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细胞凝集态在钙结节形成过程中的显微结构观察
目的 观察兔骨髓基质细胞来源的细胞凝集态在体外钙结节形成过程的形态变化.方法 通过全骨髓培养方法分离培养兔骨髓基质细胞,并在培养瓶中进行扩增,使用成骨诱导液作为培养基;再通过四环素标记、碱性磷酸酶染色、茜素红染色、扫描电镜及透射电镜方法,研究细胞凝集态在钙结节形成过程中的形态变化.结果荧光显微镜下观察可见,四环素标记的钙结节发出金黄色荧光;光镜下见结节中的细胞凝集态与周边铺壁细胞相比呈碱性磷酸酶及茜素红的强阳性反应;扫描电镜下见结节中的凝集态细胞均呈球状生长并分泌基质;透射电镜下见细胞中基质小泡丰富.结论骨髓来源的基质细胞在体外形成的钙结节需要三维空间状态下细胞的高度凝集.
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铁离子对人成骨细胞(hFOB1.19)生物活性影响
目的 探讨铁离子对成骨细胞株(hFOB1.19)生物活性,包括碱性磷酸酶活性(alkaline phosphatase activity,APA)、细胞凋亡、钙结节、Ⅰ型胶原(type 1 collagen,COL 1)和骨钙素(osteocalcin,OC)的影响.方法 成骨细胞(hFOB1.19)于5% CO2 34 ℃培养箱内培养,将不同浓度枸橼酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)50、100、200 μmol/L和去铁胺(deferoxamine,DFO)5、10、20 μmol/L分别加入细胞培养基中,MTT法检测成骨细胞增生活性;碱性磷酸酶活性试剂盒检测碱性磷酸酶活性;流式细胞仪检测细胞凋亡;Von kossa染色法行钙结节染色;RT-PCR和Western blotting法分别检测 COL1和骨钙素(bone gla protein,BGP)的基因及蛋白表达.结果 (1)48 h后增生活性:FAC组细胞增生活性随FAC干预浓度的增加呈剂量依赖性降低(P<0.05),DFO组在5 μmol/L浓度组时促进成骨细胞增生,在10、20 μmol/L浓度组时抑制成骨细胞增生.(2)10 d时碱性磷酸酶活性:FAC组碱性磷酸酶活性随FAC干预浓度的增加而降低,DFO组碱性磷酸酶活性随DFO干预浓度的增加而升高(P<0.05);(3)48 h时凋亡:FAC组细胞凋亡率呈剂量依赖性升高(P<0.05),DFO组在5、10 μmol/L浓度时抑制细胞凋亡(P<0.05),在20 μmol/L则促进成骨细胞凋亡(P<0.05);(4)21 d时钙结节染色:FAC组随铁离子干预浓度增加,成骨细胞矿化面积、钙结节形成数量均减少,DFO组在5、10 μmol/L浓度时促进成骨细胞矿化功能,而20 μmol/L浓度时对成骨细胞矿化有抑制效应;(5)3 d时基因及蛋白表达:FAC组COL1、BGP基因和蛋白的表达呈剂量依赖性下调(P<0.05);DFO组COLⅠ、BGP基因的表达呈剂量依赖性上调(P<0.05),DFO在5、10 μmol/L浓度时促进COL1、BGP蛋白表达,在20 μmol/L浓度时抑制COL1、BGP蛋白表达.结论 不同浓度枸橼酸铁铵均抑制成骨细胞功能活性,提示高铁环境不利于成骨细胞的成骨功能.低铁环境对成骨细胞有双重效应,低剂量去铁胺对成骨细胞活性有促进作用,而高剂量去铁胺则对成骨细胞活性有抑制效应.
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叶绿素铜钠对免疫介导再生障碍性贫血小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化研究
目的 探讨叶绿素铜钠对免疫介导再生障碍性贫血小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCS)向成骨细胞分化的能力.方法 建立免疫介导再障小鼠模型,随机分为正常对照(N)、模型对照(M)、叶绿素铜钠小剂量(X)、叶绿素铜钠中剂量(Z)、叶绿素铜钠高剂量(G)、环孢菌素对照组(C8)每组6只,15天后观察血常规,并取其骨髓行MSCS培养,比较F0MSCS、F1MSCS、F2MSCS、成骨细胞的形态学变化,及钙结节计数.结果 Z组小鼠的外周血白细胞数明显大于M组,M组小鼠的外周血红蛋白和血小板数明显小于其余5组.F2MSCS显微镜见各组长梭形的MSCS细胞比F0MSCS、F1 MSCS的更加铺开而饱满.F3MSCS诱导后,各组均可以见到成骨细胞,M组钙结节计数明显小于其余5组.结论 叶绿素铜钠能明显促进免疫介导再障小鼠MSCS向成骨细胞分化的能力.
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骨形态发生蛋白7腺病毒基因转染对骨髓基质干细胞生物学功能的影响
背景：基因转染技术正积极地应用于组织再生治疗之中，研究表明骨形态发生蛋白7具有骨诱导特性，可以有效促进成骨细胞的发育以及新骨的形成。目的：探讨骨形态发生蛋白7腺病毒基因转染对骨髓基质干细胞生物学功能的影响。方法：分离、培养羊骨髓基质干细胞，利用重组骨形态发生蛋白7腺病毒(adenovirus bone morphogenetic protein 7，Adeno-BMP7)对第2代骨髓基质干细胞进行基因转染，透射电镜观察转染后细胞超微结构。流式细胞仪检测转染后的细胞周期，Western blot检测骨形态发生蛋白7的表达，Von Kossa染色观察钙结节形态情况。取转染后第3天及相应未转染的骨髓基质干细胞制备珊瑚-细胞复合物，于裸鼠脊柱两侧背部皮下注射4周和8周后进行大体观察和组织学检测。结果与结论：体外细胞超微结构观察可见Adeno-BMP7基因转染骨髓基质干细胞存在活跃的物质合成代谢；流式细胞仪检测发现转染不会对骨髓基质干细胞的细胞周期产生明显影响；Western blot检测转染后的骨髓基质干细胞存在骨形态发生蛋白7蛋白的表达；Von Kossa染色可见转染Adeno-BMP7后的骨髓基质干细胞形成较大的钙结节。经裸鼠皮下回植实验发现，Adeno-BMP7转染后骨髓基质干细胞的成骨能力和成骨质量明显提高。以上结果表明经Adeno-BMP7转染可以有效促进骨髓基质干细胞成骨分化。
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17β-雌二醇联合淫羊藿苷促进SD大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化
背景:以往研究表明,17β-雌二醇、淫羊藿苷均能够促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化,二者联合应用的报道较少.目的:观察17β-雌二醇联合淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞向骨细胞分化的影响.方法:运用全骨髓贴壁分离法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪进行骨髓间充质干细胞表面标志物(CD29,CD45,CD90)的鉴定.将培养细胞分为对照组、17β-雌二醇组、淫羊藿苷组、联合诱导组,进行相应成骨诱导.各组细胞经成骨诱导7,14,21 d后分别进行碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原、骨钙素浓度检测及茜素红染色观察钙结节形成量.结果与结论:①17β-雌二醇联合淫羊藿苷作用下细胞成骨能力均增强;②成骨诱导7 d后,各组碱性磷酸酶活性均表达,联合诱导组>17β-雌二醇组>淫羊藿苷组>对照组;③成骨诱导14 d后,各组Ⅰ型胶原活性均表达,联合诱导组>17β-雌二醇组=淫羊藿苷组>对照组;④诱导21 d后,各组骨钙素均表达,联合诱导组>17β-雌二醇组>淫羊藿苷组>对照组;⑤茜素红染色镜下钙结节数量:联合诱导组>17β-雌二醇组=淫羊藿苷组>对照组;⑥结果表明,17β-雌二醇联合淫羊藿苷能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向骨细胞方向分化,且具有协同作用.
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荨麻提取物诱导骨膜细胞增殖分化:构建组织工程骨及超微结构的变化
背景:荨麻作为一种传统的中草药,目前认为其主要的药理作用是抗炎、抗风湿等作用,其对骨膜细胞的效果的相关研究较少.目的:探讨荨麻诱导人骨膜细胞增殖及分化特性,并诱导其体外构骨,为荨麻运用于骨组织工程提供理论依据.方法:实验取材于成人锁骨.体外组织块培养法获得骨膜原代细胞,恒温培养扩增后,取第3代骨膜细胞种植于细胞培养板中.实验分为3组,实验组分别加入10-6,10-5及10-4g/L荨麻提取物,阳性对照组加入50 μg/L骨形态发生蛋白7,对照组仅加入纯净水.分别在第1,4,7和10天MTT法检测骨膜细胞增殖情况,碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色检测碱性磷酸酶和钙结节的表达.分别将10-4g/L荨麻提取物及骨形态发生蛋白7加入到含有聚己内酯三维支架中和骨膜细胞复合培养构建组织工程骨,培养24 d,电镜下观察不同组细胞形态学情况.结果与结论:①MTT 结果显示各时间点荨麻提取物不同浓度组和阳性对照组的吸光度值均显著高于对照组(P < 0.05),荨麻提取物不同浓度组的各时间点吸光度值相比,10-4g/L组>10-5g/L组>10-6g/L组(P < 0.05),表明10-4g/L为佳浓度;②实验组各时间点碱性磷酸酶和钙结节的染色阳性率与阳性对照组相比,差异无显著性意义(P > 0.05),但2组各时间点表达量均显著高于对照组(P < 0.05);③电镜下观察实验组细胞膜表面有大量微绒毛状突起,线粒体基质致密有少量嵴,细胞增殖和分化活跃.且阳性对照组和荨麻组细胞内线粒体数量显著多于对照组(P < 0.05);④结果提示,荨麻能促进骨膜细胞增殖,同时能诱导骨膜细胞分化为成骨细胞,可作为组织工程中的诱导剂.另外,荨麻可诱导骨膜细胞在聚己内酯三维支架中扩增并构建组织工程骨.
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骨碎补总黄酮促进骨膜细胞增殖及对兔骨不连的治疗作用
背景:骨碎补总黄酮是一种传统中药,目前认为其主要具有预防骨质疏松、调节血脂等功效.骨碎补总黄酮对骨膜细胞的相关作用尚无相关研究.目的:探讨骨碎补总黄酮对兔骨膜细胞增殖的影响,进一步研究其对骨膜细胞治疗兔骨不连的促进作用.方法:①选取第3代兔骨膜细胞,分别用10-5,10-6,10-7g/L骨碎补总黄酮及10-8 mol/L雌二醇培养,于第1,2,4,6天检测骨膜细胞增殖情况;②选取第3代兔骨膜细胞,分别用10-5 g/L骨碎补总黄酮、10-8 mol/L雌二醇、纯净水培养,于第1,5,9,13天检测骨膜细胞中碱性磷酸酶的活性,于第5,10,15,20天用Von Kossa法检测骨膜细胞中钙结节数量;③选取第3代兔骨膜细胞,分别用10-5 g/L骨碎补总黄酮、10-5 g/L骨碎补总黄酮+1μmol/L雌激素受体拮抗剂ICI182780、PBS培养,于第1,2,4,6天检测骨膜细胞增殖情况;④建立兔桡骨骨不连模型,将10-5 g骨碎补总黄酮和1×103骨膜细胞注入骨不连处,观察其对骨不连愈合的影响.结果与结论:①各组骨膜细胞吸光度值均随时间增加而增加,以10-5 g/L骨碎补总黄酮组和雌二醇组明显,并于第6天达大值;②10-5 g/L骨碎补总黄酮组和雌二醇组骨膜细胞碱性磷酸酶活性均高于对照组(P<0.05),两组碱性磷酸酶活性比较差异无显著性意义(P>0.05);③骨碎补总黄酮诱导骨膜细胞的增殖作用被10-8 mol/L雌激素受体拮抗剂ICI182780完全阻断;拮抗剂组与对照组相比,骨膜细胞吸光度值差异无显著性意义(P>0.05);④骨碎补总黄酮和骨膜细胞联合治疗能促进骨愈合;⑤结果表明,骨碎补总黄酮能促进骨膜细胞增殖和成骨分化,其促进细胞增殖的作用与雌激素受体有关;骨碎补总黄酮能在体内和骨膜细胞一起共同治愈骨不连.
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淫羊藿苷体外诱导骨膜细胞增殖及分化
背景:淫羊藿苷用于促进细胞增殖有广阔的运用前景.骨膜细胞有特定的分化方向不确定性,同时也容易被诱导增殖,常见的诱导物质包括超声、氧等物理方法或者骨形态发生蛋白7等诱导因子,目前骨组织工程的研究已经有骨膜细胞运用的相关报道.但是淫羊藿苷诱导骨膜细胞增殖相关的报道少见,淫羊藿苷诱导骨膜细胞后的分化方向目前尚未明确.目的:探讨淫羊藿苷对人骨膜细胞增殖及分化的影响,为淫羊藿苷运用于骨组织工程提供理论依据.方法:手术获得人骨膜,体外分离获得原代细胞,培养扩增后,种植培养骨膜细胞于24孔板中.分别用0.001, 0.01及0.1 mg/L的淫羊藿苷及50 μg/L的骨形态发生蛋白7诱导骨膜细胞增殖,MTT法检测各组骨膜细胞的吸光度值.于1,3,5和7 d检测骨膜细胞碱性磷酸酶和钙结节的数量表达情况,RT-PCR法检测骨钙素、骨桥蛋白和Runx2的mRNA含量.结果与结论:①骨膜细胞在加入淫羊藿苷后增殖良好,不同质量浓度的淫羊藿苷组及阳性对照组均有促进骨膜细胞增殖的作用(P < 0.05);②加入了淫羊藿苷的骨膜细胞与对照组相比能产生更多的碱性磷酸酶和钙结节(P <0.05);③0.1 mg/L的淫羊藿苷显著上调骨钙素、骨桥蛋白和Runx2 mRNA的表达(P < 0.01);④结果表明,淫羊藿苷有促进骨膜细胞增殖和分化为成骨细胞的作用,可作为诱导剂用于骨组织工程中种子细胞的制备.
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树鼩脐带间充质干细胞分离、培养及成骨成脂分化的鉴定
背景:脐带间充质干细胞是组织工程研究中的理想种子细胞.目的:分离、培养及鉴定树鼩脐带间充质干细胞,建立标准化的树鼩脐带间充质干细胞株.方法:采用剖腹产分离树鼩脐带,用组织块贴壁法培养脐带间充质干细胞,用流式标记法检测脐带间充质干细胞表面标志,用成骨、成脂诱导培养基诱导脐带间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化.结果与结论:①细胞鉴定:培养的脐带间充质干细胞CD90和CD105的阳性表达率分别为99.9%和99.8%,造血干细胞标志物CD34的表达率为0.0%,内皮细胞标志物CD31的表达率为0.7%,符合脐带间充质干细胞表面标志特征.②细胞形态:诱导后的脐带间充质干细胞茜素红染色观察到钙结节,油红O染色观察到脂滴.③结果证实,实验成功分离培养了具备成骨成脂分化能力的树鼩脐带间充质干细胞.
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多孔钛的骨传导性及其孔隙结构对MC3T3-E1细胞早期分化的影响
目的 探讨多孔钛的骨传导性及其孔隙结构对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1早期分化的影响.方法 碳酸氢铵造孔剂结合粉末冶金法制备6组由不同平均孔隙率及不同平均孔径组合的多孔钛试样,即AⅠ(43.1±0.7)％和(154.8±11.9) μm AⅡ:(40.9±1.5)％和(295.6±8.5) μm AⅡ (44.3±1.1)％和(560.4±25.6) μm;BⅠ:(53.3±1.2)％和(191.6±3.7) μm; BⅡ.(51.7±2.7)％和(303.8±8.2) μm; BⅢ:(49.9±3.9)％和(583.1±21.7) μm,Ta2级商业致密纯钛作为对照组;每组3个试样.MC3T3-E1细胞接种于24孔板3h贴壁后置入多孔钛试样,培养3d和5d后激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察经FITC微丝蛋白荧光探针标记的细胞.MC3T3-E1细胞接种于已置入试样的24孔板,培养7d和14d后测定碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,评价细胞的早期分化能力;培养21d后茜素红染色观察细胞晚期矿化结节.结果 MC3T3-E1细胞贴壁后,5d可长人多孔钛孔内及表面.7d和14d多孔钛组ALP活性显著高于对照组(P＜0.05);其中BⅠ组在14d的ALP活性显著高于其它各组(P＜0.05).21d多孔钛试样表面及孔隙内均可见钙结节形成.结论 在本实验条件下,多孔钛具有一定的骨传导性;平均孔隙率为53.3％且平均孔径为191.6 μm的多孔钛利于MC3T3-E1细胞的早期分化.
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兔骨髓基质干细胞骨向诱导实验研究
目的:研究兔骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSC)的体外培养以及骨向诱导分化情况,进一步探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法:无菌条件下抽取兔的股骨骨髓,然后进行骨髓基质干细胞的分离和体外培养,并向成骨细胞定向诱导分化.结果:体外分离的骨髓基质细胞呈贴壁生长,改良MTT法测定显示骨髓基质细胞于第7.8天左右可达到增殖高峰；诱导后BMSC可向成骨细胞分化,细胞呈成骨细胞形态为梭形和多角形并可形成钙化结节.改良钙钴染色法检测诱导细胞碱性磷酸活性呈强阳性.扫描电镜观察细胞呈较典型的成骨细胞状态,并可见钙盐沉积.结论:骨髓基质细胞具有来源充足,取材方便,创伤小无明显并发症.骨髓基质干细胞分化增殖能力较强,成骨能力确定.所以采用骨髓基质细胞作为种子细胞构建组织工程骨有比较可靠的依据.
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rhBMP-2及其纳米微球缓释系统对成骨细胞钙结节影响的实验研究
目的:观察rhBMP-2聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微球缓释系统对成骨细胞钙结节的影响.方法:培养诱导成骨细胞形成钙结节,并对其行特异性染色;在rhBMP-2纳米微球对钙结节作用后,采用扫描电镜观察其表面形态的改变,采用能谱仪分析比较其组成成分的改变.结果:rhBMP-2纳米微球能明显促进钙结节形成,且rhBMP-2纳米微球作用后钙结节中钙磷含量显著高于单纯rhBMP-2组.结论:rhBMP-2纳米微球缓释系统促进成骨的作用优于单纯rhBMP-2.
关键词： 重组人骨形成蛋白-2 聚氰基丙烯酸正丁酯 纳米微球 骨髓间充质干细胞 钙结节
