《人干细胞培养》(中译本)出版

人胚胎生殖干细胞的体外培养研究

本实验在综合分析目前国内外人胚胎生殖细胞(EG细胞)的培养条件后,采用组织块培养法,以同源胚胎的成纤维细胞为饲养层,在不添加任何细胞因子的情况下,对人EG细胞进行体外培养.该培养体系确保了在培养过程中人EG细胞有充足的来源,避免了胰酶以及一些机械操作对原始生殖细胞(PGCs)的损伤,同时也避免了由于用小鼠成纤维细胞做饲养层,而对培养体系造成的异种蛋白的污染.这是关于建立人EG细胞合适的体外培养体系的一次有意义的探索.

生物材料在干细胞移植治疗心肌梗死中的应用

生物材料是一类具有特殊功能的、用于机体组织修复和再生的材料.目前,生物材料在干细胞培养和移植方面受到广泛关注.生物材料既可作为干细胞的支架,也可以作为移植干细胞临时的黏附基质.一种理想的生物材料应当模拟细胞外基质,它必须能够维持细胞的生长,并有利于细胞的存活和分化,在新生组织形成过程中逐渐降解.

低氧对组织工程研究中间充质干细胞培养的影响

是维持生命必不可少的物质.人体正常组织和组织间隙中的氧分压为24-66 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),即3%～9%(体积分数,下同)[1],骨髓腔内的氧分压为8-56 mm Hg(1%-7%)[2].而目前细胞体外培养环境的氧分压通常为159 mm Hg,即氧浓度约为21%.Papandreou等[3]认为外界氧供和细胞的氧需应维持平衡,从而保证细胞的良好生长环境.Morrison等[4]认为在绝大多数的组织培养中,3%～6%的氧浓度更接近生理学浓度范围.

成年干细胞培养太久有癌变危险

大鼠嗅上皮神经干细胞培养及鉴定

胚胎及成年神经干细胞(neural stem cell, NSC)的成功培养为中枢神经系统疾病治疗带来了新的策略.从颅外组织如嗅上皮获取NSC可能是自体NSC移植的理想途径.研究表明,成年人及小鼠的嗅上皮中含有NSC[1-3].本研究观察新生及成年大鼠嗅上皮NSC的增殖及分化特性,为嗅上皮NSC的进一步研究提供参考.

角膜缘干细胞基础研究和临床应用进展

随着角膜缘干细胞研究的深入,对由角膜缘部受损、功能不良或角膜缘微环境异常等造成的角膜病变有了更深的认识.本文就角膜缘干细胞的基础研究进展(尤其是标志物及微环境方面)及角膜缘干细胞缺损治疗方法(自体、异体角膜缘干细胞移植,培养的角膜缘干细胞和口腔黏膜上皮细胞植片移植等)的临床效果和存在问题进行综述.

应用粘膜上皮干细胞培养进行眼表重建

牙周内源性再生的策略与展望

牙周病等多种原因造成的牙周支持结构( periodontal supporting apparatus)破坏或丧失是成年人失牙的首要原因,牙周病的治疗和牙周缺损的修复是学者们共同关注的课题,目前还没有哪一种临床治疗方法可以实现真正意义上的牙周组织生理性和功能性再生[1-3].自2004年Seo等[4]从人牙周膜组织中成功分离出牙周膜干细胞( periodontal ligament stem cells,PDLSC)以来,利用干细胞移植技术修复牙周组织缺损已成为牙周组织再生研究的主要策略[3].值得注意的是,无论是动物体内的临床前期研究,还是牙周病患者的临床病例报告,干细胞移植均取得了令人振奋的结果[5-10].然而,干细胞移植需要高标准的体外细胞培养条件、严格的调控措施和复杂的操作规程,其临床转化面临着巨大的人力、物力与财力的挑战,特别在一些非致死性疾病(如牙周组织缺损)的治疗上,"取,,与"舍"仍然存在争议[11].随着干细胞生物学研究的不断深入,利用干细胞在体内的运动和迁移机制,诱导患者自身干细胞募集和"归巢"( cell homing)促进牙周组织自我修复再生有望解决体外干细胞培养与移植面临的"转化困难",具有广阔的研究前景和临床应用空间[12-14].

绿色荧光蛋白小鼠骨髓间充质干细胞培养及其示踪的可行性

目的 观察并比较两种小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法及选取GFP-BMSCs作为移植实验示踪的种子细胞可行性.方法 通过骨片培养法(A法)和全骨髓贴壁法(B法)培养扩增小鼠骨髓间充质干细胞,并参照不同的培养方法优化其换液方式；观察两种培养方法原代及传代GFP小鼠骨髓MSCs形态变化；取第3代细胞进行生长曲线测定及多向分化功能检测；观察GFP小鼠骨髓MSC经多次传代及诱导分化后绿色荧光的稳定性.结果 1)A法原代培养可见贴壁细胞增殖形成大小不等的克隆集落,并向周围进一步扩展、融合,而B法在原代培养时由于混杂较多血液系统细胞,传代至3、4代即可获得较纯的BMSCs；2)观察其生长曲线,A法细胞扩增速度快,纯度高,B法细胞由于受杂细胞的影响,扩增难度大；3)BMSCs可被诱导成脂肪细胞,油红O染色可见红色脂肪颗粒；在成骨分化过程中可见骨结节结构形成；4)GFP-BMSCs传代后生物学特性稳定,传代至5代及诱导分化后其GFP表达仍为强阳性.结论 与传统全骨髓贴壁法相比,骨片培养法可在原代或1代就获得高浓度的足量干细胞,GFP-BMSCs经多次传代后荧光不减退,可作为体内细胞示踪.

日用胎盘间叶干细胞培养出骨细胞和神经细胞等

药用植物干细胞培养技术及其应用

着重介绍了药用植物干细胞培养技术的建立方法及其在长期培养、悬浮培养、扩大培养及低温储藏方面较传统植物细胞培养技术的优势,同时综述了药用植物干细胞培养技术在生产天然产物,开发药品、功能性食品和化妆品,建立主细胞库及基础研究等方面的应用,并对其未来的发展方向进行了展望.

真性红细胞增多症患者血清红细胞生成素水平的变化及其临床意义

我们采用放射免疫法测定55例真性红细胞增多症(PV)患者及8名健康对照的血清EPO水平,并分析PV患者血清EPO水平与临床表现、血常规结果和干细胞培养结果等多项指标的相关性,探讨PV发病机制及血清EPO水平检测的临床意义.

秃头今昔

男人害怕秃顶,这也是人类历史上的老问题.近一百多年来,医学界一次次地为秃头提供全新的冶疗手段:从移植毛发到干细胞培养头发.追溯历史应该说,社会上对秃顶的态度在不同历史时期是有所不同的.在古希腊、古罗马年代,秃顶被社会公认为上帝的惩罚.

人鼻咽癌CD133+干细胞的生物学特性及意义人鼻咽癌CD133+干细胞的生物学特性及意义

背景:有研究表明肿瘤细胞株中存在肿瘤干细胞,是肿瘤复发、转移的根源,但人鼻咽癌细胞株CNE-2中肿瘤干细胞的表达及生物学特性至今少有报道.目的:观察人鼻咽癌CD133+干细胞生物学特性及意义.方法:采用流式细胞仪检测人鼻咽癌细胞株CNE-2中CD133的表达情况.免疫磁珠分选技术获得人鼻咽癌CD133+干细胞,分别采用无血清培养法、CCK-8法、平板克隆形成试验及裸鼠体内成瘤实验检测CD133+干细胞的体外增殖及体内成瘤能力,并将其与CD133-及未分选鼻咽癌细胞进行比较,以了解CD133+干细胞的生物学特性.结果与结论:免疫磁珠富集的CD133+细胞在无血清培养基中呈悬浮生长,并可以形成肿瘤干细胞球.CD133+细胞与CD133-细胞比较具有较高的克隆形成能力(P < 0.01);CD133+细胞在裸鼠体内的成瘤率高于CD133-细胞(P < 0.05).结果证实,鼻咽癌CD133+干细胞能在体外分离培养,形成干细胞球,增殖能力强,在裸鼠体内具有极强的成瘤能力.

利用自体血清培养人外周血内皮祖细胞

背景:传统方法培养人外周血来源内皮祖细胞操作复杂,费用大,细胞获得率较低.目的:利用自体血清培养人外周血来源内皮祖细胞,并鉴定其功能.方法:采用密度梯度离心法从人外周血分离得到单个核细胞,体外培养分化为内皮祖细胞.按培养基条件不同分为EGM-2MV组、添加自体血清组(M199+体积分数10%自体血清+胰岛素样生长因子)、添加胎牛血清组(M199+体积分数10%胎牛血清+血管内皮细胞生长因子+碱性成纤维细胞生长因子+胰岛素样生长因子+表皮生长因子).观察内皮祖细胞增殖、迁移能力;采用细胞形态观察、双荧光染色法及流式细胞仪等技术对培养的内皮祖细胞进行鉴定.结果与结论:培养第7天,EBM-2MV组和添加自体血清组细胞增殖能力和迁移率都优于添加胎牛血清组(P < 0.05).每组细胞经结合Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素双色荧光染色鉴定后双阳性率> 80%,免疫细胞化学检测显示每组细胞CD133,CD34和KDR的表达均为阳性.证实在M199培养液中添加自体血清是一种简单、高效的培养内皮祖细胞方法.

兔下颌骨来源骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学特性

背景:以往研究表明骨髓间充质干细胞的获取来源主要是股骨或髂骨,但下颌骨来源骨髓间充质干细胞的研究至今少有报道.目的:观察兔下颌骨来源的骨髓间充质干细胞体外分离、培养及其生物学特性.方法:体外分离培养兔下颌骨骨髓间充质干细胞,取第2或3代检测.MTT法检测细胞增殖,克隆形成试验检测细胞的克隆形成率变化,并对其进行成骨和成脂肪诱导分化.结果与结论:MTT法检测细胞增殖,细胞生长曲线显示下颌骨骨髓间充质干细胞经历潜伏期、对数生长期和平台期.细胞克隆形成实验显示,细胞呈成纤维集落形成单位外观.茜素红、油红O染色结果显示,成骨诱导、成脂诱导后形成钙结节及脂滴.结果证实,兔下颌骨分离出的骨髓间充质干细胞有强大的自我复制及增殖能力,具有多向诱导分化的潜能.

山羊神经干细胞的分离培养及体外诱导分化

背景：文献报道不同种类的神经调控因子及神经胶质细胞对神经干细胞分化成熟具有不同的作用，但大动物的神经干细胞培养报道则相对较少。目的：探究山羊神经干细胞的培养条件及体外诱导分化结果。方法：取幼羊脑组织分离神经干细胞后于神经干细胞全培养液中悬浮培养，后期行抗-巢蛋白一抗免疫组织化学染色鉴定，同时取坐骨神经分离培养许旺细胞；以血清诱导干细胞体外诱导分化后行抗-S100一抗、抗-胶质纤维酸性蛋白一抗、抗-MAP2一抗染色分别标记许旺细胞及神经胶质细胞，以未添加一抗做对照，计算图像灰度值与对照组进行统计学比较。结果与结论：成功分离培养抗-巢蛋白染色阳性神经球及抗-S100染色阳性许旺细胞，后期神经干细胞体外诱导分化得抗-胶质纤维酸性蛋白、抗-MAP2染色阳性细胞，其免疫组织化学染色灰度值显著高于对照组；分化产物抗-S100染色为阴性，其免疫组织化学染色灰度值显著低于对照组。结果表明山羊神经干细胞可经体外诱导分化为神经元及星形胶质细胞，未发现神经干细胞诱导分化为许旺细胞。

改良小鼠骨髓间充质干细胞培养方法及长效荧光标记的可行性

背景:小鼠骨髓间充质干细胞培养不同于人及大鼠,培养扩展难度高,传代后干细胞活性保持时间短;又鉴于干细胞本身特点,使现有干细胞示踪方法作用时间短,这些因素均影响小鼠骨髓间充质干细胞的实验研究.目的:观察改良小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法及长效荧光标记干细胞的可行性.设计、时间及地点:观察性实验,于2008-06/12在解放军军事医学科学院完成.材料:C57BU6小鼠4～6周龄.体质量20g,雌雄不拘.方法:通过贴壁筛选和Percoll分离法,优化干细胞培养液血清和换液方式,培养扩增小鼠骨髓间充质干细胞.参照以往人和猕猴间充质干细胞培养经验,对小鼠间充质干细胞培养血清选择Hyclone的顶级胎牛血清,控制血清为培养液的10%.用LG-DMEM培养液冲出骨髓细胞后,滤去骨渣和小肌肉碎块.然后加在相对密度1.082的percoll分离液上,以1.5×10~6/cm~2浓度接种75 cm~2培养瓶.对第2代骨髓间充质干细胞进行长效CM-Dil标记.主要观察指标:原代及传代小鼠骨髓间充质干细胞形态变化;对第2代小鼠骨髓间充质干细胞表面抗原,CD105,CD44,CD25,CD34进行流式细胞仪检测,评价改良方法获取干细胞纯度;通过成脂成骨分化,鉴定小鼠骨髓间充质干细胞的活性;观察多次传代后荧光细胞强度.结果:①小鼠骨髓间充质干细胞原代培养在接种48 h后可见贴壁细胞,培养第7天细胞多数伸展呈梭形,也有三角形,多角形和扁平形.3代后形态趋于统一,融合状态时细胞排列呈束状、漩涡状或放射状.②骨髓间充质干细胞特异性抗原高表达CD105,CD44;造血系抗原低表达CD34和CD45.③骨髓间充质干细胞向成骨分化过程中,纺锤形的突起逐渐消失,胞体增大,培养10 d后,部分细胞呈聚集生长,随细胞生长密度的增长形成多层的结节结构.在脂肪诱导体系中,可见细胞由成纤维样逐渐缩短,9 d后胞浆中出现脂肪滴,油红O染色可见红色的脂肪颗粒.④首次标记,荧光显微镜观察可见长效CM-Dil标记在细胞膜发橙色光,标记率在80%以上.流式细胞仪检测CM-Dil细胞标记率可到47%以上,第4代培养细胞仍可见较多标记细胞.结论:改良方法早期第2代就可获得高浓度干细胞,同时长效CM-Dil标记方法稳定,标记率高,可作体内细胞示踪.

角膜缘干细胞培养的载体研究概况及进展

各种眼表外伤及疾病引起的角膜缘干细胞(Limbal Stem Cell,LSC)缺乏常常导致角膜新生血管侵入、角膜混浊甚至视力丧失,近年来利用LSC移植治疗此类疾病已成为研究热点,但干细胞自体移植对于双眼损伤患者不适用,对单眼受损患者,因取材健眼组织可能造成健眼损伤,而应用异体移植除存在上述问题外,还可能发生免疫排斥反应.组织工程技术的兴起为解决眼表重建带来了希望,体外培养的LSC是治疗临床棘手的双眼疾病患者的重要手段,而应用理想的载体作为细胞外基质(ECM)来种植种子细胞,形成近似体内的正常结构是组织工程化角膜构建成功的关键.本文就目前组织工程技术眼表重建在载体选择方面的研究及LSC培养的新进展作一综述.