细胞,利用Hoechst33258染色法和流式细胞术,检测细胞凋亡的发生.应用Western印迹法分析不同浓度CAPE对HT-29细胞中黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)和细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)蛋白表达的影响.结果 Hoechst33258染色发现CAPE作用后凋亡细胞数量增加.流式细胞仪细胞凋亡率分析显示,0,2.5,5.0,7.5和10 μg/ml处理HT-29 细胞24 h后,细胞凋亡率上升,呈剂量依赖性.Western印迹结果显示,在0～10 μg/ml范围内不同浓度CAPE作用于HT-29细胞24 h后,FAK、ERK蛋白表达随CAPE浓度的增加而下调.结论 CAPE可诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡,其作用机制可能与CAPE抑制FAK-ERK信号转导通路的激活有关.
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δ阿片受体激活对过氧化氢损伤的心肌细胞的保护作用
目的 研究δ阿片受体激活剂D-丙(2)-D-亮-(5)-脑啡肽(DADLE)对过氧化氢(H_2O_2)损伤的心肌细胞的保护作用及其机制.方法 分离乳大鼠心肌细胞,培养48 h后分为正常对照、H_2O_2(200 μmol·L~(-1))、H_2O_2+DADLE(1 μmol·L~(-1))、H_2O_2+DADLE+纳曲吲哚(10 μmol·L~(-1))和H_2O_2+DADLE+U0126(10 nmol·L~(-1))组,继续培养48 h.用[~3H]TdR掺入法检测心肌细胞增殖反应,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡百分率,乳酸脱氢酶(LDH)活性测定试剂盒测定培养上清LDH活性,硫代巴比妥酸显色法测定细胞内丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化酶法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性,Western蛋白印迹法检测细胞外信号调节激酶磷酸化(p-ERK)水平.结果 ①与正常对照组比较,H_2O_2组心肌细胞[3H]TdR掺入值明显降低, 细胞凋亡率升高;培养上清LDH活性和MDA含量明显增加,SOD活性和A_(p-ERK)/A_(ERK)的比值降低.②与H_2O_2组比较,DADLE可使心肌细胞[~3H]TdR掺入值升高, 细胞凋亡率下降;培养上清LDH活性和MDA含量降低,SOD活性和A_(p-ERK)/A_(ERK)的比值升高.③分别加入δ阿片受体拮抗剂纳曲吲哚和ERK拮抗剂U0126,DADLE对上述指标的逆转作用被抑制.结论 δ阿片受体激活对H_2O_2损伤的心肌细胞具有保护作用,其机制可能与其增强心肌细胞的抗氧化功能及促进ERK磷酸化有关.
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雌激素通过非基因效应激活钙离子流调控子宫内膜癌细胞外信号调节激酶通路
目的：：研究子宫内膜癌Ishikawa细胞中,雌激素通过钙离子通道及雌激素受体引发钙离子流继而影响细胞外信号调节激酶( extracellular signal-regulated kinases, ERK)活化通路的机制。方法：激光共聚焦实验检测雌激素作用下及加入雌激素受体的抑制剂 ICI182780和钙通道阻滞剂 nifedipine 后胞浆内游离钙离子浓度的变化, Western-blotting方法检测同样条件下ERK通路的激活。结果：17β-雌二醇(17β-estrodiol, E2)和偶联牛血清白蛋白( bovine serum albumin, BSA)的17β-雌二醇( E2-BSA)在作用1 min后均可以引发瞬时的钙离子流,钙离子的浓度增高可以被雌激素受体的抑制剂ICI182780和钙通道阻滞剂nifedipine抑制。在Ishikawa细胞, E2可以快速激活ERK通路,加入雌激素受体抑制剂ICI182780后,E2作用5 min和30 min,ERK通路未被阻抑。加入钙离子通道阻滞剂nifedipine后,5 min时雌激素对ERK通路的激活未被阻抑,但30 min时nifedipine阻抑了ERK通路的激活。E2-BSA对ERK通路的活化也在作用30 min后被nifedipine阻抑。结论：雌激素可以通过钙离子通道快速激发钙离子流,进而影响ERK通路的活化。
关键词： 子宫内膜肿瘤 钙 细胞外信号调节MAP激酶类 雌激素类 -
大鼠全肝缺血再灌注后肺损伤及褪黑素的保护作用
目的:探讨大鼠全肝缺血再灌注后肺损伤及其机制和褪黑素的肺保护作用.方法:本实验将分成两部分完成.第一部分,72只SD大鼠随机分成2组:缺血再灌注组(n=36)与假手术对照组(n=36),阻断肝门30min后开放血流,建立大鼠全肝缺血再灌注模型.缺血再灌注组与假手术对照组分别于缺血前5 min和再灌注0、0.5、1、3、6h各时点处死动物(每时点6只),留取肺脏组织标本.通过两组间比较,观察全肝缺血再灌注后肺组织的动态变化.第二部分,将12只SD大鼠随机分成2组:褪黑素治疗组(n=6)与基质对照组(n=6),依上述方法制备全肝缺血再灌注模型,分别于全肝缺血前15 min和再灌注前10min静脉注射0.5%(质量分数)褪黑素溶液(10mg/kg)或相同剂量的溶剂,于再灌注1 h处死动物,留取肺脏组织标本.通过这两组比较,观察褪黑素的治疗效果.留取肺组织标本后,分别检测丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性,细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases 1/2, ERK1/2)和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表达,细胞凋亡,增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表达及肺组织病理学变化.结果:(1)全肝缺血再灌注可导致肺组织结构严重受损.与假手术对照组相比,缺血再灌注组再灌注后肺组织MDA含量与细胞凋亡指数显著增高;SOD活性显著降低;p-ERK/ERK比值与PCNA阳性指数分别于再灌注0h与再灌注0.5h显著降低,此后均逐渐增高.病理学方面,缺血再灌注组肺泡腔完整性破坏,间隔增厚,并可见中性粒细胞浸润.双变量相关分析结果显示,肺组织p-ERK/ERK比值与PCNA阳性指数及凋亡指数均成正相关,分别为r=0.56(P<0.05)、r=0.62(P<0.05).(2)褪黑素治疗可明显减轻肺损伤.褪黑素治疗组与基质对照组比较,病理学改变减轻,MDA含量、细胞凋亡指数显著降低,SOD活性和p-ERK/ERK比值显著增加,但PCNA阳性指数无明显变化.结论:全肝缺血再灌注可引起肺损伤.脂质过氧化增强、内源性自由基清除能力减弱以及细胞凋亡加剧是导致全肝缺血再灌注肺损伤的重要因素.褪黑素可通过抗氧化与抑制凋亡对全肝缺血再灌注肺损伤产生一定保护作用,但褪黑素的肺保护作用与激活ERK1/2信号途径的关系仍有待研究.
关键词： 褪黑激素 再灌注损伤 细胞外信号调节MAP激酶类 细胞凋亡 -
感染和应激对肥大细胞缺陷大鼠脊髓瞬时感受器电位香草酸受体1和胞外信号调节蛋白激酶的影响
目的:研究感染和应激所致的内脏高敏感性大鼠中肥大细胞的作用以及与信号通路瞬时感受器电位香草酸受体1(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)和胞外信号调节蛋白激酶(extracellular-regulated kinase,ERK)的关系.方法:以肥大细胞缺陷大鼠(WsRC Ws/Ws,Ws/Ws)和野生对照大鼠(WsRC+/+,+/+)为基础构建一过性旋毛虫感染( post-infection,PI)和急性冷束缚应激(acute cold restraint stress,ACRS)内脏高敏感模型,腹部回撤反射评分评估大鼠内脏敏感性.通过Western blotting方法检测大鼠第6腰椎和第1骶椎(lumbar 6 sacral 1,L6S1)段脊髓TRPV1和磷酸化的ERK1/2 (pERK1/2)蛋白的表达水平.结果:与对照组(3.7±0.09)相比,PI(2.52±0.13)、ACRS(2.28 ±0.17)和PI+ ACRS(2.25±0.12)组+/+大鼠内脏敏感性均增高,P＜ 0.05,差异有统计学意义.在Ws/Ws大鼠中,与对照组(3.25±0.20)相比,PI(2.87±0.14)和PI+ ACRS( 2.50±0.27)组内脏敏感性增高,P＜ 0.05,差异有统计学意义,但是,ACRS组(2.97±0.22)内脏敏感性与对照组相比差异无统计学意义.Western blotting结果提示,与对照组(0.090±0.009)相比,PI(0.121±0.012)、ACRS(0.122±0.008)和PI+ACRS(0.129±0.008)组+/+大鼠脊髓TRPV1蛋白水平均明显增加,P＜ 0.05,差异有统计学意义；但是,在Ws/Ws大鼠中,与对照组相比(0.106±0.012),ACRS(0.132±0.014)组脊髓TRPV1差异无统计学意义,而PI(0.140±0.008,P＜ 0.05)以及PI+ ACRS(0.156±0.010,P＜ 0.01)组脊髓TRPV1蛋白水平表达显著增加,差异有统计学意义.同样,在+/+大鼠中,与对照组(0.58±0.03)相比,PI(0.72±0.04)、ACRS(0.75±0.04)以及PI+ ACRS(0.78±0.01)组脊髓pERK1/2蛋白水平明显增加,P＜ 0.01,差异有统计学意义；但是,在Ws/Ws大鼠中,与对照组相比(0.59±0.04),ACRS组(0.69 ±0.04)脊髓pERK1/2差异无统计学意义,而PI(0.72±0.04)以及PI+ ACRS(0.74 +0.04)均可导致脊髓pERK1/2蛋白水平表达显著增强,P＜ 0.05,差异有统计学意义.结论:一过性旋毛虫感染和ACRS均可引起大鼠内脏高敏感,但是ACRS引起的内脏高敏感具有肥大细胞依赖性.旋毛虫感染和ACRS均可以引起脊髓通路TRPV1和pERK1/2蛋白水平表达增加,ACRS引起的TRPV1和pERK1/2表达上调也具有肥大细胞依赖性.
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糖皮质激素受体通过细胞外信号调节激酶途径参与吗啡耐受机制
目的 探讨糖皮质激素受体参与吗啡耐受形成的机制及细胞外信号调节激酶(ERK)信号途径在其中的作用.方法 将40只健康雄性SD大鼠行鞘内置管后随机分为4组(n=10),盐水对照组(C组)鞘内注射生理盐水lOμl;慢性吗啡耐受组(M组)鞘内注射吗啡10μg;糖皮质激素受体拮抗剂组(MR组)鞘内注射吗啡10μg,再注射糖皮质激素受体拮抗剂RU38486 2μg;糖皮质激素受体激动剂组(MD组)鞘内注射吗啡10μg,再注射糖皮质激素受体激动剂地塞米松4μg,鞘内注射每种药物均为2次/d,连续7 d.采用甩尾实验评价大鼠热痛觉,于给药后第8天取出腰膨大处脊髓分别进行Western印迹检测μ阿片受体(MOR)、糖皮质激素受体(GR)、磷酸化ERK(pERK)蛋白表达及TUNEL染色.结果 地塞米松和RU38486分别对吗啡耐受诱导的热痛敏具有促进和抑制作用.与M组(凋亡细胞数5.4±1.1,蛋白表达MOR 37±5,GR 20±6,pERK1 39±4,pERK2 41±5)比较,MR组凋亡细胞数(3.2±0.4)显著少(P<0.01);MD组(16.0±1.6)显著多(P<0.01);MR组MOR(28±5)、GR(12±6)、pERK1(33±4)、pERK2(34±5)蛋白表达均下调(均P<0.01);MD组MOR(55±6)、GR(28±9)、pERKl(49±6)、pERK2(59±5)蛋白表达均上调(均P<0.01).结论 糖皮质激素受体的活性可影响吗啡诱导的脊髓神经凋亡及吗啡耐受中脊髓pERK的表达.
关键词： 吗啡 受体 糖皮质激素 细胞外信号调节MAP激酶类 凋亡 -
二甲双胍对卵巢颗粒细胞IRS-1及ERK-2基因表达的影响
目的:探讨二甲双胍对多囊卵巢综合征(PCOS)卵巢颗粒细胞胰岛素受体底物-1(IRS-1)及细胞外信号调节激酶-2(ERK-2)的基因表达的影响.方法:收集行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗的PCOS患者卵泡颗粒细胞进行体外培养,用二甲双胍处理48 h,采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)测定颗粒细胞IRS-1及ERK-2基因的相对表达量,另收集行IVF-ET非PCOS患者颗粒细胞作为对照组.结果:PCOS患者颗粒细胞IR S-1基因、ERK-2基因相对表达量与对照组相比明显升高(P＜0.05),二甲双胍处理后PCOS患者颗粒细胞IRS-1基因相对表达量升高、而ERK-2基因表达量下降(P＜0.05).结论:PCOS患者颗粒细胞RS-1与ERK-2基因受二甲双胍作用时表达不同步,二甲双胍可能通过降低PCOS患者颗粒细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导通路活性,减轻MAPK信号通路对磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)通路的负反馈作用,改善PCOS患者卵巢胰岛素抵抗状态.
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p38MAPK与ERK1/2的协同效应及对成骨细胞分化的调控
目的探讨骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化过程中p38MAPK与ERK1/2的协同效应及其机制。方法 以成骨细胞分化添加剂诱导小鼠BMSCs向成骨细胞分化，测定碱性磷酸酶活性和钙沉积量。检测磷酸化p38MAPK和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的表达水平评估通路的激活状况。以SB203580或PD98059阻断p38MAPK或ERK1/2通路，观察对成骨细胞分化的影响。以SB203580或亚砷酸钠阻断或激活p38MAPK通路，观察p-ERK1/2的变化。以冈田酸抑制蛋白磷酸酯酶2A(protein phosphatases type 2A，PP2A)活性，观察p-ERK1/2的变化及对成骨细胞分化的影响。通过免疫共沉淀实验观察PP2A和ERK1/2间的结合及SB203580对结合的影响。结果成骨细胞分化添加剂诱导BMSCs向成骨细胞分化的过程伴有ERK1/2和p38MAPK通路的激活，SB203580剂量依赖性抑制成骨细胞分化，PD98059剂量依赖性增强成骨细胞分化。SB203580使p-ERK1/2表达增加，亚砷酸钠减弱其表达。冈田酸使p-ERK1/2表达增加，并使成骨细胞分化受到抑制。PP2A可直接与ERK1/2结合，SB203580使PP2A与ERK1/2的结合减弱。结论 p38MAPK可通过PP2A与ERKi/2产生协同效应，并调节BMSCs向成骨细胞分化。
关键词： 细胞外信号调节MAP激酶类 成骨细胞 细胞分化 磷蛋白磷酸酶 -
幽门螺杆菌感染对胃黏膜解痉多肽和ERK表达的影响
目的:探讨幽门螺杆菌(Hp)在Hp相关性胃炎的发病机制中对胃黏膜上皮细胞解痉多肽(SP)以及细胞外信息相关蛋白激酶(ERK)表达的影响.方法:检测68例浅表性胃炎患者的活检组织标本.(1)采用免疫组织化学和染色评分的半定量法对Hp阳性组与阴性组、Hp根除前和根除后慢性浅表性胃炎患者的胃黏膜上皮细胞的SP和ERK的表达量进行检测比较.(2)采用质子泵抑制剂+克拉霉素+甲硝唑三联疗法根治Hp感染.结果:(1)Hp阳性组SP和ERK的表达量较阴性组明显减少(P＜0.05).(2)Hp根除后SP和ERK的表达量较根除前明显增加(P＜0.05).结论:SP和ERK表达量的异常在Hp致胃黏膜损害的发病机制中起重要作用.
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双特异性磷酸酶2对胃癌细胞增殖凋亡的影响及机制研究
目的 探讨双特异性磷酸酶2(DUSP2)基因对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其可能的机制.方法 首先利用在线分析工具KM plotter分析876例胃癌患者DUSP2表达高低对其总体生存率的影响,并在多种胃癌细胞株(MKN-45、SGC-7901、HGC-27、N-87)中检测DUSP2的表达.进一步构建DUSP2过表达慢病毒载体,包装病毒感染MKN-45细胞,筛选出DUSP2稳定过表达的胃癌细胞株,以空载慢病毒转染并筛选后的胃癌细胞为对照.采用MTS细胞增殖实验检测DUSP2上调表达对胃癌细胞增殖能力的影响;Annexin V-FITC/PI双染流式检测细胞凋亡变化;蛋白质印迹法(Western blot)检测DUSP2、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、p-ERK(Thr202/Tyr204)、P38、p-P38等蛋白表达水平.结果 高表达DUSP2的胃癌患者较低表达者有明显的生存优势,并且DUSP2在多株胃癌细胞中呈低表达.Western blot结果显示DUSP2稳定过表达的胃癌细胞(实验组)中DUSP2表达较对照组明显上调,DUSP2稳定过表达的胃癌细胞株构建成功.MTS实验结果表明,实验组细胞活力较对照组明显下降.实验组细胞凋亡率明显高于对照组.Western blot结果表明,实验组细胞中p-ERK(Thr202/Tyr204)及p-P38表达较对照组显著下调.结论 上调DUSP2的表达可显著抑制胃癌细胞的增殖,并促进其凋亡,其机制与DUSP2抑制了ERK、P38的磷酸化水平有关.
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β-抑制蛋白-1在盐酸戊乙奎醚抑制LPS致人肺微血管内皮细胞MAPK信号通路激活中的作用
目的 探讨β-抑制蛋白-1在盐酸戊乙奎醚抑制LPS致人肺微血管内皮细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路激活中的作用.方法 将人肺微血管内皮细胞以1×105个/ml的密度接种于6孔板(2 ml/孔)或培养瓶(4 ml/瓶)中,采用随机数字表法,将其分为5组(n=20):空质粒转染组(C组)、LPS+空质粒转染组(LPS组)、盐酸戊乙奎醚+LPS+空质粒转染组(P+LPS组)、LPS+β-抑制蛋白-1短发夹RNA(shRNA)转染组(LPS+shRNA组)和盐酸戊乙奎醚+LPS+β-抑制蛋白-1 shR-NA转染组(P+LPS+shRNA组).以空质粒1.5 μg或含15 nmol/L β-抑制蛋白-1 shRNA的质粒转染细胞后,孵育24 h时,LPS组和LPS+ shRNA组加入终浓度为0.1 μg/ml的LPS孵育1 h;P+LPS组和P+LPS+shRNA组于加入终浓度为2μg/ml的盐酸戊乙奎醚,孵育1h时加入终浓度为0.1 μg/ml的LPS孵育1h.采用流式细胞仪检测纤维状肌动蛋白(F-actin)表达水平,采用免疫荧光化学法检测肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)的表达水平,采用Western blot法检测磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK1/2)和磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)的表达水平.采用RT-PCR法检测β-抑制蛋白-1 mRNA表达水平.结果 与C组比较,LPS组细胞F-actin、VE-cadherin和β-抑制蛋白-1 mRNA的表达下调,MLCK、p-ERK1/2和p-JNK的表达上调,P+LPS组细胞p-ERK1/2和p-JNK表达上调(P＜0.05),其余指标表达差异无统计学意义(P＞0.05);与LPS组比较,P+LPS组细胞F-actin、VE-cadherin和β-抑制蛋白-1 mRNA的表达上调,MLCK、p-ERK1/2和p-JNK的表达下调,LPS+shRNA组细胞F-actin、VE-cadherin和β-抑制蛋白-1 mRNA的表达下调,MLCK和p-JNK的表达上调(P＜0.05);与P+LPS组比较,P+LPS+shRNA组细胞F-actin、VE-cadherin和β-抑制蛋白-1mRNA的表达下调,MLCK、p-ERK1/2和p-JNK的表达上调(P＜0.05).结论 盐酸戊乙奎醚抑制LPS致人肺微血管内皮细胞MAPK信号通路激活的机制部分与β-抑制蛋白-1表达上调有关.
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亚低温对前脑缺血再灌注损伤沙土鼠海马p-ERK、p-JNK水平的影响
目的 研究亚低温对前脑缺血再灌注损伤沙土鼠海马磷酸化胞外信号调节激酶(p-ERK)及磷酸化c-Jun氨基末端蛋白激酶(p-JNK)水平的影响.方法 蒙古沙土鼠120只,随机分为4组(n=30):常温假手术组(SH组)、常温缺血再灌注组(IR组)、低温假手术组(HSH组)、常温缺血低温再灌注组(HIR组).腹腔注射1%戊巴比妥钠40mg/kg麻醉后,分离出双侧颈总动脉,IR组、HIR组分别夹闭双侧颈总动脉,5 min后恢复脑血流灌注,IR组再灌注时维持正常体温(36.5～37.5℃),HIR组再灌注即刻开始降温,10 min内降至32.5～33.5℃,并维持4 h;SH组、HSH组只分离双侧颈总动脉不夹闭,SH组维持正常体温,HSH组分离双侧颈总动脉后5 min开始降温,10 min内降至32.5～33.5℃,并维持4 h.每组于再灌注2 h、4 h、1 d、3 d、5 d分别随机取6只动物,采用开阔法观察沙土鼠的行为学,行为学观察完毕立即处死大鼠,取脑组织,采用TUNEL法检测海马CA1区、CA3区细胞凋亡情况,免疫组化法测定海马CA1区、CA3区、DG区p-ERK、P-JNK的水平.结果 HIR组再灌注1～5d沙土鼠行为学异常及海马凋亡细胞计数较IR组降低(P＜0.01);与SH组或HSH组比较,IR组及HIR组再灌注期间海马CA3区及DG区p-ERK水平增加(P＜0.05),但IR组与HIR组比较差异无统计学意义;4组海马CA1区均无p-ERK表达.与SH组比较,IR组再灌注2 h～5 d海马CA1区、CA3区p-JNK水平增加,且HIR组再灌注2 h～1 d海马CA1区、CA3区p-JNK水平低于IR组(P＜0.05).结论 亚低温(32.5～33.5℃)4 h可减轻沙土鼠脑缺血再灌注损伤,其机制与抑制再灌注早期p-JNK的激活有关,而与p-ERK水平无关.
关键词： 低温 人工 脑 再灌注损伤 海马 JNK丝裂原活化蛋白激酶类 细胞外信号调节MAP激酶类 -
七氟醚后处理对大鼠离体心脏缺血再灌注时心肌细胞胀亡和凋亡的影响:与ERK1/2信号转导通路的关系
目的 评价七氟醚后处理对大鼠缺血再灌注心肌细胞胀亡和凋亡的影响及细胞外信号调节激酶(ERK) 1/2信号转导通路在其中的作用.方法 取Langendorff离体灌注模型成功的大鼠心脏72个,采用随机数字表法分为6组(n=12):假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、七氟醚后处理组(SP组)、ERK1/2抑制剂PD98059组(PD组)、PD98059溶剂二甲基亚砜组(DMSO组)和七氟醚后处理+ PD98059组(SP+ PD组).除S组,其余各组心脏缺血30 min,再灌注2h.SP组、DMSO组和PD组分别于缺血末至再灌注15 min灌注经3.0％七氟醚、DMSO(＜ 0.2％)和PD98059(20 μmol/L)饱和的K-H液,随后更换为正常K-H液再灌注105 min.SP+ PD组于缺血末至再灌注15 min灌注经3.0％七氟醚和PD98059(20 μmol/L)饱和的K-H液.再灌注末测定心肌梗死体积,采用Western blot法检测porimin和caspase-8蛋白表达水平.结果 与S组比较,其余各组心肌梗死体积增加,porimin和caspase-8表达上调(P＜0.05)；与I/R组比较,SP组梗死体积减少,porimin和caspase-8表达下调(P＜0.05),其余各组各指标差异无统计学意义(P＞0.05).结论 七氟醚后处理可激活ERK1/2信号转导通路,抑制心肌细胞胀亡和凋亡,从而减轻大鼠离体心脏缺血再灌注损伤.
关键词： 麻醉药 吸入 心肌再灌注损伤 细胞死亡 细胞外信号调节MAP激酶类 -
PI3K和ERK信号通路在吗啡预处理减轻心力衰竭大鼠离体心脏缺血再灌注损伤中的作用
目的 评价1-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路在吗啡预处理减轻心力衰竭大鼠离体心脏缺血再灌注损伤中的作用.方法 雄性成年SD大鼠,体重200～230 g,尾静脉注射盐酸多柔比星2 mg/kg,1次/周,连续6周,制备大鼠慢性心力衰竭模型.第8周末将成功制备慢性心力衰竭模型的大鼠42只,采用随机数字表法分为7组(n=6):假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、吗啡预处理组(MP组)、ERK抑制剂PD98059+吗啡预处理组(PD+ MP组)、PI3K抑制剂渥曼青霉素+吗啡预处理组(WT+ MP组)、PD98059组(PD组)和渥曼青霉素组(WT组).采用Langendorff离体心脏灌注及结扎左冠状动脉前降支(LAD)法制备大鼠缺血再灌注损伤模型,缺血30min,再灌注120 min.S组只缝线,不结扎LAD,持续灌注K-H液195 min.I/R组先灌注K-H液45 min,再制备大鼠缺血再灌注损伤模型.MP组先灌注K-H液15 min,再灌注含1μmol/L吗啡的K-H液进行预处理,灌注5 min,再次灌注K-H液5min,共3个循环,然后制备心脏缺血再灌注损伤模型.PD+ MP组和WT+ MP组于吗啡预处理前10 min,分别用含ERK抑制剂PD98059(10 μmol/L)和PI3K抑制剂渥曼青霉素(100 nmol/L)的K-H液进行灌注,持续至缺血5 min.PD组和WT组于缺血前40 min持续至缺血5 min分别灌注含PD98059和渥曼青霉素的K-H液.各组分别于心脏稳定灌注15 min、再灌注5和10 min时,收集冠脉流出液,采用化学比色法检测LDH活性.再灌注120 rin时,取下大鼠心脏,测量缺血危险区体积(AAR)、梗死区体积(IS)及IS/AAR比值.结果 与S组比较,I/R组再灌注5和10min时LDH活性升高,IS和IS/AAR均增加(P＜0.05),AAR差异无统计学意义(P＞0.05);与I/R组比较,MP组再灌注5min时LDH活性降低,IS和IS/AAR减小(P＜0.05),AAR差异无统计学意义,WT组和PD组LDH活性、IS、AAR和IS/AAR差异无统计学意义(P＞0.05);与MP组比较,PD+ MP组再灌注5和10 min时LDH活性升高,IS和IS/AAR减小(P＜0.05),WT+ MP组LDH活性、IS、AAR和IS/AAR差异无统计学意义(P＞0.05).结论 ERK信号通路的激活参与了吗啡预处理减轻心力衰竭大鼠离体心脏缺血再灌注损伤,而PI3K信号通路无此作用.
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戊乙奎醚预处理对脓毒症小鼠肺损伤时MAPK信号转导通路的影响
目的 探讨戊乙奎醚(PHC)预处理对脓毒症小鼠肺损伤时丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路的影响.方法 健康雌性昆明小鼠105只,体重20～25 g,随机分为3组(n=35):假手术组(S组)、脓毒症(CLP)组和戊乙奎醚(PHC)组.采用盲肠结扎并穿孔法制备脓毒症模型.PHC组于造模前1 h腹腔注射戊乙奎醚0.45 mg/kg,s组和CLP组于造模前1 h注射等容量生理盐水.于造模后即刻测定肺微血管通透性;造模后12 h时进行动脉血气分析,观察肺组织病理结果,测定肺组织丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和磷酸化的p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、细胞外信号调节激酶(ERK1/ERK2)和c-jun氨基末端蛋白激酶(JNK)表达.结果 与S组比较,CLP组PaO2、PaO2/FiO2和pH值降低,肺微血管通透性和肺组织MDA含量升高,SOD活性降低,磷酸化的p38MAPK、ERK1/ERK2和JNK表达上调(P<0.05或0.01);与CLP组比较,PHC组PaO2、PaO2/FiO2和pH值升高,肺微血管通透性和肺组织MDA含量降低,SOD活性升高,磷酸化的p38MAPK和ERK1/ERK2表达下调(P<0.05或0.01).结论 戊乙奎醚预处理可通过抑制MAPK信号转导通路(p38MAPK和ERK1/ERK2)的激活,从而减轻脓毒症小鼠肺损伤.
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ERK1∕2信号通路和STAT3信号通路在大鼠二氮嗪后处理心肌保护作用中的关系
目的：评价细胞外信号调节激酶1∕2（ ERK1∕2）信号通路和信号传导与转录激活因子3（ STAT3）信号通路在大鼠二氮嗪后处理心肌保护作用中的关系。方法健康成年雄性SD大鼠60只，体重240～260 g，3月龄，采用随机数字表法，将其分为5组（ n＝12）：假手术组（ SH组）、缺血再灌注组（ I∕R组）、二氮嗪后处理组（ D组）、ERK1∕2抑制剂U0126组（ U组）和STAT3抑制剂Stattic组（ St组）。采用阻断冠状动脉前降支30 min，再灌注120 min的方法制备心肌缺血再灌注损伤模型。 I∕R组和D组分别于再灌注即刻经股静脉注射0．4％二甲基亚砜1 ml和二氮嗪7 mg∕kg（溶于1 ml 0．4％二甲基亚砜）， U组和St组于再灌注前10 min时经股静脉分别注射U0126100μg∕kg和Stattic 500μg∕kg，余处理同D组。于再灌注120 min时处死大鼠，取左心室心肌组织，测定心肌梗死体积和心肌细胞凋亡指数，采用RT?PCR法检测心肌组织ERK1 mRNA、ERK2 mRNA和STAT3 mRNA的表达水平，采用Western blot法检测心肌组织磷酸化ERK1∕2（ p?ERK1∕2）和磷酸化STAT3（ p?STAT3）的表达水平。结果与S组比较，I∕R组心肌梗死体积和细胞凋亡指数升高，心肌组织ERK1 mRNA、ERK2 mRNA、STAT3 mRNA和p?ERK1∕2、p?STAT3的表达下调（P＜0．05）。与I∕R组比较，D组心肌梗死体积和细胞凋亡指数降低，心肌组织ERK1 mRNA、ERK2 mRNA、STAT3 mRNA和p?ERK1∕2、p?STAT3的表达上调（ P＜0．05）。与D组比较，U组和S组心肌梗死体积和细胞凋亡指数升高，U组心肌组织ERK1 mRNA、ERK2 mRNA、STAT3 mRNA和p?ERK1∕2、p?STAT3的表达下调，S组STAT3 mRNA和p?STAT3的表达下调（P＜0．05），ERK1 mRNA、ERK2 mRNA和p?ERK1∕2的表达差异无统计学意义（P＞0．05）。结论在二氮嗪后处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用机制中，STAT3信号通路处于ERK1∕2信号通路的下游。
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ERK信号通路在吗啡或舒芬太尼抑制心肌缺血再灌注诱发大鼠心律失常中的作用:与Cx43表达的关系
目的 评价细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路在吗啡或舒芬太尼抑制大鼠心肌缺血再灌注诱发大鼠心律失常中的作用及其与Cx43表达的关系.方法 SPF级健康成年雄性SD大鼠48只,体重200～ 300 g.采用随机数字表法分为6组(n=8):假手术组(S组)、心肌缺血再灌注组(I/R组)、吗啡组(M组)、舒芬太尼组(Suf组)、吗啡+ERK抑制剂PD98059组(MP组)和舒芬太尼+PD98059组(SP组).采用结扎左冠状动脉前降支30 min恢复灌注的方法制备大鼠心肌缺血再灌注损伤模型.M组和Suf组缺血前即刻分别股静脉输注吗啡0.3 mg/kg或舒芬太尼3μg/kg,输注5 min,停止5 min,重复3次.MP组和SP组缺血前10 min静脉注射PD98059 10 mg/kg.于缺血30 min和再灌注30 min内记录室性心律失常发生情况并评分(AS).于再灌注120 min时处死大鼠取心肌,采用Western blot法检测心肌总Cx43(t-Cx43)、磷酸化Cx43(p-Cx43)及磷酸化ERK(p-ERK)的表达.结果 与S组比较,其余组AS升高,心肌p-Cx43下调,I/R组、SP组和MP组心肌t-Cx43和p-ERK的表达下调(P＜0.05);与I/R组比较,M组和Suf组AS降低,心肌t-Cx43、p-Cx43和p-ERK的表达上调(P＜0.05);与M组和Suf组比较,SP组和MP组AS升高,心肌t-Cx43和p-Cx43的表达下调(P＜0.05).结论 吗啡或舒芬太尼抑制大鼠心肌缺血再灌注损伤诱发大鼠心律失常的机制与其激活ERK信号通路后上调心肌Cx43表达有关.
